免疫不全マウスにおけるヒト網膜芽細胞腫の腫瘍の確立と伝播
August 4th, 2011
メソッドは、マウスにヒトの網膜芽細胞腫の腫瘍を伝播するために記述されています。腫瘍細胞は、直接免疫欠損マウスの眼に注入されています。二次腫瘍が正常に直接ヒト腫瘍および培養tumorspheresから採取した細胞の両方を使用して確立されている。
この手順の全体的な目標は、免疫不全マウスに同所性網膜芽細胞腫腫瘍を確立し、さらなる実験に便利なモデルを提供し、腫瘍の増殖を可能にすることです。これは、最初に初代腫瘍または異種移植腫瘍から細胞を採取し、in vitroで腫瘍球を培養することによって達成されます。手順の第2ステップは、培養腫瘍細胞をぼろきれ2ヌル免疫不全マウスの眼の硝子体腔または網膜下腔に注入することです。
手順の3番目のステップは、注射されたマウスを監視して、ロイココリアGLOの拡大や眼周囲の膨満などの腫瘍形成の兆候がないか確認することです。手順の最後のステップは、異種移植片腫瘍を採取することです。最終的には、病理組織学的検査を通じて、マウスの眼に同所性腫瘍が形成されることを示す結果を得ることができます。
この手法の視覚的なデモンストレーションは、眼内注射の繊細な性質のために重要です。周囲の構造物は、適切に識別しないと簡単に損傷する可能性があります。一般に、この方法に不慣れな個人は、硝子体腔内の注射の配置には腫瘍細胞を正しい位置に送達するための精度が必要であるため、苦労しています。
現在、この方法は網膜芽細胞腫腫瘍の生物学への洞察を提供することができます。また、遺伝子導入のためのベクターの眼間投与など、他のシステムにも適用できます。まず、無菌組織培養処理した10cm皿で、新鮮に定義された幹細胞培地を調製します。
網膜芽細胞腫腫瘍組織を配置し、余分な輸送培地を吸引し、乾燥を防ぐのに十分な量を残し、クロスカット技術を使用してメスで組織を機械的に分解し、すぐに100マイクロリットルの定義された幹細胞培地を組織に加え、メスを使用してミンチ組織を穏やかに広げます。次に、10ミリリットルの定義された幹細胞培地を皿に加えます。加湿インキュベーターでプレートを摂氏37度で5%二酸化炭素とインキュベートし、濁度とpHの変化を毎日検査します。
一部の腫瘍球は、破壊された腫瘍組織からほぼ即座に発生し、十分な新しい成長が観察される7〜10日の間に数が増加します。そしてその後、毎週、腫瘍球をGの300倍で5分間遠心分離します。Resusは、新たに調製した定義された幹細胞培地にそれらを懸濁し、ピペットで10回上下させて、より大きな中央壊死球を破壊し、新しい健康な球体が形成されるようにします。
培養腫瘍球を注射用に調製するには、球体を15ミリリットルの円錐管に穏やかに移します。球体を乱すために、10〜15回静かにピペットで上下します。トライアンブルーを使用したヘモサイトメーターを使用して注入する細胞をカウントし、生存不能な細胞を除外します。
利用可能な細胞の数と実験要件に基づいて、必要な数の注射を準備します。次に、チューブをGの300倍で5分間遠心分離します。上清を慎重に吸引し、細胞を5ミリリットルに再懸濁します。
PBSは、遠心分離と吸引のステップをもう一度繰り返します。最後に、注射ごとに細胞を10マイクロリットルの滅菌PBSに再懸濁します。動物を処置のために準備するためには、麻酔をかけたマウスを加熱されたパッドの上に置くことから始めます。
体温を維持するために、プロパンHCLを1滴右目に投与し、1分間待ちます。次に、フェニレフリンHCLを1滴右目に投与し、5分間待ちます。瞳孔の拡張が起こらなかった場合は、さらに滴を投与し、さらに5分間待ちます。
麻酔をかけた動物を顕微鏡で横に置き、頭をガーゼの上に置きます。右側を上にして目の中央を向けると、右目の赤い反射が得られます。眼底を顕微鏡で観察するときは、2本の指で同時にまぶたを軽く押し下げて、右の球体を支えます。
手順の残りの部分では、この位置を安定させてください。ルアーロックシリンジに取り付けられた滅菌済みの30ゲージ針を使用します。扁平部の領域で角膜輪部に隣接する結膜と強膜を通って、そしてちょうど脈絡膜を通して硝子体腔に地球を横方向に突き刺します。
開口部から針を外します。ハミルトン針をアルコール綿棒で滅菌します。細胞懸濁液をハミルトンシリンジに引き込み、針が顕微鏡を通して網膜近くの硝子体内のレンズの後ろで視覚化されるまで、針を開口部に挿入します。.
2人目の助けを借りて、プランジャーを押し下げながら針をこの位置にしっかりと保持し、ゆっくりと針を取り外します。必要に応じて、綿棒を使用して開口部から血液や体液を吸収します。圧力をそっと解放して、マウスのまぶたを閉じます。
動物を回復のために加熱されたパッドに戻します。注射後毎日、白血球がないか眼を調べてください。これは通常、注射後2〜4週間で明らかになります。
腫瘍の成長が検出されたら、施設のガイドラインに従って動物を安楽死させます。実体顕微鏡下で、角膜と水晶体を切除し、角膜と水晶体を切除し、ピンセットを使用して腫瘍塊の大部分を他の組織から慎重に解剖します。腫瘍を滅菌RPMI 1640に入れます。
メディアはピンセットを使用して、視神経が露出するまで開いた球体をソケットからゆっくりと引き出します。地球儀をソケットからそっと持ち上げながら。はさみを使用して視神経を切断し、できるだけ多くの神経を球体に付着させて、腫瘍部位による視神経浸潤を評価します 組織学のための10%中性緩衝ホルマリンで見られる。
培養腫瘍球の一例です。3日後、細集した腫瘍組織の中では、ごく少数の腫瘍球のみが明らかになります。しかし、10日後には腫瘍球の数が増加しています。
球体は、注入後数週間で右上のインサートに示されているように、鮮明な外膜を示します。注射されたマウスは白血球を示し、白い瞳孔反射は眼の後ろに位置する腫瘍によるものです。これらのhおよびd染色された眼の切片の例では、左側の硝子体腔を埋める異種移植網膜芽細胞腫腫瘍と、右側の模擬注射眼にそのような成長がないことに注目してください。
このビデオを見た後、培養腫瘍細胞を準備する方法、マウスの眼で眼内注射を適切に行う方法、および腫瘍の進行を探す方法についてよく理解しているはずです。適切に行われた場合、腫瘍細胞は危険である可能性があり、この手順を実行するときは、白衣やマスクなどの適切なPPEを着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。ヒトのがん細胞は、常にbsl 2つの条件下で操作する必要があります。
概要
この記事では、免疫不全マウスにおけるヒト網膜芽腫腫瘍の伝播方法について説明します。この技術は、マウスの目に腫瘍細胞を注射し、さらなる研究のために二次腫瘍を確立することを可能にします。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 腫瘍学
- 動物モデル
背景
- 網膜芽腫は網膜の悪性腫瘍です。
- 信頼性の高い動物モデルを確立することは、腫瘍生物学を研究する上で重要です。
- 免疫不全マウスは、免疫排除なしに腫瘍の成長を促進するために使用されます。
- 眼内注射技術は、周囲の構造への損傷を避けるために精密さが必要です。
研究目的
- マウスにおける網膜芽腫の正位置モデルを作成すること。
- 腫瘍の伝播と生物学の研究を可能にすること。
- 治療介入をテストするためのプラットフォームを提供すること。
使用された方法
- ヒト網膜芽腫腫瘍から細胞を採取すること。
- 定義された幹細胞培地で腫瘍球を培養すること。
- 培養した腫瘍細胞を免疫不全マウスの硝子体腔に注射すること。
- 腫瘍形成をモニタリングし、分析のために異種移植腫瘍を採取すること。
主要な結果
- マウスの眼における正位置腫瘍の確立に成功。
- 腫瘍成長の指標として白内障様の症状の観察。
- 組織病理学的検査により腫瘍形成が確認されました。
- この方法は網膜芽腫生物学を研究する可能性を示しました。
結論
- この方法は網膜芽腫研究に価値あるモデルを提供します。
- 腫瘍の特徴と治療への反応の調査を可能にします。
- 将来の応用は眼系における遺伝子転移研究にまで拡大される可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Establishing orthotopic tumor models in immunodeficient mice enables mechanistic de-risking of retinoblastoma biology and supports target validation through in vivo phenotypic confirmation. This approach provides predictive confidence in preclinical models by maintaining tumor heterogeneity and stromal interactions critical for translational relevance. The method facilitates early discovery workflows by supplying a renewable source of human tumor tissue for assay development and lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of therapeutic targets in a physiologically relevant ocular microenvironment.
- Operational Value: Supports consistent tumor propagation across passages for reproducible target engagement studies.
- Scientific Value: Allows interrogation of tumor-stroma interactions that influence drug penetration and resistance mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized xenograft tumors suitable for ex vivo drug sensitivity assays and biomarker analysis.
- Operational Value: Provides a scalable source of tumor material for high-content imaging and histopathological screening platforms.
- Scientific Value: Supports quantitative endpoint development through measurable tumor growth kinetics and leukocoria onset.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains histopathological fidelity to human retinoblastoma, enabling mechanistic de-risking of pathway-targeted therapeutics.
- Operational Value: Permits longitudinal monitoring of tumor progression and treatment response in orthotopic context.
- Scientific Value: Facilitates biomarker discovery through comparative analysis of xenograft versus parental tumor phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by supplying validated tumor models for hypothesis testing and pathway clarification prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports target validation through in vivo confirmation of tumor dependency on genetic or pharmacological perturbations.
- Screening: Enables assay readiness by providing tumor tissue for drug response profiling and IC50 determination.
- Analytics: Delivers quantitative tumor growth metrics and histopathological readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects in vitro sphere cultures to in vivo tumorigenicity, strengthening preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a renewable tumor propagation system reducing dependency on primary tissue acquisition.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by preserving tumor heterogeneity and reducing culture-induced phenotypic drift.
- Operational Value: Standardizes tumor engraftment procedures across laboratories through defined injection and monitoring criteria.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing orthotopic efficacy data earlier in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on in vivo validation in clinically relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile intraocular injection techniques and murine ophthalmological monitoring.
- Dependent on immunocompromised Rag2-/- mouse colonies and specialized microsurgical instrumentation.
- Necessitates standardized tumor preparation protocols to ensure consistent cell viability and sphere integrity.
- Involves biosafety level 2 containment for handling human tumor cells and associated biohazard waste.
- Limited by tumor take rate and latency period, requiring cohort sizing adjustments for statistical power.
