運動によって変調された神経細胞の生理的、形態学的および神経化学的キャラクタリゼーション

テクニックは運動中に哺乳類の神経細胞の生体内生理的反応の定量化と神経形態、神経化学的表現型とシナプス超小型回路とニューロンの生理学を相互に関連付ける説明されています。

この手順の全体的な目標は、運動中の単一ニューロンの生理学的応答を記録し、これらのニューロンの形態と神経化学をさらに特徴付けることです。これは、最初に動物に麻酔をかけ、外科的に準備することによって達成されます。次のステップは、運動中の単一ニューロンの細胞内応答を電気生理学的に記録することです。

動物を灌流し、脳を処理した後、最後のステップは、生理学的応答とニューロンの形態を視覚化して分析することです。最終的に、細胞内ニューロンの記録、免疫化学、および分析の技術が組み合わさって、運動中の単一ニューロンの膜電位の調節が示されました。この技術が細胞培養のような既存の方法よりも優れている主な利点は、ニューロンの接続とシナプス入力が保持され、ニューロンがex自己切開されず、人工培地に配置されないことです。

翌日、ラットに麻酔をかけ、それを加熱パッドの上に置き、無菌技術を使用して動物のバリカンで後頭蓋骨を覆うように皮膚を剃ります。大腿部の内側に沿って切開を行い、カニューレを大腿静脈に挿入して追加の麻酔を行います。別のカニューレを大腿動脈に挿入して、血圧を監視します。

最後に、カニューレを気管に挿入します。次に、ラットを定位固定装置フレームに入れます。開頭術を行って小脳を露出させ、頭頂骨と頭頂間骨の接合部の真下にある大きな静脈洞を避けます。

次に、温めた鉱物油で脳の表面を覆います。次に、下顎骨を電磁バイブレーターに結合されたロッドに接着します。下顎骨の動きは、信号発生器からバイブレータへの指令信号によって制御されます。

次に、開頭術に隣接する皮膚の下に接地電極を配置します。細胞内電極の準備には、IDEまたはテトラエチルロッドドミン染料溶液試験でマイクロ電極をプーレン充填します。その電極インピーダンスは、大口径軸索の場合は60〜80メガオーム、小さな求心性軸索とニューロン間細胞の場合は80〜150メガオームです。

次に、動物の頭の後ろに固定された小さな望遠鏡を使用して、微小電極を電位計のヘッドステージに配置します。望遠鏡の20 x で囲まれた赤目を通して微小電極を視覚化します。対象領域は、下丘の下境界まで約0.5ミリメートルのコ

次に、脳の表面の正確な位置を特定できるように、ピアメーターに小さな開口部を作ります。静電容量フィードバックを過剰に補償して、電極が脳に触れるとフィードバック信号が生成されるようにします。電極が脳に入るまで電極を進めます。

次のステップは、下顎骨の繰り返し変位を活性化することです。次に、ステッピングモーターを使用して、電極を脳内に進めます。ニューロンの串刺しがDC電位の突然の低下と進行中のシナプス活動によって示される場合は、電極の進行を停止します。

貫通が安定していると見なされたら、ランプアンドホールドと正弦波の顎の動きを開始します。ニューロンの応答を記録し、その応答に基づいてニューロンを特徴付けます。次に、ニューロンの受容野をマッピングするために、鈍いプローブを使用して、頭の周りと口腔内の皮膚を探索します。

筋肉の収縮や有害な刺激などの他の刺激に対するニューロンの応答を調査します。録音が完了したら、1〜4ナノアンペア、DC電流を注入して、合計15〜70ナノアンペア分を注入します。電極の浸透を監視し、電流注入を中止します。

膜電位がマイナス30ミリボルトよりもプラスになったら、次のステップは脳組織を切片にすることです。動物を安楽死させて灌流した後、脳を取り出します。次に、正面、矢状、または水平面のいずれかで50〜100ミクロンのセクションを切断します。

標識された感覚ニューロンとさまざまな運動ニューロンとの関係を視覚化するために、組織に応じてH-R-P-D-A-Bまたはテキサスレッドの組織を処理し、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡または定量的共局在ソフトウェアを使用して追加の分析を行うことができます。必要に応じて、シナプトフィジンに対して免疫化学的処理を行い、標識ニューロン内のシナプスを正確に位置特定することができます。この図は、電気生理学的特性評価後にIDEを注入した脳幹ニューロンを示しています。

運動中のニューロン応答に基づいて、このニューロンは二次筋紡錘求心性ニューロンとして識別できます。茶色の輪郭は、三叉神経運動核の位置を示しています。この図は、顎の変位中の感覚ニューロンの生理学的応答を示しています。

ニューロンの応答は、瞬間的な発火頻度として表されます。この応答は下顎の変位を密接に模倣しており、この特定のニューロンが下顎の位置に関連する感覚フィードバックを提供することを示していることに注意してください。この図は、筋肉のプローブ中に反応した感覚ニューロンを示しています。

ニューロンは、免疫化学的処理後にideで染色されました。赤い腫れとして現れるシナプスバトンは、黄色のシナプトフィジンと共局していることがわかります。グリーンは蛍光性のミサイルステインです。

この図は、筋紡錘一次求心性ニューロンからの軸索のアニメーションです。標識されたニューロンの複数の光学セクションを使用して、アニメーションを生成しました。この手順に続いて、電気顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、前部グレードまたは逆行性ニューロン標識などの他の方法を実行して、シナプスBNおよびニューロン接続を持つ神経伝達物質のニューロン共局在のニューロンの超構造特性に関する追加の質問に答えることができます。