Name: 二分子蛍光相補 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学ぶ二分子蛍光相補法を用いた細胞内タンパク質相互作用の可視化と局在解析。分割蛍光タンパク質を融合させた標的タンパク質を発現させ、蛍光再構成による相互作用の空間的検出を行う。

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ITSN、このプロトコルで使用されるPI3K -C2β、およびコントロールベクターは、非商用目的のみのため、ご要望に応じて、著者から入手できます。著者は、親切にアドバイスとオブライアンの実験室でBiFCプロトコルの確立に使用される試薬を提供するために博士はチャントウ胡を認識したい。カーは、財団ジェロームルジューンからの資金によってサポートされていました。オブライアンの実験室での作業は、NIH（HL090651）、DOD（PR080428）、聖剣帯の財団、及び財団ジェロームルジューンからの補助金によってサポートされています。

A. BiFCキャリブレーション<ol><li> 蛍光体を選択してください。BiFC融合パートナー（表1）としてうまく機能などYFPや金星など、複数の蛍光体が、、ある。 YFP BiFCフラグメントは蛍光体の形成2を容易にするために30℃でプレインキュベーションを必要としながら金星のアミノおよびカルボキシ末端の末端は、37℃での複合体を形成することが可能です。低い温度でこのインキュベーションは、いくつかの細胞プロセスを変更することがありますし、フラグメントを選択する際に考慮する必要があります。タンパク質のカルボキシ末端に融合させる金星のためのベクターは、Addgene（から入手できます<a href="http://www.addgene.org/pgvec1">http://www.addgene.org/pgvec1</a> 、コントロールとして使用するための構造体が追加、などと一緒に、seepBiFC - VN173とpBiFC - VC155） <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC - bJunVN173</a>とpBiFC - bFosVC155 2。アミノ末端金星のベクトル（pFLAG - VN173およびPHA - VC155）を含む追加のベクトルは、、以下のサイトから入手できます。 <a href="http://people.pnhs.purdue.edu/%7Ehu1/">http://people.pnhs.purdue.edu/〜HU1 /</a> 。 </li><li> 目的のタンパク質にタグを付ける。BiFC断片が候補タンパク質のアミノまたはカルボキシ末端の末端に融合されています。いくつかのタンパク質は、タンパク質の機能の破壊が原因でどちらかの端にタグ付けを可能にしない場合があります。例えば、GTPアーゼのRasスーパーファミリーの多くのメンバーは、その端にBiFCフラグメントの添付ファイルを排除ので、カルボキシ末端に脂質を変更されます。従って、BiFCフラグメントの添付ファイルは目的のタンパク質の機能に影響を与える可能性のある方法のいくつかのアイデアを持っていることが重要です。それは蛋白質がどう影響するかタギング不明な点などがその機能を複数の組み合わせをテストする必要があります。 BiFC断片に加えて、ペプチドリンカーは、断片化された蛍光団との候補タンパク質の間に柔軟性を高めるために含めることができます。十分な柔軟性を提供することができる短いアミノ酸のストレッチをエンコードBiFCベクトルのマルチクローニングサイト（MCS）一方で、RSIAT、KQKVMNH、およびRPACKIPNDLKQKVMNHリンカーはBiFC実験3,9で正常に使用されている</li><li> トランスフェクション条件を決定します。複数の変異をテストする前に、いくつかの制御実験を行う必要があります。試行すべき最初の二つBiFCの組み合わせは、対話と相互作用しない1つの野生型と変異することが知られている2つの野生型タンパク質である。これらの2つの組み合わせを使用して、DNAとトランスフェクション時間の異なる量は、候補タンパク質のBiFC信号を検出するための最適条件を決定するためにテストする必要があります。我々は、6ウェルディッシュのほか、単一のために各BiFC構造の0.25ug、0.5ug、1.0ugをテスト示唆している。信号の開発のための最適な時間を決定するために蛍光顕微鏡法によるトランスフェクションモニター細胞の翌日。 <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC - bJunVN173</a>とpBiFC - bFosVC155 2の構造はBiFCのための有用なポジティブコントロールであるとAddgene（上記参照）から入手できます。さらに、ウエスタンブロット分析は、構造の同じ表現を確認するために実行する必要があります。条件は、蛍光シグナルは、2つの野生型タンパク質の間に観察されているが、無信号にはほとんどが野生型と変異体タンパク質との間で観察されるように選択しなければなりません。最後に、これは非特異的な相互作用を防ぐために、可能な限り低くタンパク質の発現を維持するのが最善です。 </li><li> BiFCフラグメントの添加は、目的タンパク質の局在を変化させるかどうかを調べます。各BiFC構造はどちらHAまたはFLAGエピトープタグを含む。免疫染色では、HAまたはFLAGエピトープタグと同様にBiFCタグが目的タンパク質の局在に影響を与えるかどうかを判断するためにも内因性タンパク質（可能な場合）の両方の細胞をtransefected。 </li></ol>セルのB.播種とトランスフェクション<ol><li> COS細胞（1.3 × 5）1つのグラスの底Matekプレートおよびサンプルあたり6ウェルプレートの2ウェル上、それぞれのメッキが施されています。細胞は一晩37℃を解決することができます関心の候補タンパク質に関連性の高い代替細胞型を使用してもよい。 </li><li>トランスフェクション用のDNAを準備します。我々は通常、COSのトランスフェクションのためにリポフェクトアミン（Invitrogen）を利用する。しかし、他の試薬は、関心の細胞株に対してより適切かもしれない。トランスフェクション混合物を1つのグラスの底皿と6ウェルプレートの2ウェルの間で分割されるので、この区分を考慮してDNAの適当な量を使用してください。無血清（SF）DMEMの250uLでDNAを希釈する。トランスフェクションのコントロールとして合計BiFCのD​​NAの1 / 5量でCFPを追加。 BiFC定量では、CFPのために陽性の細胞のみがBiFC信号の存在について分析されます。したがって、代替のトランスフェクションのコントロールを、CFPのスペクトルは、表1のBiFCペアの一部と重なることに注意してください多分必要。 250uL SF DMEM（DNAの10uL Lipofectamine/1ug）にリポフェクタミンを希釈する。 DNAとリポフェクトアミンの希釈液を混ぜる。 20分室温でインキュベートする。 注：リポフェクタミン：DNA比は細胞の種類によって異なりますができます。興味の細胞株に適したトランスフェクション法を使用してください。 </li><li>暖かいSF DMEMで2倍の細胞をすすいでください。各グラスの底板または同様の6ウェルディッシュにSF DMEMの2mLのを追加。 </li><li>のガラスボトムディッシュ、6ウェルディッシュの二つの井戸間で均等にそれぞれのトランスフェクション混合物を分割する。 </li><li> 5時間、37℃で細胞をインキュベートする。 </li><li>トランスフェクションのメディアを取り出して、（DMEM +10％FBS）の完全なメディアと交換してください。 </li><li> 37℃で一晩細胞をインキュベート℃をインキュベーション以下のトランスフェクションの長さは、目的のタンパク質の発現レベルによって異なります。このステップは経験的に決定する必要があるので、長時間のインキュベーションでは、非特異的な相互作用が発生する可能性があります。 </li></ol>イメージングのための細胞のC.の準備<ol><li>細胞は、最初に陽性コントロールが蛍光であることを保証する落射蛍光顕微鏡で検査されています。そうでない場合、それはシグナルが観察されるまで37℃で細胞をさらに時間を許可する必要があるかもしれません。 </li><li> PBS（pH7.4）で3倍の細胞をすすいでください。ガラスボトムディッシュ中の細胞に2％のパラホルムアルデヒド（pH7.4）を加える。氷上で10分間細胞を固定する。 PBS（pH7.4）で3倍の細胞をすすいでください。 4℃店舗細胞° C 1mLのPBS（pH7.4）で覆われた。細胞は、イメージングのために固定する必要はありませんが、一度BiFCの断片をそのまま蛍光団を改革し、それはこのようにダイナミックな相互作用3の解析を防止する不可逆的です。また、未固定の細胞が信号を開発し続けることに留意してください。 6ウェルディッシュに細胞を溶解し、ウェスタンブロット解析のためにライセートを準備。溶解した細胞は、撮像された細胞の代表になるように、すべてのセルが同時に準備されていることが重要です。 </li></ol> D.イメージング細胞<ol><li>蛍光強度は細胞ごとに計算されます。画像個々のセルにしてください。 </li><li> CFPは、トランスフェクションのコントロールとして含まれていたとだけCFP陽性細胞がBiFC信号の分析のために選択されています。我々は、セルがCFPをトランスフェクトされている場合、それはまたBiFC構築物でトランスフェクトされていることを前提にしてください。このアプローチは、BiFC信号を欠いている画像化された細胞は、目的のタンパク質ではなく、一つの欠如に起因またはそのセルの両方BiFC発現コンストラクトとの間の相互作用の欠如に起因する負であることを保証します。 </li><li>我々は、細胞イメージングのためのツァイスLSM 510共焦点顕微鏡を使用してください。この顕微鏡を使用するときにはズーム、ピンホール、検出器のゲイン、アンプのオフセット、フレームサイズ、走査速度、スキャンの平均、およびレーザパワーの一貫性を保つことが重要です。あらゆるイメージングシステムを使用する場合には、蛍光がサンプル間で比較可能となるように設定を一定に保つことが重要です。また、蛍光を定量するとき、それは、ピクセルが飽和していないことが重要です。 </li></ol>蛍光を定量化するE. <ol><li>蛍光は、任意の画像処理ソフトウェアを用いて定量することができます。私たちは、NIH（http://rsb.info.nih.gov/ij/）から自由に利用可能であるImageJを利用する。 ImageJのにイメージファイルを開きます。 AnalyzeSet​​測定に進みます。エリアのチェックボックスをオンにし、測定ボックス内のグレー値を平均。 </li><li> "フリーハンド選択"ツールを使用して、CFPのチャネルの全体のセルのエッジの周りにアウトラインを描きます。 </li><li>場所にこのアウトラインを残し、YFPチャンネルにシフト。 AnalyzeMeasureに移動します。 平均グレー値は、ピクセルの数（すなわち、セルの面積あたりの平均蛍光強度）で割って選択範囲のすべてのピクセルのグレー値の合計です。 </li><li>イメージごとにセルが含まれていない地域においてYFPチャンネルで円を描画します。背景として、この領域の測定を行う。それぞれの画像から背景を引きます。 </li><li>平均的な一つのサンプルで結像されるすべてのセルの背景マイナス平均グレー値。これは、細胞の集団の平均蛍光強度になります。我々は3つの実験上の約60の細胞を定量することが示唆している。 </li></ol> F.代表の結果： 私たちの研究室では、複数の生化学的およびシグナル伝達経路10,11,12,13,14を規制する多くのタンパク質と相互作用する複数のドメイン足場タンパク質、intersectin（ITSN）に焦点を当てています。 ITSNは2つのEps15相同性（EH）ドメイン、コイルドコイル状の地域、および5つのSrcホモロジー3（SH3）ドメインが含まれています。 ITSNの長いアイソフォームもDBLホモロジー（DH）およびCdc42 15グアニンヌクレオチド交換因子としてコンサートのプレクストリン相同（PH）ドメインをその行為が含まれています。このモジュラー構造は、タンパク質促進：タンパク質間相互作用をしBiFC実験のための理想的な候補をITSNです。 ITSNの細胞内局在は、その結合パートナーを変えるため、ITSN（unpublisによって規制経路を変更することができますHEDデータ）。最近、私たちの研究室では、ITSNはPI3K -C2β11、小説クラスII PI3Kの調節を介してニューロンの生存を調節することが実証されています。 PI3K -C2βのアミノ末端プロリッチドメインは、ITSNのSH3ドメインの2つの結合部位が含まれています。 ITSNとPI3K -C2β切断型変異体との共免疫沈降法を用いて、我々は、ITSNのSH3AとSH3Cドメインは、PI3K -C2βのアミノ末端領域と相互作用することを示した。次に、我々はこの複合体の細胞内局在を可視化するBiFC使用。 ITSNは金星（PHA - VC155）のカルボキシ末端に融合金星（pFLAG - VN173）とPI3K -C2β構造のアミノ末端に融合されました。別のネガティブコントロールとして、非特異的なペプチドは、PHA - VC155に融合した。 VN - ITSNとVC - PI3K -C2βは、句読点の分布（図2A、上部のパネル）でBiFC複合体を形成。 ITSNとPI3K -C2βの共沈を混乱させるPI3K -C2βのプロが豊富なドメインの変異はBiFC信号（図2A、下のパネル）11に減少。 ITSN二PI3K -C2βタンパク質間のBiFC信号の差は、蛋白質の発現の違い（図2B）によるものではなかった。 <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1 BiFCでは、蛍光体（この場合は金星は）（VN）アミノ酸に分割されます-とカルボキシ（VC）端子が終了。これらの目的は、関心のある2つのタンパク質に融合されています。 2つのタンパク質が相互作用する場合、VNとVCの断片が再アソシエートの相互作用部位と蛍光団と蛍光の再構成をもたらす。タンパク質相互作用5：BiFCは蛋白質を測定するために使用される蛋白質の断片の相補アッセイ（PCA）の具体例です。 <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。ITSNとPI3K -C2βフォームBiFC複雑。 A. VN -タグ付きITSNは、VC -タグ付きPI3K -C3βWTまたはプロリンリッチドメイン変異体（PI3K -C2β- PA）と共同tranfectedした。 ITSNとWT PI3K -C2βフォーム複合体（緑）。 CFP（赤）ウエスタンブロット法は構造の等しい発現を実証するために実行されたトランスフェクションコントロールB.として使用されていました。 VC -タグ付きのコンストラクトは、HAタグ付けされています。 <img src="/files/ftp_upload/2643/2643table1.jpg" alt="表1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="表1"> 表1。BiFCと互換性のある複数のベクトルがあります。 YN155：YFPの1 - 155aa、YC155：YFPの155 - 238aa、YN173：YFPの1 - 172aa、YFPのYC173、173 - 238aa、VN155：金星の1 - 154aa、VC155：金星の155から238、VN173：金星の1 - 172aa、VC173：金星の173 - 238aa、CN155 CFPの1 - 154aa、CC155 CFPの155 - 238aa、GN173：GFPの1 - 172aa、CitN155：シトリンの1 - 155aa、CitC155：155 - 238aaシトリン、CitN173：シトリン、CitC173の1 - 172aa：シトリン、CerN173の173 - 238aa：セルリアン2,3,9の1 - 172aa。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

細胞全体のタンパク質の相互作用およびこれらの複合体の細胞内局在を決定する：BiFCは、タンパク質を可視化するための優れた方法です。 BiFCの利点は唯一相互作用するタンパク質は、蛍光、過渡的な相互作用が安定しているか、および画像データの後処理が最小である。ということですこのメソッドの2つの欠点は、蛍光団と蛍光団複合体の不可逆性のための成熟の時間です。一部のアプリケーション下では、この不可逆性は利点として使用することができます。例えば、一つは構成的活性化の結果、BiFC複雑で酵素やその酵素の活性化剤を使用することができます。一つは、タンパク質がこの複合体に動員されるかを決定することができます。さらに、BiFC複合体の不可逆性は、弱いまたは一時的な相互作用の同定が可能になります。適切なコントロールがBiFC実験の解釈のために重要である。空のBiFCベクトルは高いバックグラウンド蛍光のこれらの試薬の結果として、コントロールとして使用しないでください。適切なコントロールには、2つのタンパク質の相互作用をブロックすることが知られている目的のタンパク質のいずれかの変異を使用して含まれています。目的のタンパク質との複合体ではない無関係のタンパク質を使...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>胎児牛血清</td><td>Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>ガラスボトム・マイクロウェルディッシュ</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-14C</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Falcon BD</td><td>35-3846</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>18324020</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM510 META</td><td></td></tr></tbody></table>

二分子蛍光相補

Bimolecular Fluorescence Complementation

シグナル伝達複合体の細胞内分布を定義すると、その複合体からの出力を理解する上で不可欠です。 このような免疫沈降などの従来の方法は、複合体の空間的局在に関する情報を提供していません。対照的に、BiFCはタンパク質複合体の相互作用と細胞内局在を監視します。この方法では、fluororescentタンパク質は、関心のある2つのタンパク質に融合されているアミノおよびカルボキシ末端に非蛍光フラグメントに分割されます。蛍光体の再構成におけるタンパク質の結果の相互作用（図1）1,2。 BiFCの制限は、断片化された蛍光体が再構成されると、複雑な3不可逆であるということです。この制限は、一時的または弱い相互作用を検出するのに有利であるが、複雑なダイナミクスの動態解析を排除する。追加の注意点は、再構成されたflourophoreが再びリアルタイムの相互作用4の観察を排除、成熟し、蛍光を発するために30分必要があるということです。タンパク質相互作用5,6：BiFCはそのような緑色蛍光タンパク質変異などのレポータータンパク質（BiFC）、ジヒドロ葉酸還元酵素、β-ラクタマーゼ、および蛋白質を測定するルシフェラーゼを採用した蛋白質フラグメントの相補アッセイ（PCA）の具体例です。蛋白質研究するために代替方法：細胞内のタンパク質の相互作用は、蛍光共局在し、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）7が含まれています。共局在のために、二つのタンパク質は、個別に直接蛍光体でまたは間接蛍光抗体のいずれかによってタグ付けされます。しかし、このアプローチは、それが困難な共局在のデータを解釈すること、非相互作用するタンパク質の高いバックグラウンドにつながります。さらに、共焦点顕微鏡の分解能の限界のため、2つのタンパク質は必ずしも相互に作用することなく、共局在表示されることがあります。興味のある2つのタンパク質が相互作用するときBiFCで、蛍光のみが観察される。タンパク質相互作用が、技術的に挑戦することができます：FRETはタンパク質を研究するための別の優れた方法です。 FRETの実験では、ドナーとアクセプターは、細胞内で同様の明るさと化学量論であることが必要です。さらに、一つはアクセプターチャネルとその逆にドナーの通過ブ​​リードを考慮する必要があります。 FRETのとは異なり、BiFCは、画像データの少ないバックグラウンド蛍光、少し後処理を有し、高い過剰発現を必要とせず、弱または一時的な相互作用を検出することができます。生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）はドナーがそれによって刺激的なアクセプター発光になるために基質を触媒する酵素（例えばルシフェラーゼ）であることを除いてFRETを同様の方法です。 BRETは、スルーブリードの技術的な問題や高いバックグラウンドの蛍光を欠いていることもありましたが、特定のコンパートメント8〜基板の局在の欠如に空間的な情報を提供する能力を欠いている。全体的に、BiFCは区分シグナリングへの洞察を得るためにタンパク質複合体の細胞内局在を可視化するための優れた方法です。

タンパク質の細胞内局在は、細胞シグナル伝達の時空間制御を決定する上で重要です。ここで、我々は、細胞内のタンパク質の空間的な相互作用を監視するための簡単​​な方法として、二分子蛍光相補（BiFC）を記述する。

シグナル伝達複合体の細胞内分布を定義することは、その複合体から得られる出力を理解する上で不可欠である。...などの従来の手法では、

本実験の目的は、細胞内で2つのタンパク質が相互作用するかどうかを定義し、その相互作用部位の特性を明らかにすることです。まず、目的とする2つのタンパク質をコードする発現コンストラクトを細胞にトランスフェクションします。この際、一方のタンパク質は断片化蛍光タンパク質のN末端に、もう一方は相補的なC末端に融合させます。トランスフェクションした細胞を培養し、蛍光シグナルを発現させた後、イメージングおよびイムノブロッティングによってタンパク質複合体を可視化します。次に、収集した画像をImage Jなどの解析ソフトにエクスポートします。制御された実験において、細胞あたりの平均蛍光強度を定量化するため、BIFCの結果を用いてタンパク質間相互作用およびこれらの複合体の局在を実証することが可能です。例えば、足場タンパク質のSH3ドメインとPI3K$\text{p}110\beta$のプロリンリッチドメインの相互作用などが挙げられます。共局在、免疫共沈降、FRETなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、BFCを用いることで、細胞内における弱く一過性の相互作用を空間的に局在化できる点にあります。また、この方法はFRETで見られるような大規模な画像後処理を必要としません。この手法を用いることで、タンパク質XとYが相互作用するか、また相互作用する場合、それらの複合体が細胞内のどの特定のコンパートメントに局在するかといった、シグナル伝達領域における重要な疑問を解決できます。一般的に、この手法を初めて行う方は、バイオセンサーの発現に適した構成を選択できていないため、苦労することがあります。まず、BIFC融合タンパク質に使用する複数の蛍光タンパク質の中から1つを選択し、目的のタグ付きタンパク質を決定します。Venusのアミノ末端とカルボキシ末端は37 °Cで複合体を形成できる一方で、Y-F-P-B-I-F-Cフラグメントは30 °Cでの事前インキュベーションが必要であることを考慮してください。BIFCフラグメントの付加が目的タンパク質の機能にどのような影響を与えるかを検討し、タグ付加のための発現ベクターを設計してください。例えば、RAsファミリーやGTP αはカルボキシ末端で脂質修飾を受けているため、この修飾を損なわずに同末端にタグを付加することはできません。トランスフェクション条件を決定するために、必ずパイロット実験を行ってください。また、蛍光顕微鏡で細胞を観察し、シグナルが十分に現れる最適な時間を特定してください。その後、ウェスタンブロット解析を行い、構築物が均等に発現していることを確認してください。重要な点として、各サンプルプレートにおいて、BIFCフラグメントの添加が目的タンパク質の細胞内局在を変化させていないことを確認するため、HAタグまたはFlagタグの免疫染色を行ってください。1.3 × 10⁵ 個の細胞を、ガラスボトムプレート1枚および6ウェルプレートの2ウェルにそれぞれ播種し、37 °Cのインキュベーターで一晩静置して細胞を定着させます。翌日、リポフェクションまたはその他の好ましい方法を用いて、トランスフェクション用のDNAを調製します。まず、トランスフェクションコントロールとして、DNAを250 µLの無血清DMEMで希釈します。CFPを、全BIFC DNA量の50分の1の量で添加します。次に、DNA 1 µgあたり10 µLのリポフェクション試薬を用いて、リポフェクション試薬を250 µLの無血清DMEMで希釈します。DNAとリポソーム希釈液を混合し、室温で20分間インキュベートします。温めた無血清DMEMで細胞を2回洗浄します。ガラスボトムプレートまたは6ウェルディッシュの各ウェルに、無血清DMEMを2 mL加えます。次に、各トランスフェクション混合液を、ガラスボトムディッシュ1枚と6ウェルプレートの2ウェルに均等に分注し、細胞を37 °Cで5時間インキュベートします。最後に、トランスフェクション培地を除去し、10% FBS添加完全DMEM培地に交換します。目的タンパク質の必要な発現レベルを得るために、予備実験で決定した時間、細胞をインキュベートします。エピ蛍光顕微鏡で導入細胞を観察し、ポジティブコントロールに蛍光が認められることを確認します。ライブセルイメージングに備え、PBSで細胞を3回洗浄します。細胞を指標色素を含まない培地に置きます。固定細胞をイメージングする場合は、2%パラホルムアルデヒドを加え、氷上で10分間静置します。次に、細胞をPBSで3回洗浄し、1 mLのPBSで満たした後、4°Cの暗所で保存し、直ちに6ウェルプレート内の細胞を溶解します。ウェスタンブロット解析では、溶解細胞が画像撮影した細胞を代表するものであるように、すべての細胞を同時に調製することが重要です。タグタンパク質が同レベルで発現していることを確認するために、ウェスタンブロットを実施してください。共焦点顕微鏡を用いて細胞をイメージングする際は、サンプル間で蛍光強度を比較できるよう、実験全体を通して設定を一定に保つことが重要です。ピクセルが飽和していない個々の細胞を確実にイメージングしてください。CFPをトランスフェクションコントロールとして導入しているため、BIFCシグナルの解析にはCFP陽性細胞のみを選択してください。Image Jなどのイメージングソフトを用いて蛍光強度を定量します。Image Jで画像ファイルを開きます。[Analyze]から[Set Measurements]を選択します。測定項目のボックス内で、[Area]（面積）と[Mean Gray Value]（平均輝度値）にチェックを入れます。なお、本例では静脈画像が擬似カラーの緑色に、CFP画像が擬似カラーの赤色に色付けされています。自由形式選択ツールを使用して、CFPチャネルで細胞全体の縁に沿ってアウトラインを描き、そのままにしておきます。YFPチャネルに切り替えます。「解析（analyze）」に移動し、平均グレー値を測定します。これにより、各画像の細胞あたりの平均蛍光強度が算出されます。細胞を含まない領域に、YFPチャンネルで円を描きます。この領域をバックグラウンドとして測定してください。各画像からこのバックグラウンドを減算します。最後に、細胞集団の平均蛍光強度を算出するため、1つのサンプルでイメージングしたすべての細胞について、平均グレー値からバックグラウンドを差し引いた値の平均を求めます。理想的には、3回の実験にわたって60個の細胞を定量してください。マルチドメイン足場タンパク質intersectinは、新規のクラスII PI 3-kinaseであるPI3KC2βの調節を通じて神経細胞の生存を制御します。intersectinのSH3ドメインはPI3KC2βのアミノ末端プロリンリッチ領域と相互作用します。VNタグ付きintersectinとVCタグ付きPI3KC2βを共導入すると、YFPチャネルに蛍光信号が得られ、これを擬似的に緑色に彩色することで複合体形成を示しています。ここで赤色に擬似着色されているCFPは、形質導入された細胞を標識するためのコントロールとして使用されています。PI3K2βのプロリンリッチドメインにおける変異は、intersectinとPI3K2βの共沈殿を阻害し、BIFC信号を減少させます。このBIFC信号の差は、野生型と変異型PI3Kタンパク質の発現量の差によるものではありません。この手法に習熟すれば、適切に行うことで3日間で完了させることができます。本手順を実施する際は、適切なコントロールを走らせ、タンパク質の発現を確認し、BIFC信号の差が発現量の差ではなく、複合体形成の差に起因することを確実にしてください。これらの複合体がお互いに対してどのような異なる親和性を持つかという疑問に答えるために、レジデントに対する表面プラズモン共鳴などの他の手法を実施することができます。

Research

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Biology

生物学

この記事では、タマネギ表皮細胞にプラスミドDNAを導入する遺伝子銃をヘリオス適切にBioRad社製を使用する方法を示して、どのように二分子蛍光相補性の原理（BiFC）に基づいて、タマネギの細胞におけるタンパク質間相互作用をテストする...

ヘリオス遺伝子銃を用いたタマネギの細胞における蛋白質 - 蛋白質相互作用のための二分子蛍光相補（BiFC）アッセイ

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二分子蛍光相補結合光活性化局在顕微鏡法

この動画では、コンフォメーション特異的なシングルドメイン抗体を用いて特異的なタンパク質二量体を検出・単離するためのBiCAPという二分子相補型アフィニティー精製のデモを行っています。...

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二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析：タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量法

インビボでのタンパク質複合体の形成は、二分子蛍光相補性によって視覚化することができる。相互作用パートナーは、蛍光タグの相補的部分に融合し、一過性にタバコの葉で表現、2つのタンパク質の接近したとき、再構成可能な蛍光シグナルをもたらしている。...

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

タンパク質間相互作用は、二分子蛍光相補(BiFC)と光活性化局在顕微鏡(PALM)を組み合わせることにより、ナノメートルの空間分解能で細胞内で可視化されます。ここでは、個々のRas-Raf複合体のナノスケールクラスタリングと拡散を視覚化するためのU2OS細胞内のRas-Raf相互作用をイメージングするためのBiFC-PALMの使用について説明します。...

二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）

本稿では、二分子の相補性の親和性の浄化 (BiCAP) のプロトコルについて説明します。この手法は競合結合パートナーで形成された複合体と同様、国連複合体の個々 のタンパク質を除く、特定の分離と任意の 2...

解離性個体の親和性の浄化 (BiCAP) によって多蛋白質シグナリング複合体

このプロトコルを記述するカスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC);自分の活性化の最初のステップであるイニシエーター カスパーゼの誘起近接を視覚化に使用することができますイメージング...

カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ

このプロトコルは、C.エレガンス生殖細胞リンにおけるその場でのタンパク質相互作用をプローブするための近接ライゲーションアッセイの使用を実証する。...

近接ライゲーションアッセイを用いたC.エレガンス生殖細胞系列におけるリボヌクレオプロテイン複合体集合体のSITU検出

ここでは、BiFCベースのFRET-FLIMアッセイによる蛍光タグ付きタンパク質を用いた3つのタンパク質パートナー間の三元複合体形成を可視化する方法を提示する。この方法は、...

BIFC-FRET-FLIMアッセイによるMADS型転写因子の2つのモノマーとカルシウムセンサタンパク質の三者間相互作用の測定

学ぶ二分子蛍光相補法を用いた細胞内タンパク質相互作用の可視化と局在解析。分割蛍光タンパク質を融合させた標的タンパク質を発現させ、蛍光再構成による相互作用の空間的検出を行う。

二分子蛍光相補

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