昆虫に適応運動行動の神経基盤を研究し

この手順の全体的な目標は、脚の筋肉の生理機能を分析することです。さまざまな歩行状況でのつながれた昆虫のタイミングと運動学。ナナフシのラウス縮瞳は、昆虫としては比較的大きく、分節神経節が明確に分離されているため、この研究に使用されます。

まず、動物をつながれ、蛍光ビデオ追跡用にラベル付けします。次に、EMG電極を分度器と開創器の筋肉に配置します。次に、滑りやすい表面での足根接触記録のためのつながれた昆虫の準備が続きます。

手順の最後のステップは、さまざまな歩行状況での脚の筋肉活動と足根骨の接触を同時に記録することです。最終的には、筋肉のタイミングの変化を示す結果を得ることができます。行動の文脈に応じて、脚が使用されます この方法の主な利点は、勉強などの既存の技術よりも優れています。

トレックボールの上を歩くと、地面を通る機械的な結合が取り除かれます。この方法は、運動脚動物の歩行に 1 本の脚がどの程度寄与しているかなど、運動制御の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の意味は、片足レベルでの歩行速度の変化、歩行方向の変化を研究できるようになったため、適応運動行動の分野を開きます。

私の研究室の技術者であるピーター・ボハは、2つのコンポーネントの2ミリメートル幅のストリップを介して互いに絶縁された2つのニッケルコーティングされた真鍮プレートをしっかりと結合しました。エポキシ樹脂は、動物のための滑りやすい歩行面を準備するために使用され、一片の軟組織を使用して導電性のグリセリン生理食塩水混合物でプレートの各半分を別々に潤滑します。正しく適用された場合、溶液は0.1〜0.2ミリメートルの厚さになり、約430センチストークスの表面動粘度を作り出す必要があります。

2つの丸いすりガラススクリーンは、実験中に動物の目から70ミリメートル離れるようにプレートの前に配置されています。これらのスクリーンに動く縞模様が投影されると、動物は前方に歩き始めます。歩行は、ストライプが外側に移動する両方の画面上のプログレッシブパターン、または画面間に配置された白い背景の上の単一の黒いビームによって誘発され、より長い直線的な歩行シーケンスを引き出すことができます。

両方のプログレッシブストライプパターンが同じ方向に移動すると、回転が誘発されます。実験装置が組み立てられたら、動物は歯科用セメントテザーを使用して実験の準備をすることができます、メスの成虫のナナフシの腹側を下にして、ソケット付きの真鍮チューブに取り付けられた細いボルサスティックに乗せます。頭と脚はデルの前面と側面から突き出ており、自由に動くことができます。

次に、歯科用セメントと混合された蛍光顔料を使用して、後で使用するために各脚の頭部胸部と遠位大腿骨および脛骨に印を付けます。ビデオトラッキング。動物の筋肉活動は、胸部に埋め込まれたEMG電極によって記録されます。

信号はプリアンプで100倍に増幅され、次に10倍に増幅され、100ヘルツから2000ヘルツにフィルタリングされてからデジタル信号に変換されます。電極は、接着剤で塗抹された2本の銅線から作られ、その後、互いにねじれ、撚り線の一方の端をミニプラグに販売し、電極が通過するキューティクルに小さな穴を微細なピンパンチを使用してもう一方の端を切断します。筋肉に接触するには、動物がつながれている真鍮管に取り付けられたソケットにワイヤーの一方の端にミニプラグを置きます。

電極の切り口をキューティクルのすぐ下の穴から筋肉に挿入し、各電極の2本のワイヤーが約1mm間隔で別々の穴に配置されるようにします。ワイヤーを所定の位置に保持するために、ヒストアクリル接着剤を少量使用します。もう1本のワイヤーが腹部に挿入され、昆虫歩行の運動学と筋肉生理学との関係を理解するための参照電極として機能します。

歩行中の足根骨の接触は、筋電図記録中に測定され、長さ15センチメートルの銅線の端にある絶縁体をアルコールで燃焼させ、足根骨を流れる電流を測定できます。次に、動物のタスの上をスライドさせ、脛骨の遠位端で締め付けたワイヤーの一端にループが形成されます。次に、ワイヤーを一滴の歯科用セメントで動物の胸部に固定し、動物が接着されている真鍮管のボルサスティックをマイクロマニピュレーターに接続します。

滑りやすい表面から7〜12ミリメートルの高さで動物の高さを調整できるようにするために、これはワニのクリンプを自由歩行中の昆虫の高さに相当します。次に、ワイヤのもう一方の端を差動ロックインアンプに接続します。ワイヤーの導電率を改善するために、接触領域に電極クリームを一滴塗布します その端では、プレートの基部にプラグを使用してプレートをアンプに接続することにより、回路が完成します。

パルス発生器は、これらのプラグを介してプレートの両半分に印加される信号を生成します。プレートからのリード線の1つがアンプに接続され、基準信号として使用されます。動物を所定の位置に置き、ワイヤーを取り付けたところで、その脚がスイッチになり、足根骨に電流が流れてプレートとアンプの間の回路が閉じます。

これにより、接触時のリードタイムが1ミリ秒未満の信号と、リフトオフする遅延信号が生成されます。信号強度は、足根を上下に動かすことによってテストされます。次に、EMGワイヤーがアンプに接続されます。

カメラのトリガー信号は、足根骨の接触とEMGトレースと同時に記録され、トレースのフレームごとの相関が可能になります。これで、動物を所定の位置に置き、すべてを取り付けた状態での歩行シーケンスを記録できます。ビジュアルパターンとビデオ録画は同時に開始され、動きをコントロールとして視覚的に記録します。

毎秒100フレームの高速ビデオカメラを使用して、動物の後ろに45度の角度で配置された鏡を通して、上から脚の動きを記録します。動物が自発的に移動を開始しない場合は、ブラシまたはアンテナへのフグを使用して腹部で刺激することができます。動物上の蛍光マーカーの追跡は、青色LEDライトの配列で動物を照らし、カメラレンズに黄色のフィルターを取り付けることで改善できます。

これにより、活性化光の短波長が抑制され、ビデオにコントラストが加わります。まず、無傷の動物の歩行シーケンスをコントロールとして記録します。視覚刺激を変えると、移動の方向が変わります。

必要に応じて、一対の鉗子で大腿骨をつまんで脚を切断し、動物が30分間回復するのを待ちます。これで、欠損した脚の生理学的役割を評価できます。この画像のドットは、中脚の分度器と開創器の筋肉の電極の位置を示しています。

このEMG調製では、前脚と後脚を取り外して、隣接する脚が中脚の運動学と筋肉活動に及ぼす影響を研究しています。さて、このトレースのデータは回転する動物で、上のトレースは足根の接触トレースを示しています。下のトレースは、開創器の筋肉からのEMGを示しています。

トレース開始時の前進ステップでは、脚が接地している状態でスタンス中にリトラクターが作動します。短いスイッチの後、脚は後退ステップで噛み合い、脚が空中にある間、スイング中にリトラクターがアクティブになります。これは、動物が上を歩いている間に収集されたすべてのデータの完全なビューであり、分度器の筋肉からのEMGトレースです。

中央には開創筋からの筋電図の痕跡があり、その下には足根骨の接触信号があります。挿入図では、ハイスピードカメラで捉えた動物の実際の動きを見ることができます。EMGトレースの交互の活動は、ステップサイクルの2つの筋肉の活動に対応します。

分度器の筋肉は、スイングフェーズの直前と最中に活動し、リトラクターは、タッチダウン後とスタンスフェーズ中に活動します。習得すれば、準備は90分以内に完了し、この手順の後、数時間データを取得することができます。運動学的分析または単一細胞記録のような他の方法は、その開発後にほぼ無傷で行動する動物で行うことができます。

この技術は、運動制御の分野の研究者が、単一の付属物がどのように柔軟で適応的な機関車パターンを生成するかについての問題に対処するのに役立ちました。