イメージング C.エレガンス胚

このプロトコルは、広く利用可能な顕微鏡とオープンソースソフトウェアを利用して、Norky DIC光学系または蛍光を使用して、初期のCL eganの胚の動的イベントをイメージングする方法を示しています。このプロトコルは、CL gans胚を解剖し、イメージングのためにマウントする方法を説明することから始まります。次に、DICの適切なセットアップもマスクもできない光学系を見直して、最高のディテールで最適な画像を確保します。

広視野のエピ蛍光および照明のキャリブレーションも、オープンソースソフトウェアとチームを組んで良好な蛍光画像データを収集するためのレビューを行います。優れた顕微鏡検査は、発生中の胚の細胞動態を視覚化することができます。DIIC Opticsを適切にセットアップすることは、用語が混乱する可能性があり、適切な手法を書面で説明するのが難しいため、この方法を視覚的に説明することが重要です。

また、研究者は蛍光イメージングを行う際に、光への曝露を最小限に抑えるように注意する必要があります。光毒性と光退色を制限するために イメージング用の胚を準備するには、まず、2つのマウント溶液を作成します。1つは溶かされたワセリンで、もう1つはバッファー中に2〜3%のアロスです。

画像化する構造が非常に壊れやすい場合は、沸騰しないように注意しながら、より密度の高いアロスを作成できます。両方のストック溶液は電子レンジで溶かされ、4〜5ミリリットルのアリコートとして保存されます。イメージングの日には、ワセリン溶液のアリコートを摂氏65〜70度のヒートブロックで溶かし、マイクロ波でローズ溶液の1アリコートを溶かします。

繰り返しになりますが、沸騰を避けます。次に、これらの溶液を溶融状態に保つために、ヒートブロックに保管します。次に、2つのスライドの上部と下部をラボテープで覆い、テープで留めた2つのスライドの間にきれいなスライドを配置します。

次に、溶けたアロスを数滴きれいなスライドにパイプで絞り、別のきれいなスライドで覆います。アロスは、ワームパッドが準備された薄い正方形のパッドに広がります。解剖スコープとプラチナワイヤーピックを使用して、2匹の成虫を18 x 18 mmのカバースリップ上の9〜12マイクロリットルのバッファードロップに移します。

その後、カットします。針またはメスでワームを開き、アガロ側を下にして胚を放出します。ウォームパッドを18 x 18ミリメートルのカバースリップに置き、はみ出した寒天をかみそりで取り除きます。

最後に、カバースリップを密封するために、溶融したワセリン溶液をペイントブラシまたはつまようじでその周囲に沿って塗布します。これで、細胞をイメージングする準備が整いました。スライドを顕微鏡に置くときは、2つの偏光子が互いに垂直に整列

ウォーラーとプリズムの両方が光路から外れていることを確認します。フィールドが暗くない場合は、コンデンサーの下の偏光子を回転させて、今になるまで回転させます。10倍の目的を使用して胚を見つけます。

イメージングフィールド内で複数の胚を得るために、若い胚のグループについてワーム体の近くを調べてください。最高の画像を得るために、ワーム内の胚を避けてください。最適な胚を見つけたら、より高い出力の目標に切り替えます。

次に、フィルターキューブをDICに切り替えます。次に、上部の対物ウォールストーンプリズムを光路に挿入し、コンデンサーのタルトを回転させて、対物レンズに一致する下部のウォルストーンプリズムを選択します。プリズムを取り付けた状態で、このタレットの下にあるスライダーをレンズの開口数に合わせて調整します。

最適なKohler照明を得るには、コンデンサーダイアフラムの端が最もシャープに見えるまでコンデンサーに焦点を合わせます。最もシャープなのは、ライトブラックの境界が最も鮮明であるか、ピントが合っているときです。最適なコントラストを得るには、スライダーのノブを回してリンゴの壁とプリズムを調整します。

これで、顕微鏡の使用準備がほぼ整いました。今こそ、micromanagerとオープンソースソフトウェアを使用して、コンピューター上の追加のイメージングパラメータを制御する時です。まず、カメラゲインをゼロに設定します。

次に、ファイルを 16 ビット tiff ではなく 8 ビットで保存するように切り替えます。TIFFファイルは、後でImage J.Nextのようなオープンソースソフトウェアで分析でき、最も明るいピクセルが彩度レベルのすぐ下にある場所に光レベルを調整します。すべてが正しく行われていれば、画像は3Dに見え、光が斜めに差し込んで見えます。

画像が鮮やかに見えるようになったので、画像化する胚を選択し、関心領域を描きます。顕微鏡にフォーカスモーターがある場合は、それを使用して毎回複数の焦点面を収集します。多次元取得ウィンドウをポイントして開き、フォーカスノブを調整してZスタックの上面と下面を設定し、いくつかのヨーク顆粒が焦点が合っている最初と最後の焦点面を見つけます。

ステップ サイズを設定します。これにより、収集される焦点面の数が定義されます。次に、すべての焦点面を取得するのに十分な長さの時間間隔を設定します。

最大タイムポイントを非常に高く設定して、ソフトウェアが手動で停止するまで画像を撮影することができます。最後に取得した画像のみを表示するようにソフトウェアを設定して、プロセスを監視できるようにします。次に、画像にファイル名を付けて、画像の取得を開始します。

画像解析については、次のセクションの最後に簡単に説明します。GFPムービーの構築は、4DやムスキーDICの作成によく似ていますが、蛍光飛散のソフトウェア制御を含む設定ファイルが使用されます。代わりに、胚が配置された状態で、上部のウォルストーンプリズムが光路にないことを確認し、フィルターキューブをF-I-T-C-G-F-Pに切り替えます。

ソフトウェアを使用した起動時にこれが自動的に設定されなかった場合は、カメラのゲインが255に設定されていることを確認してください。画像ファイルは 16 ビット tiff 形式に設定されています。次に、透過光源をオフにして、[ライブイメージング]をクリックします。

UV光源の強度と露光時間を調整して、蛍光信号の良好なS/N比を達成しますが、細胞を保護するために光の露光を最小限に抑えてください。次に、時間間隔を設定します。時間点の数と焦点面の数は、前述のように画像取得が進行します。

映画を分析するには、オープンソースソフトウェアを使用してください。micromanagerプラグインがインストールされたImage J 非常に大きなムービーも、lociプラグインを使用してImage Jにインポートできます。これは、DARC光学系のNor maskyで捕獲された野生型の胚です。

後部は右下にあり、腹側は左下にあります。この動画は、15秒ごとに収集された単焦点面の画像のシーケンスを示しています。再生は毎秒14フレームに設定されています。

この胚は、最初の胚分裂中に蛍光を発現し、ここで後方は右上にあります。この動画は、10秒ごとに1つの焦点面での変化を示しています。このビデオを見れば、DIC Naski 光学系と落射蛍光の両方を使用して生きた胚をイメージングし、動的事象を研究する方法について十分に理解できるはずです。

DIC Nomar 光学系の設定方法をご理解いただければ幸いです。また、脱射蛍光照明を使用して高品質の蛍光データを取得でき、必ずしも高度な顕微鏡に依存する必要はないことを理解していただければ幸いです。また、これらのイメージング技術を適用して、特定の遺伝子機能を欠く胚を調べることで、細胞分裂や発生中のお気に入りのイベントの遺伝的要件をさらに調査することもできます。