繊維状タンパク質をストレッチし、測定する新しい重力分光器の使用を実証
2011年3月19日
これは、目的、操作、そして斬新な重力の分光計からの代表的な結果を示すステップバイステップガイドです。
重力装置は、エピマウント、一般的な光学顕微鏡、デジタルカメラ、およびコンピュータで構成されています。これを用いて単一分子の酸解析を行います。力平衡を記録するか、あるいは滴下によって段階的な力を加えることができます。
まず、この種のプロセスが実施できるように、ガラスマイクロを用意する必要があります。使用する豆を約10 milligrams量り取るため、通常は2Kを準備します。ここでは、3 triologyに使用する5 millilitersを用意しています。
ここにターミナルPut Oneを用意します。トランスファーを用いて十分に混合し、混合液2 mLをビーズケーキの上に転移させます。ビーズケーキを2分間放置した後、2分間十分にボルテックスします。
下層が濡れた2つを吸収しました。二重蒸留水中に1つのプリンを溶解させます。pH 6でカップリングさせます。
各ビーズにカップリングバッファーを5 mL加えます。このカップリングにより、ビーズが結合できるようになります。その後、抗体を加えて再び結合させ、1分間ボルテックスします。5分間遠心分離し、さらにフリーザーで処理します。その後、カップリングバッファーを用いて、濃度を5%まで希釈します。
次に、この溶液を2 mL加え、これによりTERをボルテックス上のターミナルと結合させます。これを2回繰り返し、3分間回転させます。これがカップリングバッファーの手順です。
再び5 mLのカップリングバッファーをフィードケーキに加えます。同様に、混合、遠心分離、および吸引を行います。4回目には、抗体が自由に移動できるよう、ケーキの上に少量の液を残します。
こちらが抗体です。その量をマイクロピペットで計り取ります。抗体を二回蒸留水で1 Mに希釈し、混合液を30分間、または適切な時間、回転させて撹拌します。
すべての未反応の接着剤を完全に消去し、目視で確認します。その後、遠心分離を行い、Sを除去します。次に、プロトコルに従って内容物を調製します。ビーズを5 mL取り、ここにビーズがあることを確認し、底部まで浸漬させます。
この手順を3回繰り返し、その後、実施するあらゆるアッセイにおいても同様に行います。準備を開始するために、まずタンパク質を用意します。この場合、-70 °Cで保存されているタンパク質を取り出します。このタンパク質を適切に扱い、加温させることが重要です。
これにより、アッセイで使用したい濃度よりもかなり濃い状態になります。そのため、約15µLまで希釈し、チップに分注します。ただし、正確な量にする必要があります。約5µLまで量を減らした後、大きなビーズの場合はより多くの量を取り出すため、この例のビーズからは10µLを取り出します。
そして、ここでマイクロセンターチューブにアッセイバッファーをさらに約350 µL添加し、最終濃度を調整します。次に、aex your will Aを用いてviのように行います。ここでチューブを回転させ、処理を行います。それでは、ビーズを配置するためのフローを実際に構築しましょう。
標準的な顕微鏡スライドグラスを1%の接着剤を用いて固定し、表面にアンカーを付着させます。スライドグラスの端にすでに処理を施しており、ここにさらに薄いガラス片を重ねます。これにより、比較的小さなチャンバーが形成されます。
ここに小さなものが一つあります。損傷した箇所があります。日常的に扱う同様のもののひとつです。この薬剤によって、状態が改善されます。
ここでは、クラッカーとチーズを加える前に、25年物のものを最後に2回ほど、味を確認しながら注ぎます。そして、少量を、ほんのわずかだけ味見します。
ここで詳しく見ると、実際にビーズを確認できます。まず、ビーズがある領域を軽くタッピングします。その後、スライド表面の残りの部分を約40%まで浸し、スライドをさまざまな方向に向けてもビーズが移動することを心配しなくて済むようにします。サンプルを固定し、スライドをマウントさせます。さらに、安定性を高めるために予備のクリップを使用します。そして、対物レンズをセットします。
これは、こちらのスライドの位置を調整するために使用するリモコンです。カメラを含め、すべての電源が入っています。ビデオスクリーンを監視することで、潜在的なビーズのモニタリングを開始できます。左側にあるのはより小さなビーズで、その小さなビーズは、チップの表面にそのまま置かれている他の小さなビーズと同様の外観をしています。
しかしながら、ビーズ対において、一方のビーズがLOPのオフビーズ表面で焦点が合う場合、そのビーズはもう一方のビーズとは異なる焦点面に存在していることを示しています。また、右側のAは、スライド上でビーズ対がどのように機能するかを示しています。したがって、さまざまな角度で回転させながらスライドを配置することで、異なる長さが得られます。その後、回転を用いて解析を行います。コンピュータを使用した際のビーズ対のシミュレーション結果を確認します。
両方を確認しました。このケースの計算では、提供された測定値を省略でき、ここではFも省略されました。ご視聴ありがとうございました。
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概要
本記事では、新規の重力分光計の目的と操作方法について、代表的な結果とともにステップバイステップのガイドを提供します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物物理学
- 単一分子解析
背景
- 重力分光計は、分子レベルでの力を測定するように設計されています。
- 本装置には、光学顕微鏡やデジタルカメラなどのさまざまなコンポーネントが統合されています。
- この技術により、分子間相互作用の詳細な解析が可能になります。
- これらの相互作用を理解することは、神経科学および生物学の進展にとって極めて重要です。
研究目的
- 重力分光計の操作法を実演すること。
- 分子間力の測定における本装置の応用例を示すこと。
- 本分光計を用いて得られた結果についての知見を提供すること。
使用した手法
- 測定用ガラス製マイクロツールの作製。
- 観察のための光学顕微鏡およびデジタルカメラの使用。
- 力の平衡の記録および段階的な力の印加。
- 正確な解析のための試料重量の測定。
主な結果
- 分子レベルでの力測定に成功したことを実証します。
- 単分子分析における分光計の能力を解説します。
- 本手法の有効性を示す代表的な結果を提示します。
- 分光計の動作効率に関する知見を提供します。
結論
- 重力分光計は、分子分析のための有用なツールです。
- これは、分子間相互作用に関する重要な知見を提供します。
- 神経科学および生物学におけるさらなる応用が期待されています。
よくある質問
産業界における重要性
重力分光計（GFS）は、バイオ医薬品の研究開発における極めて重要な課題を解決します。&線維状タンパク質および高分子におけるナノメカニカル特性の精密かつ定量的な測定を可能にすることで、Dを構築します。絶対的な分子長を分解し、生理学的に適切な力を印加できる能力により、初期探索およびターゲットバリデーションにおける予測の信頼性が向上します。この機能は、探索パイプラインにおける重要な転換点でのリスク調整済み意思決定を支援します。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 生理的条件に近い力負荷条件下で、タンパク質の構造力学を直接的に解析することが可能です。
- 単分子レベルでアンコイルング（巻き戻り）およびストレッチング（伸長）事象を定量化することで、機能的なターゲットバリデーションをサポートします。
- 力依存的な構造変化を区別することで、メカニズム面でのリスク低減（de-risking）を促進します。
- 定量的なナノメカニカルデータを提供することで、ポートフォリオの優先順位付け（triage）における予測信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- ダウンストリームのスクリーニングワークフローに向けて、検証済みの線維性タンパク質システムを調製します。
- アッセイの標準化のために、再現性のある定量的な力および長さの測定値を提供します。
- 複数の条件下でタンパク質の力学的特性をスケーラブルに評価することを可能にします。
- 構造変化の高精度な読み取り値を提供することで、信頼性の高い化合物評価をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルモデルに基づき、ナノメカニカル測定を疾患に関連するタンパク質機能と整合させます。
- 構造データと機能データを橋渡しすることで、分子レベルの発見から前臨床検証までの一貫性を提供します。
- 力が加わった際のタンパク質の挙動について早期にメカニズム的な知見を得ることで、後期の生物学的リスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
GFSは、初期の仮説検証からリード化合物の同定、さらには前臨床研究に至るまでの創薬の連続的なプロセスに組み込まれ、既存の生物物理学的ツールやシミュレーションツールを補完します。
- 基礎生物学的な発見：力依存的な分子イベントを定量化することで、仮説検証やパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：タンパク質の伸展およびアンコイルリングについて、アッセイに適した再現性のある測定値を提供します。
- 分析：高精度な力と長さの読み出し値を提供し、実験条件の堅牢な統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：適用可能な場合、分子メカニクスを疾患関連システムにおける機能的アウトカムに結びつけます。
- 企業での再利用：R&Dプログラム全体で、多様なタンパク質および高分子研究に利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させ、メカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用上の価値：最小限のフォースキャリブレーションと高い測定精度により、ワークフローを効率化する。
- 戦略的価値：早期に定量的なメカニズムデータを提供することで、より適切なgo/no-go判断と資本効率を実現する。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整後の優先順位付けおよび、探索段階にあるアセットの推進を支援する。
実施上の検討事項
- 単分子生物物理学およびタンパク質化学の専門知識が必要です。
- 光学顕微鏡、デジタルイメージング、および計算解析インフラへのアクセスが必要です。
- サンプル調製および測定プロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- 異なるタンパク質クラスや高分子系への適応が必要な場合があります。
- 現在の解像度閾値および特定の分子サイズとの適合性によって制限されます。
