動的なマスク投影リソグラフィーを用いたニューラル培養システムのためのマイクロパターンハイドロゲルの作製

本手順の全体的な目的は、神経研究のためのマイクロパターン化されたデュアルハイドロゲル細胞培養システムを作製することです。まず、胚性後根神経節などの組織インプラントを透過性細胞培養インサートに播種します。次に、デジタルマイクロミラーデバイス（DMD）をダイナミックフォトマスクとして使用し、光架橋性ハイドロゲル中にマイクロパターンを作製します。

続いて、解離細胞の懸濁液を含む場合がある、pureのような自己組織化ハイドロゲルを添加します。細胞分析を行う前に、適切なインキュベーション時間が必要です。最終的に、DMDによって定義された特定の幾何学的構成における神経細胞の生存率および神経突起の伸展を示す結果を得ることができます。

本手法の既存の手法に対する主な利点は、ダイナミックなフォトマスクを迅速に作成、修正し、遠隔から投影できるため、透過性セルカルチャーインサートのようなほぼあらゆる基材に対応できる点にあります。この手法は神経系に関する知見を提供できるだけでなく、細胞シグナリング、細胞遊走、細胞間接触、形態形成など、指定可能な幾何学的制約が有用な他の系にも適用可能です。DMDボード、UVライトガイド、および4倍対物レンズは、すべて除振台の上に垂直に設置されています。

倒立顕微鏡を対物レンズの下に配置し、DMDから反射した集光が顕微鏡を通じて可視化されるようにします。DMDのセットアップに関する詳細は、付属の書面プロトコルを参照してください。まず、X説明培養を行うための6ウェルコラーゲンコート細胞培養インサートを準備し、インサートの壁面にRain-Xをコーティングします。この際、メンブレン自体にRain-Xが付着しないように注意してください。

次に、インサートに1.5 millilitersのaian培地を加え、37 °C、5% carbon dioxideで一晩インキュベートします。翌日、E 15ラット胚から胚後根神経節（DRG）を採取し、コラーゲンコートした6ウェルインサートにそれぞれ最大4つのDRGを播種し、37 °C、5% carbon dioxideで2時間インキュベートして、DRGをメンブレンに接着させます。

インキュベーション期間の後、DRGは光重合の準備が整います。デジタルマイクロミラーデバイス（DMD）は、1024×768の個別のミラーアレイであり、ミラーの位置に基づいて光を選択的に反射させます。本手順では、DMDを用いて光CROs（結合可能なハイドロゲル）に紫外線をパターニングし、指定可能なハイドロゲル形状を簡便かつ迅速に作製します。

当社のDMDはスタンドアロンユニットですが、多くの既存の顕微鏡に組み込んで使用することも可能です。まず、インキュベーターからDRGX植物を取り出し、インサート内の余分な液体をすべて吸引します。次に、インサートの内側に500 µLの重合培地を加えます。

DRGX植物が入ったインサートをレインエクスガラススライドに転送し、スライドをDMDの下に配置します。ALP 3 basic グラフィカルユーザーインターフェースプログラムを使用して、フォトマスクとして使用する白黒画像をDMDにロードします。本例では、倒立顕微鏡とDI可視光光源を用いて神経突起誘導システムを実装するため、分枝状の形状を選択しました。

DMDで反射する光をガイドとして、組織切片をフォトマスクの適切な位置に合わせて配置します。次に、可視光光源をUV光源に切り替えます。細胞培養液中の重合媒体を照射します。

PEGの架橋が完了するまでインサートを浸します。インサート上の各DRGについてこの操作を繰り返します。その後、1% penicillin streptomycinを含む滅菌済みリン酸緩衝生理食塩水で、各インサートを3回洗浄します。

最後に、細胞培養インサートの下に1.5 millilitersの増殖培地を加え、37 degrees Celsius、5%carbon dioxideの組織培養インキュベーター内で30分間平衡化させます。インキュベーションの間、純粋なマトリックスを30分間ソニケーションします。ペプチドを可溶化させるため、提供された1%solutionを滅菌水で0.15%に希釈し、1 microgram per milliliterの可溶性ラミニンを添加します。

30分後、培養物をインキュベーターから取り出し、インサート内の余分な培地をすべて吸引して除去します。次に、顕微鏡下で空隙を確認しながら、DRGXエクスプランを含むPEG構造体の空隙内から培地を吸引し、Xエクスプラン周囲の空隙に純マトリックス溶液を約1 µLピペッティングします。純マトリックスがPEG空隙から溢れないように注意してください。

次に、インサートの下に成長培地を1.5 milliliters分ピペッティングし、37 °C、5% carbon dioxideに設定した組織培養インキュベーターに1時間置きます。この時間経過後に完全な接着を確認するため、成長培地を交換し、再び培養物をインキュベーターに戻します。成長培地は培養開始後48時間ごとに交換します。

DRGX植物を含むデュアルハイドロゲル構築物の例をここに示します。DRGX植物は、成長および増殖マーカーで標識されています。重合したPEG構築物は灰色に、beta three tubulinで標識されたDRG NEURITESは緑色に、そしてDPI染色は細胞核を青色に染めています。

細胞の遊走とレチクールの伸展が、デュアルハイドロゲル構造体の細胞許容領域に限定されていることに注意してください。デュアルハイドロゲル封入は、自己組織化ゲルと光架橋可能ゲルを併用する場合に適しています。この例では、PEGが自己組織化ゲルの幾何学的提示のための構造的支持体として機能します。

例えば、ピュアマトリックスやarisなどが挙げられます。ゲルの種類およびフォトマスクの選択は、目的とする具体的なアプリケーションによって異なります。ポリエステル製セルカルチャーインサートの壁面を、既報の手法に従ってRain-Xで処理します。

インサートをRain-Xコーティング済みのスライドガラスに転送し、DMDの下に配置します。次に、ポリマー化培地500 µLをインサートに加えます。今回の生存実験に適したマスクをDMDにロードしてください。

細胞のイメージングを補助するために、純粋なマトリックスの円筒形プレゼンテーションを使用します。架橋後、インサートを55秒間UV光に曝露し、PEGの架橋を誘導します。新たに形成された空隙を、滅菌DPBSおよび1% pen strepで洗浄します。

マイクロピペットまたは滅菌綿棒を使用して、ボイドから余分な液体をすべて取り除きます。純粋なMatrixxは、30分間超音波処理を行い、滅菌水で0.15%に希釈し、1 µg/mLの可溶性ラミニンと10%スクロースを添加して調製します。次に、培養する細胞を遠心分離してペレット化します。

細胞ペレットから培地を完全に吸引除去し、0.15% pure matrix溶液を用いて、細胞濃度が約5×10³ cells/mLになるようにペレットを再懸濁します。pure matrixは塩溶液に接触すると自己組織化が始まるため、細胞ペレットからすべての培地を吸引除去することが極めて重要です。次に、補充されたpure matrix細胞混合液を約1 µL、ペグの空隙にピペッティングします。

この容量は、通常、ピペットで1.5 millilitersの増殖培地をインサートの下に加えることで、オーバーフローさせることなく空隙を十分に満たすことができます。次に、純マトリックス二次ハイドロゲルを37 degrees Celsius、5%carbon dioxideの組織培養インキュベーターに1時間置き、完全にゲル化させます。その後、培地を吸引し、インサートの下に新鮮な培地を加えます。この際、機械的に脆弱な純マトリックスを損傷させないよう注意してください。

培養物を組織培養インキュベーターに戻し、培養開始から48時間ごとに培地を交換します。以下は、さまざまなデュアルハイドロゲル構造体内に封入された生存DRGニューロンの例です。増殖培地で48時間培養した後、細胞を緑色に発色する生細胞マーカーであるカルシウムamで標識しました。

ここでは、DMDフォトマスクのダイナミックな特性により、封入可能な形状は光学系の寸法と分解能によってのみ制限されます。細胞を光架橋可能なハイドロゲルの内部で、ポリエステル細胞培養に近い状態で観察できる場合に、単一のハイドロゲル封入が適しています。Rain Xを塗布して挿入し、Rain Xでコーティングしたスライドガラスの上に置いてDMDの下に配置してください。

前述と同様に、培養する細胞を目的の濃度で重合培地に直接ピペッティングし、均一に分散するように十分に混合します。次に、細胞を含む重合培地500 microlitersをインサートにピペッティングします。適切なマスクを選択してDMDにロードし、UV光を55 seconds照射してPEGの架橋を誘導します。

細胞生存率試験では、円筒形を模した基本的な円形マスクを使用します。インサートを滅菌済みDPBSおよび1% pen strepで3回洗浄し、次にインサートの下に1.5 millilitersの増殖培地を、上部にはインサートが完全に浸る十分な量の増殖培地をピペッティングします。37 degrees Celsius、5%carbon dioxideの条件下でインキュベートし、48時間ごとに培地を交換します。ここでは、PEG内部に封入された生きた解離皮質ニューロンの例を示します。生細胞はcalcium amでラベルされ緑色に、死細胞はahy homodimer oneでラベルされ赤色に表示されます。

PEGによるカプセル化はあくまで例として提示したものであり、PEGが神経細胞にとって理想的な環境であるとは限りません。選択した形状は細胞生存率を研究するための簡便な手段ですが、幅広い構造に適応させることが可能です。薄膜ハイドロゲルを使用することで、細胞の制限された特定のパターンを作成することができます。

前述と同様に、ポリエステル製細胞培養インサートをRain Xで処理し、Rain X処理済みのスライドグラス上に配置します。次に、処理済みの細胞培養インサートの底部に重合培地を 250 to 300 µL ピペッティングします。この量でインサートの底部を十分に覆うことができます。室温で 30 to 45 分間インキュベートし、培地をインサート膜に浸透させた後、マイクロピペットでインサートから余剰な培地を吸引します。

次に、UV透過オイルをインサートの底部に、領域全体を完全に覆うのに十分な量ピペッティングします。インサートを室温で15〜30分間インキュベートし、重合媒体の上にオイルが明確な層を形成するまで待ちます。インサート膜を飽和させ、DMDに適切なマスクをロードします。

インサートとスライドをDMDの下に配置した後、UV光を照射してPEGの架橋を誘導します。インサートを滅菌済みのDPBSおよび1% pen strapで3回洗浄し、洗浄後、インサートを6ウェル組織培養プレートに移して、培養する細胞を回収し、ペレット化します。培地を吸引し、細胞ペレットを10⁴から10⁶ cells/mLの所望の濃度になるよう増殖培地で再懸濁します。

次に、目的の細胞密度になるように、十分な量の細胞懸濁液を細胞培養インサート内にピペッティングします。細胞の生存能を完全に維持できるよう、インサートの下に十分な量の増殖培地を加えます。37 °C、5% carbon dioxideの条件下で48時間インキュベートします。

インサートを滅菌済みのDPBSおよび1% pen strepで3回洗浄し、付着していない細胞を除去します。次に、ウェルに新鮮な増殖培地を加えます。プレートを組織培養インキュベーターに戻し、48時間ごとに培地交換を行います。

ここでは、透過性サポートのコラーゲンコーティング膜に解離細胞を選択的に接着させるため、テストパターンを用いて細胞制限性PEGを薄膜として重合させました。48時間のインキュベーション後に細胞を標識しました。Calcein-AMで標識された生存細胞は緑色に、Ethidium homodimer-1で標識された死細胞は赤色に表示されます。

薄いPEGフィルムを含む領域では、細胞の接着がほとんど見られないことがわかります。これは好ましくない結果の一例です。PEGの部分的な重合により、使用不可能なPEG構造体が形成されました。

プレポリマー媒体にメニスカスが存在する場合や、重合媒体の量が不十分な場合、またUV照射不足や光学系の焦点が不適切な場合に、不適切な重合が起こる可能性があります。これは、A-D-R-G-X植物培養の不適切なデュアルハイドロゲル3D封入の例です。この画像では、緑色に見えるニューライトがパターン化されたペグチャネルの外まで成長してしまっていることがわかります。

これは多くの場合、注入中に純粋なマトリックスがPEG部分の上に溢れ出した際に発生します。本手順に従ってください。電気生理学的特性や表現型発現などの追加的な疑問を解決するためには、パッチクランプ法や免疫組織化学染色などの他の標準的な手法を実施することができます。

このビデオを視聴することで、神経細胞培養の研究において、シングルまたはデュアルハイドロゲルシステムの幾何学的提示を指定するためのダイナミックマスク投影フォトリソグラフィーの使用方法について、十分な理解を得ることができます。