二分子蛍光相補
April 15th, 2011
タンパク質の細胞内局在は、細胞シグナル伝達の時空間制御を決定する上で重要です。ここで、我々は、細胞内のタンパク質の空間的な相互作用を監視するための簡単な方法として、二分子蛍光相補（BiFC）を記述する。
この実験は、2つのタンパク質が細胞内で相互作用するかどうかを定義し、その相互作用の部位の側面を描写することを目的としています。まず、目的の2つのタンパク質をコードする発現コンストラクトをトランスフェクションし、そのうちの1つは断片化された蛍光タンパク質の末端に融合し、もう1つは断片化された蛍光タンパク質の相補的なC末端に融合します。トランスフェクションした細胞を培養中で蛍光シグナルを発現させた後、イメージングおよび免疫ブロッティングによりタンパク質複合体を可視化します。
次に、収集された画像は、Image Jなどのイメージングソフトウェアにエクスポートされます A制御実験で細胞あたりの平均蛍光強度を定量化するために、BIFCの結果は、タンパク質タンパク質の相互作用と、交差する足場タンパク質のSH3ドメインやPI3KC2ベータのプロリッチドメインなど、これらの複合体の局在を示すことができます。この手法が共局在化、免疫沈降、フレットなどの既存の方法よりも優れている点は、BFCが細胞内の弱い一過性相互作用の空間的な局在化を可能にすることです。また、この方法では、フレットで見られるような大規模な後処理画像は必要ありません。
この方法は、DOタンパク質XとYの相互作用など、シグナル伝達の領域における重要な問題に対処でき、もしそうなら、これらの複合体が細胞内で局在する特定のコンパートメントは何か?一般的に、この方法の初心者は、生検を発現するための適切な構成を選択していないため、苦労します。目的のタグ付きタンパク質 まず、BIFC融合タンパク質用の複数の蛍光色素から1つを選択します。
金星のアミノとカルボキシの末端は摂氏37度で複合体を形成することができますが、Y-F-P-B-I-F-Cフラグメントは摂氏30度で事前にインキュベーションする必要があります。BIFCフラグメントの付着が目的タンパク質の機能にどのように影響するかを考慮することにより、目的タンパク質へのタグ付加の発現ベクターを設計します。例えば、RAファミリーであるGTP aは、カルボキシ末端で脂質修飾されており、この修飾を中断することなく、この末端でタグ付けすることはできません。
トランスフェクション条件を決定するために、常にパイロット実験を実施してください。また、蛍光顕微鏡で細胞をモニターし、シグナル発生の最適な時期を特定します。次に、ウェスタンブロッサム解析を実行して、コンストラクトの均等な表現を確認します。
重要なのは、HAまたはフラッグタグの免疫染色を行い、BIFCフラグメントの添加によって各サンプルプレートの標的タンパク質の細胞局在が変わらないことを確認することです。5つの原因細胞のうち10の1.3倍を、それぞれ1つのガラス製ボトムマタープレートと6ウェルプレートの2つのウェルに含み、翌日、細胞を摂氏37度のインキュベーターで一晩沈殿させます。脂肪切除術または他の好ましい方法によるトランスフェクション用のDNAを調製します。
まず、トランスフェクションコントロールとして、DNAを250マイクロリットルの無血清DMEMで希釈します。CFPを1つの50、つまりBIFC DNAの総量で追加します。次に、DNA1マイクログラムあたり10マイクロリットルの唇を使用して、250マイクロリットルの無血清DMEMで唇を希釈します。
DNAとリップ希釈液を混合し、室温で20分間インキュベートします。温かい無血清DMEMで細胞を2回すすぎます。2ミリリットルの無血清DMEMを各ガラス底板または6ウェル皿のウェルに加えます。.
次に、各トランスフェクション混合物を1つのガラス底皿と6個のウェル2個に均等に分割します。ウェルプレートは、細胞を摂氏37度で5時間インキュベートします。最後に、トランスフェクション培地を取り出し、完全なDMEMと10%FBS培地と交換します。
パイロット実験で決定された時間だけ細胞をインキュベートし、目的のタンパク質の必要な発現レベルを取得します。トランスフェクションした細胞をエピ蛍光顕微鏡で観察し、ポジティブコントロールが蛍光性であることを確認します。細胞をPBSで3回すすぎ、生細胞イメージングを行います。
インジケーターダイスのないメディアにセルを置きます。固定細胞のイメージング用。2%パラホルムアルデヒドを加え、氷の上に10分間置きます。
次に、1ミリリットルのPBSで覆われたPBSで細胞を3回すすぎ、摂氏4度の暗闇で保存し、すぐに6つのウェルディッシュで細胞を溶解します。ウェスタンブロット解析では、lys細胞が画像細胞を代表するように、すべての細胞を同時に調製することが重要です。ウェスタンブロットを行い、タグタンパク質が同等のレベルで発現していることを確認します。
共焦点顕微鏡で細胞をイメージングする場合、サンプル間で蛍光が同等になるように、実験全体で設定を一定に保つことが重要です。ピクセルが飽和していない個々のセルを必ず画像化してください。トランスフェクションコントロールとしてCFPが含まれていたため、BIFCシグナルの解析にはCFP陽性細胞のみを選択してください。
Image J.Open image files in Image J.Go などのイメージングソフトウェアを使用して蛍光を定量化し、セット測定値を解析します。計測ボックスの面積と平均グレー値のチェックボックスをオンにします。この例では、静脈画像は疑似色緑、CFP画像は疑似色赤であることに注意してください。
フリーハンド選択ツールを使用して、CFP チャネル内のセル全体のエッジの周囲にアウトラインを描画し、このアウトラインをそのままにします。YFPチャネルにシフトします。分析に移動し、各画像の細胞あたりの平均蛍光強度を反映した平均グレー値を測定します。
YFP チャネルのセルを含まない領域に円を描きます。この領域を背景として測定します。各画像から背景を減算します。
最後に、細胞集団の平均蛍光強度を計算するには、1つのサンプルでイメージングされたすべての細胞の平均グレード値を平均化してバックグラウンドを差し引いた値にします。理想的には、3回の実験で60個の細胞を定量します。交差するマルチドメイン足場タンパク質は、新規のクラス2 PI 3キナーゼの調節を通じてニューロンの生存を制御し、PI 3 KC 2 β交差SH 3ドメインは、PI 3 KC 2βタグのアミノ末端プロリンリッチ領域と相互作用し、VCタグ付きPI 3 KC 2βと交差するVNのトランスフェクションは、YFPチャネルで蛍光シグナルを生じます。 これは、複雑な形成を示す疑似色の緑色です。
ここで赤で擬似的に着色されたCFPは、PI 3 KC 2ベータのプロリンリッチドメインにおけるトランスフェクション細胞の突然変異をマークするためのコントロールとして使用され、交差する共沈とPI 3 KC 2ベータの共沈を妨害し、BIFCシグナルを減少させます。BIFCシグナルのこの違いは、野生型とPA PIの3つのKタンパク質の発現の違いによるものではありません。一度習得すると、この手法は適切に行われれば3日で実行できます。この手順を実行する際には、適切なコントロールを実行し、タンパク質の発現をチェックして、BCシグナルの違いがこの手順後の発現によるものではなく、複合体形成の違いによるものであることを確認することを忘れないでください。
レジデント上の表面プラズマなどの他の手法は、これらの複合体の相互の異なる親和性が何であるかなどの質問に答えるために実行できますか?
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概要
この研究は、細胞内のタンパク質相互作用と局在をモニターする方法として、二分子蛍光補完（BiFC）を提示しています。BiFCを使用することで、研究者はタンパク質の相互作用を視覚化し、簡単な方法で定量化することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞シグナリング
- タンパク質相互作用
- 蛍光顕微鏡法
背景
- タンパク質の局在を理解することは細胞シグナリングにとって重要です。
- BiFCは生細胞内でのタンパク質相互作用の視覚化を可能にします。
- この方法は一過性の相互作用を研究するのに有利です。
- 従来の方法では広範な後処理が必要な場合があります。
研究の目的
- 細胞内の2つのタンパク質間の相互作用を決定すること。
- これらの相互作用の特定の部位を特定すること。
- タンパク質複合体の視覚化のための信頼できる方法を提供すること。
使用された方法
- 2つのタンパク質の表現コンストラクトによる細胞のトランスフェクション。
- 1つのタンパク質は断片化された蛍光タンパク質と融合されます。
- タンパク質複合体を視覚化するためのイメージングと免疫ブロッティング。
- イメージングソフトウェアを使用した蛍光強度の定量化。
主要な結果
- 細胞内でのタンパク質相互作用の成功した視覚化。
- タンパク質複合体の局在の同定。
- 従来の方法に対するBiFCの利点の証明。
- 特定のタンパク質ドメインの相互作用に関する洞察。
結論
- BiFCはタンパク質相互作用を研究するための効果的な方法です。
- この技術はタンパク質の局在に関する理解を深めます。
- 既存の方法よりも簡単な代替手段を提供します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) enables direct visualization of protein-protein interactions and their subcellular localization, addressing a critical gap in spatially resolved target validation. This capability enhances predictive confidence in early discovery by distinguishing true molecular interactions from background, supporting robust mechanistic de-risking. BiFC's strengths in detecting weak or transient complexes make it a valuable asset for portfolio triage and early-stage decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially resolved interrogation of protein-protein interactions within live cells.
- Supports functional target validation by confirming interaction specificity and compartmentalization.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing direct interactions from co-localization artifacts.
- Improves predictive confidence for advancing targets through the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for downstream screening of interaction modulators.
- Delivers quantitative fluorescence outputs for standardized assay development.
- Reduces post-processing requirements compared to FRET, streamlining workflow scalability.
- Enables reliable detection of weak or transient interactions for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by mapping interaction localization in physiologically relevant compartments.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by confirming molecular mechanisms in situ.
- Provides risk-adjusted data for translational biomarker development when supported by interaction specificity.
- Enhances predictive de-risking for preclinical candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
BiFC integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical research, providing a reusable platform for spatially resolved interaction analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing specific protein complexes in live cells.
- Screening: Offers reproducible, quantitative fluorescence readouts for assay standardization and compound screening.
- Analytics: Enables measurement of average fluorescence intensity per cell, supporting comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects molecular interaction data to disease-relevant compartments, informing biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Functions as a broadly applicable capability for diverse protein interaction studies across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows with minimal post-processing.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell transfection, and fluorescence imaging.
- Needs access to confocal microscopy and quantitative imaging software (e.g., ImageJ).
- Demands rigorous control experiments for expression validation and tag localization.
- Must consider tag placement to avoid disrupting protein function or localization.
- Limited by irreversible fluorophore reconstitution and lack of real-time kinetic analysis.
