Name: 免疫不全マウスにおけるヒト網膜芽細胞腫の腫瘍の確立と伝播 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学ぶ 免疫不全マウスへの眼内注射によるヒト網膜芽細胞腫の確立と伝播法。腫瘍球培養と硝子体腔注入で二次腫瘍を形成し、網膜芽細胞腫の生物学的研究と治療開発のための有用なモデルを提供します。

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このプロジェクトの資金は、研究と網膜の研究財団のためのクレイトン財団によって提供されます。

1。網膜芽細胞腫のtumorspheresの準備<ol><li> IRB承認されたプロトコルの下で網膜芽細胞腫の腫瘍のサンプルを入手。 </li><li>新鮮定義されている幹細胞のメディアを準備する（Neurobasal -メディア、1X B - 27サプリメントマイナスビタミンA、1X非必須アミノ酸溶液、1X L -グルタミン、20 ng / mLのEGF、10 ng / mlのbFGFを）。 </li><li>機械的に滅菌、組織培養処理した6穴プレートの横断的な技法を用いてメスで腫瘍組織を分解。すぐに組織に定義された幹細胞の培地を100μLを加え、穏やかにメスを使用してみじん切りの組織を広げる。ウェルに定義された幹細胞の培地を5mLを追加。 </li><li> 37℃でインキュベートする加湿インキュベーター中、C、5％CO 2と日常点検。いくつかtumorspheresは2-4日の経過とともに増えて、ほとんどすぐに中断腫瘍組織から発生するはず。 </li><li>毎週、5分間300xgで遠心tumorspheresは、作りたての定義幹細胞の培地に再懸濁し、そしてピペット上下10倍は大きく、集中的に壊死球を破壊し、新しい、健康的な球体を形成できるようにする。 </li></ol> 2。注射のための腫瘍細胞の調製<ol><li> 15 mLコニカルチューブに静かに培養tumorspheres、ピペットの球を注入する場合。血清学的ピペットでアップダウン優しくピペット球を混乱に10-15回。 </li><li>新しいチューブに注入ごとに少なくとも50,000個の細胞を細胞は血球計算盤を用いて注入されるようにカウントし、分注し。使用可能なセルの数に基づいて、できるだけ多くの注射の準備。 </li><li> 5分間300xgで遠心分離します。注意深く5mLのPBSで上清と再懸濁しますを吸引除去する。遠心分離や吸引を繰り返し、インジェクションあたり10μLのPBSに再懸濁します。 </li></ol> 3。動物の準備<ol><li>インスリンの注射器を用いて、グラム体重あたり1μL（GBW）でげっ歯類の麻酔のカクテルの腹腔内注射（ケタミン37.6 mg / mLの、キシラジン1.92 mg / mLの、アセプロマジン0.38 mg / mL）を管理する。鎮静になるために動物のための5分間待ちます。ハートビートをチェックし、加熱されたパッドの上に動物を置く。回復されるまで常に加熱パッド上に動物を維持する。 </li><li>鎮静した後、右眼にプロパラカイン塩酸1滴を管理する。加熱されたパッドの上に動物を交換し、1分間待ちます。 </li><li>右目にフェニレフリン塩酸1滴を管理する。加熱されたパッドの上に動物を交換し、5分間待ちます。瞳孔の散大が発生していない場合、1滴を再投与し、さらに5分待って。 </li><li> &gt; 30分後に鎮静剤で発生する可能性のある運動やけいれんの兆候、動物を監視する。運動の最初の兆候で、ケタミン塩酸（PBS中10 mg / mlに希釈）の1μL/ GBWを管理し、5分間待ちます。 </li></ol> 4。腫瘍細胞の注入<ol><li>右眼を上に向けて、ガーゼで休む頭部と、その側に顕微鏡下で麻酔した動物を置き、顕微鏡で観察するときに右眼眼底（瞳がこの時に瞳孔が開いする必要がある）の赤色の反射を得るために中心。 </li><li>軽くまぶたに二本指で同時に押し下げ、手順の残りのために着実にこの位置を保持することによって右の地球を支える。 </li><li>ピアス地球儀は、毛様扁平の面積（図1）で、ちょうど硝子体腔に脈絡膜を介して角膜輪部に隣接する結膜と強膜を介して横方向に、ルアーロックシリンジに接続されている滅菌30ゲージの針を使用する。開口部から針を外します。 </li><li>アルコール綿棒でハミルトンの針を滅菌する。ハミルトンシリンジに細胞懸濁液を描画し、針が網膜の近くに硝子のレンズの後ろに顕微鏡で視覚化されるまで、開口部に針を挿入する。このポジションで着実に針を押しながらもう一人の助けを借りて、プランジャーをゆっくり押し下げます。ニードルを取り外します。必要に応じて、開口部から任意の流体を吸収するために綿棒を使用してください。 </li><li>ゆっくりとマウスのまぶたを閉じてまぶたの圧力を解放。 </li><li>それぞれの目にヒプロメロースの1滴を投与し、回復のための加熱パッドに動物を返します。 </li></ol> 5。注射したマウスと腫瘍の収穫のモニタリング<ol><li>毎日、通常2〜4週間の注射後に明らかになると、注入白色瞳孔のための目（白乳頭反射）および/または眼周囲の膨満を調べます。 </li><li>腫瘍の増殖が検出されると、制度的なガイドラインに従って動物を安楽死させる。 </li><li>目と腫瘍がまぶたで覆われている場合、眼瞼裂の直交する二切開を行い、皮膚フラップを持ち上げるためにメスを使用してください。 </li><li>実体顕微鏡を用いて可視化の下に、角膜と水晶体を除去し、角膜輪部に周方向の切開を行い、慎重に取り澄ましたを使用して他の組織から腫瘍の質量の大部分を細かく分析zers。無菌RPMI - 1640培地で腫瘍を置きます。 </li><li>ゆっくりとソケットから開いて世界を引っ張ってピンセットを使用してください。腫瘍の浸潤を可視化できるように接続された視神経を確保するために、神経が露出するまで地球を引き出し、できるだけ長く神経を切断するはさみを使用してください。組織学的検査のための定期的な処理のために10％ホルマリンに置きます。 </li></ol> 6。代表的な結果： 網膜芽細胞腫のtumorspheresはほとんどすぐに彼らは、腫瘍塊から解放として分解された組織から表示されるようになります。 2〜4日以内に、より多くのtumorspheresが形成するとサイズが増加するが開始されます。球は、通常のものと集約（図2）周囲の明確に定義された、二次膜を示す傾向がある。 動物は通常、腫瘍が大きくなるにつれて（図3c）5-8週間注射後に周囲の組織の世界と膨張の拡大が続く、4週間後の注入（図3b）内に白色瞳孔を呈する。 <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。プロトコルで参照されている機能に焦点をマウスの眼の断面図。 <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2 in vitroでのヒト網膜芽細胞腫細胞の培養）は4倍で撮像、 およびb）10倍対物レンズ倍率。網膜芽細胞腫、原発腫瘍の細胞は規則的な回転楕円体の形状とさわやかな外膜とtumorspheresを生成する。スケールバーは）500μmを表し、a とb）は200μm。 <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3 RAG2のアイ- / - 、B）を通常の機能を示すマウス）硝子体腔内の腫瘤を示す白色瞳孔、 およびc）大規模な腫瘍塊は、関連する眼周囲の膨満感、眼内出血で地球儀を充填。

<ol><li>Chèvez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+and+Nonmetastatic+Models+of+Retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Metastatic and Nonmetastatic Models of Retinoblastoma.</a> Am. J. Pathol. 157, 1405-1412 (2000).</li>
<li>Suber, M. L., Hurwitz, M. Y., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+consequences+of+intraocular+administration+of+modified+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune consequences of intraocular administration of modified adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 12, 833-838 (2001).</li>
<li>Mallam, J. N., Hurwitz, M. Y., Mahoney, T., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Transfer+into+Retinal+Cells+Using+Adenoviral+Vectors%3A+Dependence+on+Receptor+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Transfer into Retinal Cells Using Adenoviral Vectors: Dependence on Receptor Expression.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 1680-1687 (2004).</li>
</ol>

動物実験は医学IACUC委員会のベイラー大学で定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。

ここに記載された技術は、彼らの眼内、硝子体内環境での伝搬の網膜芽細胞腫の腫瘍を促進する。眼内注射の技術は、網膜芽細胞腫由来細胞株1と同様に眼遺伝子治療2,3のためのウイルスベクターを提供するから腫瘍を作成するために、過去に使用されています。この手法は、これで正常に原発腫瘍と注射tumorspheresのだけでなく、異種移植片腫瘍のシリアル伝播から細胞を直接注入することにより、人間の網膜芽細胞腫の腫瘍を生成するために利用されている。腫瘍形成（通常は白色瞳孔）の目に見える証拠は、通常、最初に軌道を取り巻く世界および/または組織の眼内出血や膨満5〜8週間以内に開発した後、4週間以内に記載されています。注射されたマウスの少数派は、まぶたの永久閉鎖につながる、充血した目を傷つける。これらのケースでは、膨満は、腫瘍形成の唯一の徴候である。 確立された異種移植腫瘍の増殖が非常に成功した場合もマウス異種移植腫瘍の確立は、すべての人間の網膜芽細胞腫の腫瘍を持つ成功していない。この観察は、そのような差別やその他の未知の要因の侵襲性やレベルなどの原発腫瘍の特定の特性が、、マウス眼球の環境中に残留するためにこれらの腫瘍の能力に影響を与える可能性がありますことを示唆している。 人間の網膜芽細胞腫の腫瘍から取得することができる組織の量はかなり小さいです、そしてそのような限られた寿命、固形腫瘍の組織像の消失と細胞の表現型の変化として、 体外培養ヒト網膜芽細胞腫の細胞への能力に大きな制限があります。このプロトコルは、ヒトの腫瘍を伝播し、ヒト疾患のマウスモデルを確立するために比較的単純な方法を提供します。これは、in vitroおよび網膜芽細胞腫と患者の腫瘍外の長いメンテナンスの生物の in vivo実験におけるさらなるできます。

<table border="1"><tbody><tr><th>の名前</th><th>会社</th><th>カタログ＃ </th><th>コメント</th></tr><tr><td>塩酸2.5％フェニレフリン</td><td>ボシュロム</td><td> 053から11 </td><td>点眼剤</td></tr><tr><td> 30 - GAニードル</td><td> BD </td><td> 305128 </td><td>レギュラーベベル</td></tr><tr><td> 10 mLのルアーロックシリンジ</td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> 3/10-ccインスリン注射器</td><td> BD </td><td> 328431 </td><td></td></tr><tr><td>アルコール綿棒</td><td> BD </td><td> 326895 </td><td></td></tr><tr><td> 6ウェルプレート、組織培養用</td><td> BD </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td>プロパラカイン塩酸0.5パーセント</td><td>バトラーAHS </td><td> 017239 </td><td>点眼剤</td></tr><tr><td>ケタミン塩酸100mg/mL </td><td>フォートドッジ</td><td> 4402A </td><td></td></tr><tr><td> 10μLハミルトンシリンジ</td><td>ハミルトン社</td><td> 7648〜01 </td><td></td></tr><tr><td> 32 - GAハミルトンニードル</td><td>ハミルトン社</td><td> 7803〜04 </td><td>カスタム長さ - 0.5&quot; </td></tr><tr><td> Neurobasalメディア</td><td>インビトロジェン</td><td> 10888-022 </td><td></td></tr><tr><td> B - 27サプリメントマイナスビタミンA、50X </td><td>インビトロジェン</td><td> 12587-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI - 1640メディア</td><td> Mediatech </td><td> 10から040 - CV </td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸溶液、100X </td><td> Mediatech </td><td> 25から025 - CI </td><td></td></tr><tr><td> 100X、L -グルタミン、 </td><td> Mediatech </td><td> 25から005 - CI </td><td></td></tr><tr><td>使い捨て＃11メス</td><td> Miltex </td><td> 4から411 </td><td></td></tr><tr><td>げっ歯類の麻酔のコンボ</td><td> N / A </td><td> N / A </td><td>薬局製剤（ケタミン37.6 mg / mLの、キシラジン1.92 mg / mLの、アセプロマジン0.38 mg / mL）は、社内における</td></tr><tr><td>組換えヒト上皮成長因子（EGF） </td><td> STEMCELLテクノロジーズ</td><td> 02633 </td><td> 10μg/ mLの原液で再構成する</td></tr><tr><td>組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF） </td><td> STEMCELLテクノロジーズ</td><td> 02634 </td><td> 10μg/ mLの原液で再構成する</td></tr><tr><td> OMS - 75手術用顕微鏡</td><td>トプコンメディカルシステムズ</td><td> OMS - 75 </td><td>このモデルは廃止されています</td></tr><tr><td> 10％ホルマリン</td><td> VWR </td><td> 95042-908 </td><td></td></tr></tbody></table>

免疫不全マウスにおけるヒト網膜芽細胞腫の腫瘍の確立と伝播

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

定義された幹細胞培地で培養網膜芽細胞腫の腫瘍細胞は、限られた時間のために栽培し、維持することができる主tumorspheresを生じさせる。元の腫瘍と比較すると、これらの培養tumorspheresは著しく異なる細胞の表現型を示すことができる。培養細胞は、新しい腫瘍を形成する能力を持っているデモは、その培養細胞モデルを元の腫瘍の生物学を確保することが重要です。 / - -免疫欠損マウスここではRAG2を用いた in vivo でのヒト網膜芽細胞腫の腫瘍を伝播するためのプロトコルを提示する。低継代またはマウスの眼の硝子体腔内に直接注入されたばかりの収穫、人間の網膜芽細胞腫の腫瘍から得られた細胞の培養ヒト網膜芽細胞腫のtumorspheresは2-4週間以内に腫瘍を形成する。これらの腫瘍を採取し、どちらさらにin vivoでのマウスの目に継代またはin vitroで tumorspheresとして成長させることができる。伝播が正常に少なくとも三つの通路ため、さらに実験のための人間の網膜芽細胞腫の組織の継続的なソースを確立するために行われている。 ウェズリーS.ボンドとLalita Wadhwaは、共同最初の著者です。

メソッドは、マウスにヒトの網膜芽細胞腫の腫瘍を伝播するために記述されています。腫瘍細胞は、直接免疫欠損マウスの眼に注入されています。二次腫瘍が正常に直接ヒト腫瘍および培養tumorspheresから採取した細胞の両方を使用して確立されている。

定義済み幹細胞培地でレチノブラストーマ腫瘍細胞を培養すると、一次腫瘍球（tumorspheres）が形成されるが、これを増殖および維持できる期間は限定的である。

本手順の全体的な目的は、免疫不全マウスに正位性の網膜芽細胞腫を形成させ、さらなる実験に有用なモデルを構築し、腫瘍の増殖を可能にすることです。これは、まず原発腫瘍または異種移植腫瘍から細胞を回収し、in vitroで腫瘍スフィアを培養することで達成されます。手順の第2段階では、培養した腫瘍細胞をrag2 null免疫不全マウスの眼の硝子体腔または網膜下腔に注入します。手順の第3ステップでは、白光瞳孔（Leukocoria GLO）の拡大や眼周囲の膨張など、腫瘍形成の徴候がないか注射後のマウスを観察します。手順の最終ステップでは、ゼノグラフト腫瘍を回収します。最終的に、組織病理学的検査を通じて、マウスの眼球内に正位的な腫瘍が形成されたことを示す結果を得ることができます。眼内注射は非常に繊細な操作であるため、この手法を視覚的に示すことが極めて重要です。周囲の構造を正確に特定できなければ、容易に損傷させてしまう可能性があります。一般的に、この方法に不慣れな人は、腫瘍細胞を正しい位置に届けるために硝子体腔への精密な注射部位の配置が求められるため、習得に苦労します。この手法を用いることで、網膜芽細胞腫の生物学的な知見を得ることができます。また、遺伝子導入のためのベクターの眼内投与など、他のシステムにも適用可能です。まず、滅菌済みの組織培養処理済み10 centimeterディッシュに、新鮮な限定幹細胞培地を調製します。網膜芽細胞腫の腫瘍組織を配置し、乾燥を防ぐのに十分な量を残して過剰な輸送培地を吸引します。メスを用いて交差切断法で組織を機械的に解離させ、直ちに100 µLの定義済み幹細胞培地を組織に添加し、メスで細断した組織を静かに広げます。次に、ディッシュに10 mLの定義済み幹細胞培地を加えます。プレートを37 °C、5% CO2の加湿インキュベーター内で培養し、濁りやpHの変化がないか毎日点検します。十分な新規増殖が観察されるまで7〜10日間かけて、破壊された腫瘍組織からほぼ即座にいくつかの腫瘍球体が出現し、その数は増加していきます。その後は週に一度、腫瘍球体を300 ×gで5分間遠心分離します。新鮮に調製した定義済み幹細胞培地で再懸濁させ、ピペッティングを10回繰り返して、中心部が壊死した大きな球体を分散させ、新しく健康な球体が形成されるようにします。注入用に培養した腫瘍スフェアを調製するため、スフェアを15 mLコニカルチューブに静かに移します。ピペッティングを10〜15回緩やかに行い、スフェアを分散させます。トリパンブルーを用いて死細胞を除外しながら、ヘモサイトメーターで注入する細胞数を計測します。利用可能な細胞数と実験要件に基づき、必要な回数分の注入準備を行います。次に、チューブを300 ×gで5分間遠心分離します。上清を注意深く吸引し、細胞を5 mLで再懸濁します。PBSを用いて、遠心分離と吸引の工程をもう一度繰り返します。最後に、注入1回あたり10 µLの滅菌PBSで細胞を再懸濁します。処置に向けて動物の準備を行うため、まず麻酔をかけたマウスを加熱パッドの上に置きます。体温を維持するため、プロパノール塩酸塩を右目に1滴点眼し、1分間待機します。次に、フェニレフリン塩酸塩を右目に1滴点眼し、5分間待機します。瞳孔が散瞳しない場合は、さらにもう1滴点眼し、さらに5分間待機します。麻酔をかけた動物を顕微鏡下で横向きに置き、頭部をガーゼの上に載せます。右側を上に向け、右目のレッドリフレックス（赤色反射）が得られるように眼を中央に合わせます。顕微鏡で眼底を観察する際は、両手の指でまぶたを同時に優しく押し下げ、右眼球を支えます。この位置を固定したまま、以降の手順を進めます。ルアーロックシリンジに取り付けた滅菌済みの30ゲージ針を使用します。角膜縁に隣接するpars plana領域の結膜および強膜を側方から貫通し、脈絡膜を経て硝子体腔まで針を刺入します。開口部から針を抜きます。ハミルトン針をアルコールスワブで滅菌します。細胞懸濁液をハミルトンシリンジで吸引し、顕微鏡を通して、レンズ背後の硝子体内の網膜付近に針が見えるまで、針を開口部に挿入します。補助者の協力を得て、プランジャーを押し下げながら針をこの位置で固定し、ゆっくりと針を抜きます。必要に応じて、綿棒を使用して開口部の血液や液体を吸収させます。ゆっくりと圧力を緩め、マウスのまぶたを閉じさせます。動物を加熱パッドに戻し、回復させます。注射後の毎日、眼に白内障（leukocoria）が現れていないか確認してください。通常、注射後2〜4週間で顕在化します。腫瘍の増殖が認められたら、施設指針に従って動物を安楽死させます。実体顕微鏡下で、角膜縁に円周状の切開を加え、角膜と水晶体を除去し、ピンセットを用いて腫瘍塊の大部分を他の組織から慎重に切り出します。切り出した腫瘍を滅菌済みのRPMI 1640に置きます。ピンセットを使用して、視神経が露出するまで、開いた眼球を眼窩からゆっくりと引き出します。眼球を眼窩からそっと持ち上げながら、ハサミで視神経を切断します。この際、腫瘍による視神経浸潤を評価するため、可能な限り多くの神経を眼球側に残すようにしてください。その後、組織学的検査のために10%中性緩衝ホルマリン液に浸します。以下は、培養された腫瘍スフィアの例です。3日後では、分散させた腫瘍組織の中にわずかな腫瘍スフィアしか見られません。しかし、10日後には腫瘍スフィアの数が増加しています。注入から数週間後、右上の挿入図に示すように、球体は明瞭な外膜を呈しています。注入されたマウスは白瞳孔（leukocoria）を呈しており、この白い瞳孔反射は眼球後方に位置する腫瘍によるものです。hおよびdで染色された眼切片のこれらの例において、左側のガラス体腔を満たしている異種移植レチノブラストーマ腫瘍と、右側の擬似注入（mock injection）した眼におけるそのような増殖の不在に注目してください。このビデオを視聴することで、培養腫瘍細胞の調製方法、マウス眼球への適切な眼内注射の手順、および腫瘍の進行を確認する方法について十分に理解できるはずです。熟練すれば、注射の手技は1匹あたり約30分で完了します。適切に実施してください。腫瘍細胞は有害である可能性があるため、本手順の実施中は、白衣やマスクを含む適切なPPE（個人用保護具）の着用などの予防措置を常に講じることを忘れないでください。ヒトがん細胞は、常にBSL-2（バイオセーフティレベル2）条件下で扱う必要があります。

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