エンハンサートラップフリッパーゼの幼虫における発現と成人のマッピングとその応用ショウジョウバエ CNS

次の実験の全体的な目標は、GAL 80変換ツールで組織特異的リパーゼを使用してGAL 4の発現を改良することです。これは、エンハンサートラップPhilippeトランスジェニックフライラインのコレクションを生成し、各ラインにおけるリパーゼのCNS発現パターンを決定することによって達成されます。GFPレポーターIMMUNOCHEMISTRYおよびGFPレポートを使用して、GLをニューロン発現から区別し、関心のある行ETフリップラインでGAL 4発現を交差させることができます。子孫にGAL 80変換ツールを含むハエを横切る

クローン解析は、目などでのGAL4発現の精緻化を解析するために使用できます。この手法が既存の方法よりも優れている点は、エンハンサートラックのプレイベースのラインとGAL 80変換ツールを、フライコミュニティですでに利用可能なGAL4アライアンスの高速コレクションで使用できることです。さらに、この概念は、ゼブラフィッシュなどの他のGALI 4 UAS新興モデル生物に拡張することができます。

この方法は、行動の根底にある神経回路をマッピングする際の重要な質問に答えるのに役立ちます。このプロトコルは、光受容体細胞のサブセットにおけるフリップベースの使用を実証しているが、交差法は、非ニューロン組織を含む他の組織の分析に適用することができる。エンハンサートラップリパーゼラインが増えるにつれて、リパーゼラインが特徴付けられます。

痛風4 USは、ハエの生物学者によって広く使用されている重要な技術です。ほとんどのGALの4つのラインの1つの注意点は、指の方法を使用した脳の行動マッピングに使用するには広すぎる表現です。関心のあるTシャツでGAL4発現を微調整することはできません ETフリップ導入遺伝子を使用してGAL4発現ラインの発現を部分的に制限する前に。

まず、ET flip x two transgeneの発現パターンを知ることは、後期発達中の溶岩と成体におけるflip aの発現を視覚化するために役立ちます。CNSでは、ET t flip X two transgene of interestを持つ雄と、子孫からのet flip発現のためのGFPレポーターを抱く処女の雌との間に交配を設定します。さまよう3匹目のインスターF1幼虫を集めて解剖します。それらを清潔なSガードディッシュに入れ、絵筆で破片を取り除き、PBSを1回使用して皿を1回すすぎます。

今、氷のように冷たい1回PBSで皿を満たし、幼虫が溶岩の中枢神経系にアクセスするために麻酔をかけ、一対の鉗子でその口のフックを保持します。伸びる前方球面付近のキューティクルをつかみ、剥がします。CNSは、他のいくつかの構造とともにマウスフックに取り付けられたままです。

次に、鉗子を使用して、CNSを解剖するときに、CNSを取り巻く余分な構造をすべて取り除きます。それらをPBSで満たされた3つの世界のパイレックス皿に個別に移します。すべてのCNSを解剖したら、氷上の200マイクロリットルの4%PFAに完全に浸して固定します。

CNSが浮いた場合、周囲の組織はすべて完全に洗浄されていません。これが発生した場合は、15分間固定した後、一対の鉗子を使用してCNSを固定液に沈め、組織を氷冷PBS3回洗浄した後、組織を氷冷PBTでさらに3回洗浄します。これで、組織は抗体によるイメージングや標識、または後で使用するために摂氏4度のPBTで保存する準備が整いました。

幼虫が解剖前にF1成虫を収集するために使用されたのと同じ十字架からの染色。5〜10匹のハエを水に沈め、95%エタノールを30秒間冷やして、キューティクルの表面のワックスを取り除きます。エタノールを除去するには、成虫を氷冷PBS1回で3回洗浄し、3回目の洗浄後、そのうちの1つを氷冷PBS1回で満たされた35ミリメートルsilのガード皿に移して、成虫を解剖する準備をします。

腹側を上にして置き、腹部の途中にミニオンピンを挿入します。鉗子を使用して脚を切除することにより、解剖を開始します。次に、頭を支柱に固定し、同時にキューティクルを目の下から頭のてっぺんに向かって剥がして、頭のキューティクルを取り除きます。

鋭利な鉗子を慎重に使用して、脳の周囲の組織を取り外し、追跡します。なぜなら、追跡すると自己蛍光が強く、固定中に脳が浮かぶからです。脳は成体中枢神経系の一部にすぎません。他の部分は胸部の腹側神経索またはVNCであり、これも解剖する必要があります。

まず、フライを後ろ足の付け根に固定し、胸部キューティクルを首の付け根までそっと引き抜くことで、胸部キューティクルを取り除きます。次に、VNCを露出させるために、胸部キューティクルの2つの半分を静かに広げます。第三に、2番目の脚の基部を固定し、最初の腹部の攪拌の夜の近くから腹部を引き離すことにより、胸部から腹部を取り出します。

第四に、上腕骨領域で固定し、VNCを囲む組織をそっと剥がして、VNCを清掃します。頸部結合部を囲む結合組織のリングを引き裂き、脳を採取しながら余分な組織を取り除き続けます。そしてVNCは、それらを梨として9つの世界のパイレックス皿に移し、PBSを氷上に冷やした1回で満たします。

成体組織を固定するには、4%PFAに氷上で15分間浸します。氷冷PBSウォッシュ3回とPBTワッシャー3回でお風呂に続きます。これで、組織は抗体によって画像化または標識され、導入遺伝子の発現を正確に解析する準備が整いました。

CNSをニューロンマーカーまたはグリアマーカーで標識すると、参照フレームを提供するために、翌日にニューロンまたはグリアに対する抗体を使用して組織を摂氏4度で一晩インキュベートすることから始めることが有用です。調製物をPBTで5回洗浄し、蛍光二次抗体と室温で2時間インキュベートします。インキュベーション終了後の抗体の光退色を防ぐために、プレートとホイルを包みます。

調製物をPBSで洗浄し、調製物をスライドに全体にマウントします。OSHAプラスチックリングを使用して、カバースリップによってティッシュが押しつぶされるのを防ぎます。これで、神経系のGFPおよびLL発現パターンを蛍光顕微鏡で調べる準備が整いました。

通常、フリップ発現パターンの再現性を判断するために、3〜5回の反復が検討されます。フリップの発現パターンは、GALの4つのリプレッサーGAL80の発現方法を変更するために、ラインを他の導入遺伝子と共に使用することができます。GAL 80リプレッサーの発現を変更することは、変更を加えるための効果的な方法です。

GAL4発現では、1つの方法は、導入遺伝子GAL80発現がGAL4を不活性化することでGAL80発現を反転させることであり、これはそうでなければ眼全体の眼変性を促進します。ETフリップラインハッシュ6 88 Aは、F1子孫の光受容体のサブセットにおけるGAL80変換ツールの有効性を評価するためにここで使用され、眼の表現型を親株の眼の表現型と比較します。眼の変形または色素脱失の出現は、フリップ発現パターンが光受容体に存在し、GAL 80フリップアウトが成功したことを確認しています。

補完的な非冗長戦略は、関心のある同じフリップラインを使用してGAL 80発現を反転することです。この戦略は他の戦略と非常によく似ていますが、現在ではF1子孫のID色素沈着と変性が抑制されています。フリップXの2で。

光受容体の発現 一度習得すると、CNSの解剖は、適切に行われれば、成虫で約5分、幼虫で約1分で行うことができます。この手順を試みるときは、鋭い鉗子を使用して、成人とリブレCの両方の周囲の気管と組織を取り除くことが重要であり、解剖には固定剤を含まない皿を使用することが重要です Ss.It。現在、ヒートショックフリップはランダムなクローンを生成するために使用されています。

対照的に、エンハンサートラップフリップは、再現性のあるクローンを生成することを可能にし、形態学的および行動学的分析を容易にします。フィンガーメソッドのもう一つの強みは、アナントラップフリップベースのラインや他のギャルラインを追加することで、GALの4つの発現パターンをさらに制限できることです。チューブリンストップGAL80構成の弱点は、GA4とLAG4やU-A-S-K-I-RなどのUASエフェクターの特定の組み合わせは、ハエを殺すため互換性がないことです。

この問題は、UAS Shiri Tsなどの条件付きUASエフェクタを使用することで容易に克服でき、これにより、制限された温度での動作を調べることができます。すべてのエンハンサートラップリパーゼラインが有用であるのに十分な高レベルのリパーゼを発現するわけではありません。それにもかかわらず、ここで説明するフィンガー技術は、ショウジョウバエの研究者が発達回路または挙動のいずれかでモザイク解析を洗練するための新しいアプローチを提供します。