非対称受容体のパターンでセルローリング軌道を勉強
2011年2月13日
我々は、非対称受容体柄の基板上にセルローリング軌跡を観察し、分析するためのプロトコルについて説明します。結果のデータは、ラベルフリー細胞分離と解析のための受容体柄の基板のエンジニアリングするのに便利です。
本プロトコルでは、非対称な受容体パターン上の細胞ローリング軌跡を観察および分析し、ラベルフリーの細胞分離および分析に向けた受容体パターン基板のエンジニアリングを促進します。まず、金基板上にPEG分子をマイクロコンタクトプリンティングし、自己組織化単分子膜の交互パターンを作成した後、基板にP-selectin受容体をバックフィルします。次に、この基板をフローチャンバーに組み込みます。その後、HL-60細胞をチャンバー内に流します。
P-selectinパターン上でのHL 60細胞のローリング相互作用の画像シーケンスを記録し、ビデオから変換した画像を解析します。MATLABプログラムを用いることで、ローリング細胞のエッジトラッキング軌跡、長さ、および平面、領域、エッジにおけるローリング速度を得ることができます。この手法により、剪断流においてHL 60細胞が非対称受容体パターン上をどのように移動するかについての知見を得ることが可能です。
本手法は、他の細胞表面相互作用の定量化や、受容体パターン上の軌跡を観察することによる細胞の直接解析に適用可能です。また、細胞分離のためのマイクロフッティングデバイスの設計にも利用できます。金基板上にPEG分子の自己組織化単分子膜の交互パターンを作成するために、マイクロコンタクトプリンティングが用いられます。
まず、エタノールに溶解した5 mMのPEG溶液でPDMSスタンプにインクを付けます。表面を20分間乾燥させます。スタンプを金表面に40秒間そっと押し当て、金表面とスタンプが十分に接触していることを確認してください。
過剰な圧力は必要ありません。表面をエタノールで洗浄し、窒素気流下で乾燥させます。次に、灌流チャンバーを用いて、基材を15 µg/mLのP selectin溶液中で室温にて3時間インキュベートし、残りの領域にP selectinをパターニングします。チャンバーを洗浄した後、非特異的な相互作用をブロックするため、1 mg/mLのBSAで表面を1時間バックフィルします。
細胞ローリング実験を行う前に、表面をDPBSバッファーで洗浄します。フローチャンバーを組み立て、その後、10⁵ cells/mLのHL-60細胞懸濁液を、受容体パターンの傾斜角が10度である矩形フローチャンバー内のパターン表面に流します。
室温24.5 °Cにて。シリンジポンプを調整し、流速75 µL/min、それに相当する層流せん断応力0.5 dyn/cm²に設定します。次に、倒立顕微鏡と装着したカメラを用いて、HL 60のローリングを記録します。
接着性p-セレクチンおよび基質との相互作用。4倍の対物レンズを使用し、1秒間に1フレームの速度で300秒間撮影する。独立した実験を3回行う。
データは、各実験から得られた平均値の平均値および標準偏差として提示してください。顕微鏡画像は、HL 60.Rollingのビデオから変換したものです。接着性P-selectinおよび基質との相互作用により、P-selectin受容体領域とPEG領域にそれぞれ対応する明域と暗域が示されています。
ここでは、カスタマイズしたMATLABプログラムを使用してトラックを記述しています。エッジ傾斜角は10度、せん断応力は0.5 dines per centimeter squaredでした。さらに、エッジトラッキング長の分布、エッジトラッキング長の平均値、ならびにバンドのエッジおよび内部における回転速度であるVEおよびVPについて解析を行いました。
このビデオを視聴することで、非対称な受容体パターンにおける細胞の軌跡を調べる方法について十分に理解できるはずです。
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概要
本プロトコルでは、非対称な受容体パターン上での細胞ローリング軌跡を観察および分析し、ラベルフリーの細胞分離および分析に向けた受容体パターン基材のエンジニアリングを促進します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- バイオマテリアル
- マイクロ流体デバイス
背景
- 細胞のローリングは、さまざまな生物学的相互作用において重要なプロセスです。
- 非対称な受容体パターンは、細胞の挙動に影響を与える可能性があります。
- ラベルフリー技術は、細胞の分離および解析に不可欠です。
- マイクロコンタクトプリント法は、パターン化された基板を作成するための有用な手法です。
研究目的
- 受容体がパターン化された基板上での細胞ローリングを観察するためのプロトコルを開発する。
- 基板エンジニアリングの改善に向けて、ローリング細胞の軌跡を解析する。
- 流れ条件下における細胞移動のダイナミクスに関する知見を提供する。
使用方法
- 金基板上へのPEG分子のマイクロコンタクトプリンティング。
- 自己組織化単分子膜による交互パターンの作成。
- P-selectinおよび受容体による基板のバックフィリング。
- フローチャンバーへの組み込みと、パターン上でローリングするHL-60細胞のイメージング。
主な結果
- HL-60細胞の相互作用のイメージシーケンスを記録した。
- ローリング細胞の軌跡をMATLABを用いて解析した。
- エッジトラッキング距離およびローリング速度に関するデータを取得した。
- 非対称な受容体パターン上における細胞移動に関する知見を得た。
結論
- このプロトコルにより、細胞のローリングダイナミクスの詳細な解析が可能になります。
- 効果的な細胞分離のために、非対称な受容体パターンを構築することができます。
- 本手法は、剪断流における細胞挙動の理解に寄与します。
よくある質問
産業界における重要性
非対称な受容体パターン上での細胞のローリング軌跡を理解することで、ラベルフリーのマイクロ流体分離デバイスの合理的な設計が可能になります。本プロトコルでは、規定のせん断応力下におけるエッジ追跡長とローリング速度に関する定量的なデータを提供し、流れの中での細胞挙動の予測モデリングを支援します。このような知見により、細胞精製および表現型解析ワークフローに向けたデバイスエンジニアリングにおける経験的な反復試行を削減できます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- 科学的価値：生理的なせん断条件下でのリガンド-受容体結合キネティクスの解析を可能にし、接着介在性経路のターゲットバリデーションに有用な情報を提供します。
- 実用的価値：蛍光タグや遺伝的レポーターを用いることなく、機能的な受容体活性を評価できるラベルフリーの手法を提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 受容体密度やパターンの形状による比較分析のために、細胞のローリング速度およびエッジトラッキング長の定量的リードアウトを生成します。
- 運用的価値： マイクロコンタクトプリンティングによる基板作製とフローチャンバーの統合を標準化し、再現性の高い接着アッセイを実現します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 受容体パターンの設計と観察可能な細胞の軌跡の結果を関連付けることで、接着ベースの分離戦略におけるメカニズム的なリスク低減を支援します。
- 運用上の価値： ローリング挙動に基づいた細胞表現型のスクリーニングを可能にし、前臨床モデルにおけるサブポピュレーションの濃縮に有用です。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、特に流れ条件下での接着が機能的なリードアウトとなる標的に対して、アッセイ開発および前臨床ツールの作製に寄与する初期探索段階に適しています。
- 探索生物学：剪断流における受容体-リガンド相互作用の仮説検証を容易にし、細胞ローリングへのメカニズム的な寄与を明らかにします。
- スクリーニング：標準化された定量的な接着指標を提供し、細胞株や受容体調節剤の比較を可能にします。
- 分析：エッジトラッキング長とローリング速度の分布を出力し、条件比較のための統計的根拠を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroのローリングダイナミクスを、前臨床サンプルの処理に向けたラベルフリー細胞分離デバイスへの潜在的な有用性に結びつけます。
- 企業における再利用：複数の標的および細胞型にわたる接着介在性細胞挙動を評価するための、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：制御されたせん断条件下で軌道パラメータを定量化することにより、接着ベースの分離メカニズムにおける予測信頼性を向上させます。
- 運用的価値：標準化されたマイクロコンタクトプリンティング、受容体のバックフィリング、およびフローチャンバーのセットアップを通じて再現性を確保します。
- 戦略的価値：受容体パターンの初期段階での機能検証を可能にすることで、デバイス開発における後期の生物学的リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響：パターンの性能に関する経験的データを提供することで、マイクロ流体分離技術のゴー/ノーゴー判断を支援します。
実施上の検討事項
- マイクロコンタクトプリンティング、表面化学、およびマイクロ流体フロー制御の専門知識が必要です。
- 倒立明視野顕微鏡、高速カメラ、およびMATLABベースの粒子追跡ツールの利用が前提となります。
- 複数拠点での再現性を確保するため、基板作製およびフロー条件の報告に関するチーム間の標準化が必要です。
- 他の細胞タイプに適応させるには、リガンド-受容体ペアの検証および剪断応力パラメータの最適化が必要です。
- 細胞端の相互作用が一時的であるため、全軌跡の再構成が制限され、セグメント化された解析が必要となります。
