膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ

我々は単一細胞の蛍光を用いて立体構造変化の部位特異的解析と並んで膜タンパク質のイオン輸送の動態を測定する方法を説明します。この手法は、イオンチャネル、トランスポーター、イオンポンプに適応可能であり、タンパク質サブユニット間の距離の制約を決定するために利用することができます。

この手順の全体的な目標は、単一細胞の表面上の部位特異的蛍光標識を利用して、膜タンパク質の確認的なダイナミクスを調べることです。これは、赤色で示されるように、まず細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインの界面で残基を個々に変異させることによって達成され、次に、この残基をシスチン反応フルオロ4で標識できるかどうかを決定するために必要 C.It。手順の第2ステップは、シスチン、突然変異誘発、および/またはフルオロ4標識がタンパク質の速度論的および/または確認状態に影響を与えるかどうかを調べることです。

これは、示されているセットアップを使用して実行されます。手順の3番目のステップは、蛍光強度の変化を標的タンパク質の速度論的パラメータと比較し、対比することです。典型的な蛍光トレースをここに示します。

手順の最後のステップは、変異したシステインペアをドナーFluor fourまたはドナーアクセプターFluor fourのいずれかで標識し、電圧クランプ測定と並行して光破壊率を測定し、距離の制約を決定することです。この図は、アクセプターがない場合のドナー写真の破壊率を黒で、アクセプターの存在下でのドナー写真の破壊率を赤で示しています。最終的には、タンパク質の確認変化の結果である蛍光強度の変化が、電圧クランプ蛍光測定を通じて膜タンパク質機能と相関することを示す結果を得ることができます。

この方法は、タンパク質の確認状態の変化が原形質膜を横切る低分子およびイオン輸送をどのように促進するかなど、膜イオン輸送の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。まず、ナトリウムカリウムポンプをxopポスト、Lavis卵子発現に適したベクターにクローニングします。次のステップは、添付の記事で概説されているように、膜貫通ドメインと細胞外ドメインとの間の界面に位置する残基でシステイン変異を作成することです。

終了したら、添付の記事で概説されているように血漿DNAをmRNAに転写した後、DNAシーケンシングによって突然変異の挿入を確認し、手術前に分光光度計を使用してmRNAの収量を定量します。カエルは、手術中の嘔吐を防ぐために12時間絶食する必要があります。翌日から手術を開始するには、カエルがつま先のつま先をつまんでも反応しなくなるまで、カエルを麻酔液に浸します。

麻酔液からカエルを取り出し、おむつのパッドの吸収側に背側を下にして置きます。カエルを湿らせておくために、濡れたペーパータオルをカエルの上に置きます。また、カエルの目が開いている場合は、生理食塩水で湿らせてください。

カエルの正中線の片側に小さなスミック切開を行います。卵巣を見つけて、カエルの外側に持っていきます。卵巣を皮膚に触れないでください。

卵巣を取り出し、リンガー溶液の入ったシャーレに入れます。残りの組織に出血がないか確認してから、スミックキャビティ内に戻してください。出血が発生した場合は、滅菌済みのQチップで止まるまで圧力をかけます。

中断された縫合パターンを使用して切開部を縫合することにより、手術を終了します。カエルをハウジングに戻して、はさみを使用して麻酔から回復します。孤立した卵巣葉を小さな部分に分割します。

塊をリンガー溶液とカルシウムとコラゲナーゼに移します。次に、消化液を18°Cで2時間静かに振とうします。ほとんどの細胞が分離したら、カルシウムを除いたリンガー溶液で卵子を洗います。

次に、卵子をカルシウムを除いたリンゲル溶液で室温で10分間インキュベートします。この時点で、リンガーとカルシウム溶液で細胞を徹底的に洗浄します。次に、卵子をリンゲル溶液とカルシウムに移して保存してから注射します。

次のステップでは、合成されたmRNAをマイナス20°Cの冷凍庫から取り出します。25ナノグラムのmRNAを最終容量50ナノリットルに加えます。次に、注入後にmRNAを細胞に注入します。

卵子をリンガー溶液と1ミリグラム/ミリグラムのゲンタマイシンに入れ、暗所で摂氏18度で3〜7日間インキュベートします。これにより、ナトリウムカリウムポンプを卵母細胞の原形質膜内で発現させることができます。実験当日、卵子をインキュベーターから取り出し、ローディングバッファーに45分間、次にロード後のバッファーに45分間入れます。

これにより、細胞内のナトリウム濃度が上昇し、ナトリウムカリウムポンプの測定が容易になります。蛍光測定では、TMRMやFMなどの目的の蛍光色素を5マイクロモル含むポストローディングバッファーで、暗所で5〜10分間細胞をインキュベートします。フローラ4の標識後、色素フリーのポストバッファーで卵子を徹底的に洗浄します。

卵子を暗くして、写真の漂白を防ぎます。2つの電極電圧クランプ測定の準備として、まずマイクロ電極に3モルの塩化カリウムを充填し、抵抗をテストします。抵抗は0.5〜1.5メガオームである必要があります。

システインスキャン実験には、蛍光顕微鏡に5 35 DF 50励起フィルター、5 65 EFLP発光フィルター、および5 70 DRLPダイックミラーを装備します。次に、オクテを蛍光顕微鏡ステージのRC 10チャンバーに入れます。次に、アンプを使用して両方のマイクロ電極をオクテに静かに挿入し、膜電位を一定の値に保ちます。

溶液交換や膜電位の変更などの適切な手法を使用してタンパク質を活性化することにより、膜を横切るイオンフラックスを測定します。同時蛍光測定では、100ワットのタングステン光源を使用してドナー蛍光色素を励起し、蛍光標識のための蛍光強度の変化を検出するために0 2 2、A photo DDEをピン留めします。システインスキャン後。

P clamp 10ソフトウェアによって制御される電圧ステップを使用して、定常電流での蛍光強度の変化を測定します。プロトコルの 2 番目の部分では、距離測定と並行して anes アトロピー測定を行います。κの二乗値の範囲を計算するために、アトロピーは回転によるフルオロ4の相対的な移動度を測定します。

計算の詳細については、付属の記事を参照してください。距離の制約を測定するには、フルオロ4で標識できる2つのアクセス可能な細胞外システイン残基を持つホロ酵素を使用します。1マイクロモルFMと4マイクロモルTMRMを含むポストローディングバッファーを追加します。

それがドナーとアクセプターです。卵子の1つのバッチに対するフルオロ4は、1マイクロモルFMのみを追加します。それはまさにドナーのフルオロです。

卵子の4つから別のバッチは、卵子の両方のバッチを氷上で暗闇で30分間インキュベートします。これにより、アクセプターフルオロ4の有無にかかわらず標識されたホロ酵素の測定が可能になります。次に、4 75 DF 40励起フィルター、5 30 DF 30 発光フィルター、および 5 0 5 DRLP ダイクロイックミラーを顕微鏡に装備します。

次に、卵子を蛍光顕微鏡ステージのチャンバーに入れます。連続的な溶液の流れを維持することで、アクセプターフローラの存在下と非存在下でのドナー漂白の時間依存性を測定します。4。これらの結果は、フォレスターを利用してナトリウムカリウムポンプの2つの残基間の距離を計算するために使用できます。

式2の電極電圧クランプ測定は、タンパク質が機能していることを確認するために同時に行う必要があります。P clamp 10 の clamp X 機能を使用して、ドナー fluoro four の光破壊の結果を平均化し、少なくとも 4 つの oh サイト記録を行います。タンパク質サブユニットの相対的な動きを測定するには、アクセプターとドナーのフルオロフォーを含むダブルシステインコンストラクトを使用します。

これらの残基での蛍光強度は、タンパク質の確認状態に鈍感であり、2つの4つの間の距離の関数になります。次に、顕微鏡でフィルターセットを4 75 A F 40励起フィルター、5 95 A F 60蛍光フィルター、および5 0 5 DRLPダイクロイックミラーに変更します。次に、OIを蛍光顕微鏡ステージのチャンバーに入れます。

次に、ドナーは100ワットのタングステン光源とアクセプターの蛍光強度で励起されます。フルオロフォーは、電圧リガンドや溶液交換などの適切な方法を使用して測定され、膜タンパク質を活性化すると同時に、蛍光強度の変化を測定します。この図は、細胞膜を横切るイオン輸送と蛍光強度の変化の相関を示しています。

上のトレースは、10マイクロモルと10ミリモルの存在下でナトリウム試験液とカリウム試験液の存在下での電流クランプ測定値を示しています。下のトレースは、電流クランプ測定と並行して測定された蛍光強度の変化を示しています。この図は、TMRMで標識された2つの卵子、アクセプターフルオロ4を示しています。

左側の卵母細胞は野生型のナトリウムカリウムatpaを発現し、右側の卵母細胞はナトリウムカリウムAPAを発現し、1つのアクセス可能なシステイン残基を発現しています。この図の上側のトレースは、電圧パルスに対する過渡電流データを示しています。下のトレースは、電圧パルスによる蛍光強度の変化のリアルタイム記録を示しています。

この図は、アクセプターフルオロ4がない場合とアクセプターフルオロ4がない場合と光漂白がより急速に起こる場合とで測定されるドナー光破壊の時間依存性を示しています。各トレースは、4 つの oh サイト録音の平均です。この図は、確認された変更時の相対的なサブユニットの動きを示しています。

蛍光変化は赤色のトレースに、電流の流れは黒のトレースに示されています。左に示す蛍光強度の増加は、植物相の床が互いに近づいていることを示しています。中央に示されている蛍光強度の変化は、Fluor 4 距離が静止したままであることを示しています。

右側に示されている蛍光強度の低下は、この手順を試みている間にFluor foursがさらに離れて移動することを示しています。速度論的および定常状態の蛍光強度の変化を、タンパク質の確認的な変化と相関させることを忘れないことが大切です。