Name: 膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: 学ぶ膜タンパク質の構造動力学を調べる方法。部位特異的蛍光標識と電圧クランプ蛍光法を用いて、イオン輸送とタンパク質の構造変化を同時に測定し、膜タンパク質の機能を解明する。

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<ol><li>Cole, K. S., Moore, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+Ion+Current+in+the+Squid+Giant+Axon%3A+Dynamic+Characteristic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Potassium Ion Current in the Squid Giant Axon: Dynamic Characteristic.</a> Biophys. J. 1, 1-14 (1960).</li>
<li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+voltage+clamp+to+record+small%2C+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li>
<li>Dempski, R. E., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+subunit+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+follows+the+conformational+state+of+the+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The beta subunit of the Na+/K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme.</a> J. Gen. Physiol. 125, 505-520 (2005).</li>
<li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> BBA - Biomembranes. 1465, 343-358 (2000).</li>
<li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Voltage-Dependent+Conformational+Changes+in+the+Shaker+K%2B+Channel+with+Fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterizing Voltage-Dependent Conformational Changes in the Shaker K+ Channel with Fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li>
<li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Physical+Measure+of+Conformational+Rearrangement+Underlying+Potassium+Channel+Gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Physical Measure of Conformational Rearrangement Underlying Potassium Channel Gating.</a> Science. 271, 213-216 (1996).</li>
<li>Koch, H. P., Larsson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+molecular+motions+accomplish+glutamate+uptake+in+human+glutamate+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Small-scale molecular motions accomplish glutamate uptake in human glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 25, 1730-1736 (2005).</li>
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<li>Geys, S. A., Bamberg, E., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-Dependent+Effects+on+the+Conformational+Equilibrium+of+the+Na%2B%2CK%2B-ATPase+As+Monitored+by+Voltage+Clamp+Fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ligand-Dependent Effects on the Conformational Equilibrium of the Na+,K+-ATPase As Monitored by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Biophys. J. 96, 4561-4561 (2009).</li>
<li>Geibel, S., Kaplan, J. H., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Dynamics+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+Probed+by+Voltage+Clamp+Fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Conformational Dynamics of the Na+/K+-ATPase Probed by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 964-969 (2003).</li>
<li>Lorenz, L., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li>
<li>Mruk, K., Kobertz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+Novel+Activator+of+KCNQ1-KCNE1+K%2B+Channel+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Discovery of a Novel Activator of KCNQ1-KCNE1 K+ Channel Complexes.</a> Biophys. J. 177a, (2009).</li>
<li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+diplaying+the+hydropathic+character+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for diplaying the hydropathic character of a protein.</a> J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).</li>
<li>Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+movement+by+the+Na%2FK+pump+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Charge movement by the Na/K pump in Xenopus oocytes.</a> J. Gen. Physiol. 101, 117-144 (1993).</li>
<li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85, 564-569 (2009).</li>
<li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+implications+of+fluorescence+quenching+in+the+Shaker+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Structural implications of fluorescence quenching in the Shaker K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 112, 391-391 (1998).</li>
<li>Förster, T. Ann Physik. 2, 55-75 (1948).</li>
<li>Dong, X., Stothard, P., Forsythe, I. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PlasMapper%3A+a+web+server+for+drawing+and+auto-annotating+plasmid+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PlasMapper: a web server for drawing and auto-annotating plasmid maps.</a> Nucleic Acids Res. 32, W660-W664 (2004).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々が記述している実験的なアプローチは、構造と膜タンパク質の機能との関係を調査するために、サイト固有の蛍光物質の標識二電極電圧クランプを兼ね備えています。この手法は、イオン輸送中の膜タンパク質の立体構造のダイナミクスを時間分​​解情報を取得するために使用することができます。さらに、このアプローチは、イオンポンプ、イオンチャネルやトランスポーターなどの様々なタンパク質で動作するように調整することができます。 特定の残基に立体構造のダイナミクスを調べるに加えて、それはホロ酵素内での距離の制約を決定するために蛍光共鳴エネルギー移動を使用することも可能です。残基だけでなく、サブユニット間の相対運動を測定する間の距離の決定は、ゲーティング機構に関わる重要な問題を解決することができます。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/機器</th><th>会社</th><th>試薬/機器</th><th>会社</th></tr><tr><td> 100Wタングステン光源</td><td>カールツァイスマイクロイメージング</td><td>フルオレセイン-5 - マレイミド</td><td>インビトロジェン</td></tr><tr><td> 1B150F - 4 </td><td>世界の精密機器</td><td>ハイピュアPCR抽出キット</td><td>ロッシュ</td></tr><tr><td> 3.0から4.0エチコンVicryl </td><td>ジョンソン＆ジョンソン</td><td> mMessage mMachineキット</td><td>アンビオン</td></tr><tr><td> 475AF40励起フィルター</td><td>オメガオプティカル</td><td> MS - 222 </td><td>シグマアルドリッチ</td></tr><tr><td> 505DRLPダイクロイックミラー</td><td>オメガオプティカル</td><td> Nucleospinプラスミドキット</td><td>マシュレ-ナーゲル</td></tr><tr><td>マシュレ-ナーゲル</td><td>オメガオプティカル</td><td>光度計2000C Sprectrophotometer </td><td>サーモサイエンティフィック</td></tr><tr><td> 535DF50励起フィルター</td><td>オメガオプティカル</td><td> PC - 10マイクロピペットプラー</td><td>ナリシゲ</td></tr><tr><td> 560DRLPダイクロイックミラー</td><td>オメガオプティカル</td><td> 10ソフトウェアをpCLAMP </td><td>アクソンインスツルメンツ</td></tr><tr><td> 565ALPエミッションフィルター</td><td>オメガオプティカル</td><td> PfuTurbo DNAポリメラーゼ</td><td> Strategene </td></tr><tr><td> 565EFLPエミッションフィルター</td><td>オメガオプティカル</td><td> PIN - 022Aフォトダイオード</td><td>ユナイテッド検出技術</td></tr><tr><td> 570DRLPダイクロイックミラー</td><td>オメガオプティカル</td><td>偏光フィルター</td><td>リノスPhtonics株式会社</td></tr><tr><td>リノスPhtonics株式会社</td><td>オメガオプティカル</td><td>クイックチェンジサイト - ディレクMutagenisisキット</td><td>ストラタジーン</td></tr><tr><td>アクシオ審査蛍光顕微鏡</td><td>カールツァイスマイクロイメージングGMBH </td><td> RC - 10蛍光商工会議所</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td></tr><tr><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td>テトラメチルローダミン- 6 -マレイミド</td><td>インビトロジェン</td></tr><tr><td> Digidata 1440Aデータ収集システム</td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td> TOP10エレクトロコンピテント細胞</td><td>インビトロジェン</td></tr><tr><td> DPN私</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>ターボテック- 05Xアンプ</td><td> NPI </td></tr></tbody></table>

膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

二つの電極電圧クランプ電気生理学（TEVC）は、イオンチャネル2、イオンポンプ3、及びトランスポーター4を含む膜タンパク質の多種多様なイオンtransport1のメカニズムを調査する強力なツールです。最近の動向は、同時に、単一の細胞の表面上の特定の残基およびこれらのタンパク質の機能で、構造動力学を調べるためにTEVCと並んで、サイト固有の蛍光物質のラベリングを組み合わせている。 我々は、同時に電圧クランプ蛍光を用いて蛍光と現在の変更を監視することによって、膜タンパク質の立体構造のダイナミクスを研究する方法を説明します。このアプローチは、膜タンパク質部位特異的に以下のシステインの置換と部位特異的蛍光物質標識5,6の分子運動を調べるために使用することができます。さらに、このメソッドは、特定の残基7,8間の距離の制約を決定するアプローチを提供しています。これは、選択的に関心のある2つの変異システイン残基へのドナーとアクセプターフルオロフォアを取り付けることによって実現されます。 簡単に言えば、これらの実験は、 アフリカツメガエルリービスの卵母細胞の表面上に所望のタンパク質の機能発現に続く実行されます。これらの卵母細胞の大きな表面積は、容易な機能の測定と堅牢な蛍光信号5が可能になります。それは容易に膜タンパク質4のメカニズムに関するさらなる情報を提供することができるようなpHは、リガンドまたはカチオン/アニオンなどの細胞外の条件を、変更することも可能です。最後に、最近の進展はまた、第二のタンパク質9との共発現を以下のセレクト内部イオンの操作を有効にしている。 我々のプロトコルは、複数の部分で説明されています。最初に、スキャン突然変異誘発は蛍光体の標識によって進行システインは、膜貫通及び細胞外ドメインのインタフェースに位置する残基で完了する。その後の実験はタンパク質のコンフォメーション変化によって蛍光強度（&lt;5％）3の大きな変化を示す残基を同定するために設計されています。第二に、蛍光強度の変化は、タンパク質10の機能に構造動力学を関連づけるために、膜タンパク質の動力学的パラメーターと比較されます。これは、標的タンパク質の分子運動の厳密な生物物理学的な分析が可能になります。最後に、ホロ酵素の二つの残基がドナーの光破壊法を用いて距離の制約を決定するために、ドナーとアクセプターの蛍光団で標識することができます。それは、ドナーとアクセプターの蛍光団で標識は、次のタンパク質サブユニットの相対的な動きを監視することも可能です。

我々は単一細胞の蛍光を用いて立体構造変化の部位特異的解析と並んで膜タンパク質のイオン輸送の動態を測定する方法を説明します。この手法は、イオンチャネル、トランスポーター、イオンポンプに適応可能であり、タンパク質サブユニット間の距離の制約を決定するために利用することができます。

2電極電圧クランプ法（TEVC）は、多種多様な膜輸送体のイオン輸送メカニズムを調査するための強力なツールである1...

この手順の全体的な目的は、単一細胞の表面における部位特異的蛍光ラベル化を利用して、膜タンパク質の構造ダイナミクスを調べることです。これはまず、赤色のCで示されているように、細胞外ドメインと膜貫通ドメインの界面にある残基を個別にシステインに置換することによって達成されます。次に、この残基がシステイン反応性蛍光色素でラベル化可能かどうかを判断する必要があります。本手順の第2ステップでは、システインへの変異導入および／または蛍光色素によるラベル化が、タンパク質のキネティクスおよび／または構造状態に影響を与えるかどうかを検証します。これは、図に示したセットアップを用いて行います。手順の3番目のステップでは、蛍光強度の変化を標的タンパク質の速度論的パラメータと比較し、対照させます。ここに典型的な蛍光トレースを示します。手順の最終ステップは、変異させたシステインペアをドナーFluor 4またはドナー・アクセプタFluor 4で標識し、電圧クランプ測定と同時に光破壊速度を測定して、距離制約を決定することです。この図では、アクセプタ不在時のドナー光破壊速度を黒色で、アクセプタ存在時のドナー光破壊速度を赤色で示しています。最終的に、タンパク質の構造変化の結果である蛍光強度の変化が、電圧クランプフルオロメトリーを通じて膜タンパク質の機能と相関することを示す結果を得ることができます。この手法は、タンパク質の構造状態の変化がどのようにして細胞膜を介した低分子やイオンの輸送を促進するのかなど、膜イオン輸送分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。まず、ナトリウムカリウムポンプをXenopus oocyte（アフリカツメガエル卵母細胞）発現に適したベクターにクローニングすることから手順を開始してください。次のステップとして、付属の記事に記載されている通り、膜貫通ドメインと細胞外ドメインの界面に位置する残基にシステイン変異を導入します。完了後、付属の記事に記載されている手順に従ってプラスミドDNAをmRNAに転写し、DNAシーケンシングによって変異の導入を確認します。手術前に分光光度計を用いてmRNAの収量を定量してください。手術中の嘔吐を防ぐため、カエルを12時間絶食させます。翌日の手術を開始するには、カエルが足指のつまみに反応しなくなるまで麻酔液に浸します。カエルを麻酔液から取り出し、おむつパッドの吸収面に背面を下にして置きます。カエルが乾燥しないよう、濡れたペーパータオルを上に被せます。また、カエルの目が開いている場合は、生理食塩水で湿らせて維持してください。カエルの正中線の片側に、小さな皮膚切開を加えます。卵巣を確認し、体の外側に引き出します。その際、卵巣が皮膚に触れないようにしてください。卵巣を取り出し、リンゲル液を入れたシャーレに置きます。組織を腹腔内に戻す前に、残りの組織から出血がないか確認してください。出血がある場合は、止血するまで滅菌綿棒で圧迫してください。断続縫合を用いて切開部を縫合し、手術を終了します。ハサミを使用して、カエルを飼育容器に戻し、麻酔から回復させます。単離した卵巣葉をより小さな部分に分割します。凝集した組織を、コラゲナーゼを加えたカルシウム含有リンガー液に移します。次に、消化液を18 °Cで2時間、穏やかに振盪させます。卵細胞の大部分が分離したら、カルシウム不含リンガー液で卵細胞を洗浄します。次に、卵母細胞をカルシウム抜きのリンガー液中で室温にて10分間インキュベートします。この時点で、細胞をカルシウム含有リンガー液で十分に洗浄してください。その後、注入前の保存のために、卵母細胞をカルシウム含有リンガー液に移します。次のステップでは、合成したmRNAを-20°Cのフリーザーから取り出します。mRNA 25ngを最終容量50nLになるように加えます。その後、mRNAを細胞に注入します。卵母細胞をringer溶液および1 mg/mLのgentamicinに浸し、18 °Cの暗所で3〜7日間インキュベートします。これにより、卵母細胞の細胞膜にナトリウム・カリウムポンプが発現します。実験当日に卵母細胞をインキュベーターから取り出し、loading bufferに45分間、その後post loading bufferに45分間浸します。これにより細胞内のナトリウム濃度を高め、ナトリウム-カリウムポンプの測定を容易にします。蛍光測定を行う場合は、TMRMやFMなどの目的のフルオロフォアを5 µM含むポストローディングバッファー中で、卵細胞を暗所で5〜10分間インキュベートします。フルオロフォアによる標識後、染料を含まないポストバッファーで卵細胞を十分に洗浄します。光退色を防ぐため、卵母細胞は暗所に保管してください。2電極電位固定法による測定の準備として、まずマイクロ電極に3 Mの塩化カリウムを満たし、抵抗値をテストします。抵抗値は0.5から1.5 MΩの間である必要があります。システイン・スキャニング実験では、蛍光顕微鏡に5 35 DF 50励起フィルター、5 65 EFLP蛍光フィルター、および5 70 DRLP二色鏡を装着します。次に、オクトパスをRC 10チャンバーに入れ、蛍光顕微鏡のステージ上に配置します。その後、アンプを用いて膜電位を一定値に保持しながら、2本の微小電極を慎重にオクトパスに挿入します。溶液置換や膜電位の変更など、適切な手法を用いてタンパク質を活性化し、膜を横切るイオンフラックスを測定します。蛍光測定を同時に行う場合は、100 Wのタングステン光源でドナー蛍光色を励起し、蛍光標識による蛍光強度の変化を検出するために0 2 2, A photo DDEを使用します。これはシステインスキャニング後に行います。P clamp 10ソフトウェアで制御される電圧ステップを用いて、定常電流における蛍光強度の変化を測定します。プロトコルの第2部では、距離測定と並行してアニソトロピー測定を行います。κ²値の範囲を算出するため、アニソトロピーを用いて回転によるフルオロフォアの相対的な可動性を測定します。計算の詳細については、付随する論文を参照してください。距離拘束を測定するには、フルオロフォアで標識可能な2つのアクセス可能な細胞外システイン残基を持つホロ酵素を使用します。1 µMのFMおよび4 µMのTMRMを含むポストローディングバッファーを添加します。これがドナーとアクセプターです。oocytesの1バッチに対して、1 µMのFMのみを添加します。これがドナー側の蛍光色素となります。別の卵母細胞バッチに4つずつ分け、両方のバッチの卵母細胞を氷上で30分間、暗所でインキュベートします。これにより、アクセプター蛍光色素であるFluo-4でラベルされたホロ酵素とラベルされていないホロ酵素の測定が可能になります。次に、顕微鏡に475 DF 40励起フィルター、530 DF 30蛍光フィルター、および505 DRLPダイクロイックミラーを装着します。次に、卵母細胞を蛍光顕微鏡ステージ上のチャンバーに配置します。溶液の流れを継続的に維持しながら、アクセプター蛍光がある場合とない場合におけるドナーの退色の時間依存性を測定します。4. これらの結果を用いて、フェルスターの式に基づき、ナトリウム・カリウムポンプ上の2つの残基間の距離を算出できます。タンパク質が機能的であることを確認するため、等式2電極電位固定法による測定を同時に行う必要があります。pCLAMP 10のclamp X機能を用いて、最低4回のサイト記録におけるドナー蛍光分子の光破壊の結果を平均してください。タンパク質サブユニットの相対的な動きを測定するには、アクセプターおよびドナー蛍光分子を含むダブルシステイン構築物を使用してください。これらの残基における蛍光強度はタンパク質のコンフォメーション状態に依存せず、2つの蛍光団の間の距離の関数となります。次に、顕微鏡のフィルターセットを、475 a F 40励起フィルター、595 a F 60蛍光フィルター、および505 DRLPダイクロイックミラーに変更します。その後、OIを蛍光顕微鏡ステージ上のチャンバーに設置します。次に、100 Wのタングステン光源でドナーを励起させ、アクセプターであるFluoro fourの蛍光強度を測定します。電圧クランプ法や溶液交換法などの適切な手法を用いて膜タンパク質を活性化させ、同時に蛍光強度の変化を測定します。この図は、細胞膜を介したイオン輸送と蛍光強度の変化の相関を示しています。上のトレースは、10 µMおよび10 mMのing存在下における、ナトリウム試験溶液およびカリウム試験溶液を用いたカレントクランプ測定の結果を示しています。下のトレースは、カレントクランプ測定と同時に測定された蛍光強度の変化を示しています。この図では、アクセプター蛍光色素であるTMRMでラベル付けされた2つの卵細胞が示されています。左側の卵母細胞は野生型のナトリウムカリウムATPaseを発現しており、右側の卵母細胞は1つのアクセス可能なシステイン残基を持つナトリウムカリウムATPaseを発現しています。この図の上部のトレースは、電圧パルス印加時の過渡電流データを示しています。下部のトレースは、電圧パルス印加時の蛍光強度変化のリアルタイム記録を示しています。この図は、ドナーの光退色による光破壊の時間依存性を示しており、アクセプター蛍光分子の有無において測定されています。アクセプター蛍光分子がない場合、光退色がより急速に起こります。各トレースは、4回の測定記録の平均値です。この図は、構造変化に伴う相対的なサブユニットの動きを示しています。蛍光の変化は赤色のトレースで、電流の流れは黒色のトレースで示されています。左側に示されている蛍光強度の増加は、floorが互いに近づいたことを示しています。中央に示されている蛍光強度の変化がないことは、floor間の距離が静的なままであることを示しています。右側に示されている蛍光強度の低下は、この手順の実施中にフルオロフォア（蛍光団）の間隔が広がったことを示しています。速度論的および定常状態の蛍光強度の変化を、タンパク質の構造変化と相関させて考えることが重要です。

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