イメージング C.エレガンス胚
March 24th, 2011
市販 C.エレガンス胚は、細胞生物学と開発を研究するための強力なシステムです。我々はのライブイメージングのためのプロトコルを提示 C.エレガンス容易に入手できる落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用してDIC光学系や蛍光を利用した胚。
このプロトコルは、広く利用可能な顕微鏡とオープンソースソフトウェアを利用して、Norky DIC光学系または蛍光を使用して、初期のCL eganの胚の動的イベントをイメージングする方法を示しています。このプロトコルは、CL gans胚を解剖し、イメージングのためにマウントする方法を説明することから始まります。次に、DICの適切なセットアップもマスクもできない光学系を見直して、最高のディテールで最適な画像を確保します。
広視野のエピ蛍光および照明のキャリブレーションも、オープンソースソフトウェアとチームを組んで良好な蛍光画像データを収集するためのレビューを行います。優れた顕微鏡検査は、発生中の胚の細胞動態を視覚化することができます。DIIC Opticsを適切にセットアップすることは、用語が混乱する可能性があり、適切な手法を書面で説明するのが難しいため、この方法を視覚的に説明することが重要です。
また、研究者は蛍光イメージングを行う際に、光への曝露を最小限に抑えるように注意する必要があります。光毒性と光退色を制限するために イメージング用の胚を準備するには、まず、2つのマウント溶液を作成します。1つは溶かされたワセリンで、もう1つはバッファー中に2〜3%のアロスです。
画像化する構造が非常に壊れやすい場合は、沸騰しないように注意しながら、より密度の高いアロスを作成できます。両方のストック溶液は電子レンジで溶かされ、4〜5ミリリットルのアリコートとして保存されます。イメージングの日には、ワセリン溶液のアリコートを摂氏65〜70度のヒートブロックで溶かし、マイクロ波でローズ溶液の1アリコートを溶かします。
繰り返しになりますが、沸騰を避けます。次に、これらの溶液を溶融状態に保つために、ヒートブロックに保管します。次に、2つのスライドの上部と下部をラボテープで覆い、テープで留めた2つのスライドの間にきれいなスライドを配置します。
次に、溶けたアロスを数滴きれいなスライドにパイプで絞り、別のきれいなスライドで覆います。アロスは、ワームパッドが準備された薄い正方形のパッドに広がります。解剖スコープとプラチナワイヤーピックを使用して、2匹の成虫を18 x 18 mmのカバースリップ上の9〜12マイクロリットルのバッファードロップに移します。
その後、カットします。針またはメスでワームを開き、アガロ側を下にして胚を放出します。ウォームパッドを18 x 18ミリメートルのカバースリップに置き、はみ出した寒天をかみそりで取り除きます。
最後に、カバースリップを密封するために、溶融したワセリン溶液をペイントブラシまたはつまようじでその周囲に沿って塗布します。これで、細胞をイメージングする準備が整いました。スライドを顕微鏡に置くときは、2つの偏光子が互いに垂直に整列
していることを確認してください。ウォーラーとプリズムの両方が光路から外れていることを確認します。フィールドが暗くない場合は、コンデンサーの下の偏光子を回転させて、今になるまで回転させます。10倍の目的を使用して胚を見つけます。
イメージングフィールド内で複数の胚を得るために、若い胚のグループについてワーム体の近くを調べてください。最高の画像を得るために、ワーム内の胚を避けてください。最適な胚を見つけたら、より高い出力の目標に切り替えます。
次に、フィルターキューブをDICに切り替えます。次に、上部の対物ウォールストーンプリズムを光路に挿入し、コンデンサーのタルトを回転させて、対物レンズに一致する下部のウォルストーンプリズムを選択します。プリズムを取り付けた状態で、このタレットの下にあるスライダーをレンズの開口数に合わせて調整します。
最適なKohler照明を得るには、コンデンサーダイアフラムの端が最もシャープに見えるまでコンデンサーに焦点を合わせます。最もシャープなのは、ライトブラックの境界が最も鮮明であるか、ピントが合っているときです。最適なコントラストを得るには、スライダーのノブを回してリンゴの壁とプリズムを調整します。
これで、顕微鏡の使用準備がほぼ整いました。今こそ、micromanagerとオープンソースソフトウェアを使用して、コンピューター上の追加のイメージングパラメータを制御する時です。まず、カメラゲインをゼロに設定します。
次に、ファイルを 16 ビット tiff ではなく 8 ビットで保存するように切り替えます。TIFFファイルは、後でImage J.Nextのようなオープンソースソフトウェアで分析でき、最も明るいピクセルが彩度レベルのすぐ下にある場所に光レベルを調整します。すべてが正しく行われていれば、画像は3Dに見え、光が斜めに差し込んで見えます。
画像が鮮やかに見えるようになったので、画像化する胚を選択し、関心領域を描きます。顕微鏡にフォーカスモーターがある場合は、それを使用して毎回複数の焦点面を収集します。多次元取得ウィンドウをポイントして開き、フォーカスノブを調整してZスタックの上面と下面を設定し、いくつかのヨーク顆粒が焦点が合っている最初と最後の焦点面を見つけます。
ステップ サイズを設定します。これにより、収集される焦点面の数が定義されます。次に、すべての焦点面を取得するのに十分な長さの時間間隔を設定します。
最大タイムポイントを非常に高く設定して、ソフトウェアが手動で停止するまで画像を撮影することができます。最後に取得した画像のみを表示するようにソフトウェアを設定して、プロセスを監視できるようにします。次に、画像にファイル名を付けて、画像の取得を開始します。
画像解析については、次のセクションの最後に簡単に説明します。GFPムービーの構築は、4DやムスキーDICの作成によく似ていますが、蛍光飛散のソフトウェア制御を含む設定ファイルが使用されます。代わりに、胚が配置された状態で、上部のウォルストーンプリズムが光路にないことを確認し、フィルターキューブをF-I-T-C-G-F-Pに切り替えます。
ソフトウェアを使用した起動時にこれが自動的に設定されなかった場合は、カメラのゲインが255に設定されていることを確認してください。画像ファイルは 16 ビット tiff 形式に設定されています。次に、透過光源をオフにして、[ライブイメージング]をクリックします。
UV光源の強度と露光時間を調整して、蛍光信号の良好なS/N比を達成しますが、細胞を保護するために光の露光を最小限に抑えてください。次に、時間間隔を設定します。時間点の数と焦点面の数は、前述のように画像取得が進行します。
映画を分析するには、オープンソースソフトウェアを使用してください。micromanagerプラグインがインストールされたImage J 非常に大きなムービーも、lociプラグインを使用してImage Jにインポートできます。これは、DARC光学系のNor maskyで捕獲された野生型の胚です。
後部は右下にあり、腹側は左下にあります。この動画は、15秒ごとに収集された単焦点面の画像のシーケンスを示しています。再生は毎秒14フレームに設定されています。
この胚は、最初の胚分裂中に蛍光を発現し、ここで後方は右上にあります。この動画は、10秒ごとに1つの焦点面での変化を示しています。このビデオを見れば、DIC Naski 光学系と落射蛍光の両方を使用して生きた胚をイメージングし、動的事象を研究する方法について十分に理解できるはずです。
DIC Nomar 光学系の設定方法をご理解いただければ幸いです。また、脱射蛍光照明を使用して高品質の蛍光データを取得でき、必ずしも高度な顕微鏡に依存する必要はないことを理解していただければ幸いです。また、これらのイメージング技術を適用して、特定の遺伝子機能を欠く胚を調べることで、細胞分裂や発生中のお気に入りのイベントの遺伝的要件をさらに調査することもできます。
概要
このプロトコルは、DIC光学または蛍光を用いてC. elegansの胚のライブイメージングを実演します。胚の準備とイメージング技術の最適化のための詳細な手順を提供します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 発生生物学
- 顕微鏡技術
背景
- C. elegansの胚は細胞力学を研究するためのモデルシステムです。
- ライブイメージング技術は発達プロセスを観察するために不可欠です。
- イメージング装置の適切なセットアップは高品質な結果のために重要です。
- 光への露出を最小限に抑えることは、光毒性を防ぐために重要です。
研究の目的
- C. elegansの胚をイメージングするための包括的なプロトコルを提供すること。
- 初期発達中の細胞力学の理解を深めること。
- アクセス可能な顕微鏡ツールとオープンソースソフトウェアを利用すること。
使用される方法
- C. elegansの胚の解剖とマウンティング。
- DIC光学と蛍光設定のキャリブレーション。
- 画像取得と分析のためのオープンソースソフトウェアの使用。
- 高品質な画像を達成するためのイメージングパラメータの最適化。
主な結果
- C. elegansの胚における動的な出来事の成功したイメージング。
- 適切な光学セットアップの明瞭さへの重要性の実証。
- イメージング中の光への露出を最小限に抑えるためのガイドラインの提供。
- 多次元的な画像データの収集の促進。
結論
- このプロトコルはC. elegansの胚の効果的なイメージングを可能にします。
- 適切な技術とセットアップは成功したイメージングにとって重要です。
- オープンソースソフトウェアは研究者にとってアクセスを容易にします。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Live imaging of C. elegans embryos enables mechanistic de-risking of cellular processes such as chromosome assembly and cytokinesis, providing predictive confidence in target validation for early discovery programs. The protocol leverages accessible microscopy and open-source software to support scalable, reproducible phenotypic screening in a disease-relevant system with known lineage and genetic tractability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct visualization of dynamic cellular events in vivo.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying gene function in developmental pathways using fluorescent reporters or DIC contrast.
- Predictive Value: Facilitates lead identification by linking genetic perturbations to phenotypic outcomes in a high-fidelity embryonic model.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation using standardized embryo mounting and imaging workflows.
- Quantitative Outputs: Enables time-lapse acquisition of Z-stacks and multi-dimensional data for reproducible measurement of cellular dynamics.
- Platform Reuse: Leverages widely available epifluorescent microscopes and open-source software to reduce dependency on specialized imaging infrastructure.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects fundamental cellular mechanisms to developmental phenotypes with translational biomarker alignment potential.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing dynamic, lineage-resolved data from genetic perturbation studies.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target validation by observing real-time consequences of gene knockdown or mutation on embryogenesis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and phenotypic screening prior to lead optimization stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking through live imaging of embryonic cell divisions and developmental transitions.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility via controlled embryo mounting, illumination calibration, and open-source acquisition.
- Analytics: Generates quantitative readouts such as fluorescence intensity, nuclear morphology, and cytokinesis timing for comparative condition analysis.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation by linking embryonic phenotypes to genetic perturbations relevant to human disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability across projects studying conserved cellular mechanisms in genetically tractable models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cellular process regulation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized protocols and open-source software compatibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, in vivo phenotypic data that reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on phenotypic severity and expressivity in embryonic development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, embryo dissection, and mounting techniques.
- Dependent on functional epifluorescent microscope with DIC optics, filter cubes, and focus motor for Z-stacking.
- Necessitates standardization of illumination levels, exposure times, and mounting solution preparation across users.
- Involves adaptation considerations for different genetic backgrounds or mutant strains affecting embryo viability or morphology.
- Includes practical limitations such as phototoxicity risk during fluorescence imaging and embryo drift during long acquisitions.
