運動によって変調された神経細胞の生理的、形態学的および神経化学的キャラクタリゼーション

本手順の目的は、運動中の単一ニューロンの生理学的反応を記録し、さらにこれらのニューロンの形態および神経化学的特性を明らかにすることである。まず、動物を麻酔し、外科的に処置する。次に、運動中の単一ニューロンの細胞内反応を電気生理学的に記録する。

動物の灌流と脳の処理後、最終ステップとして生理学的反応とニューロン形態の可視化および解析を行います。最終的に、細胞内ニューロン記録、免疫化学および解析の手法を組み合わせることで、運動中の単一ニューロンにおける膜電位の変調を明らかにします。細胞培養などの既存手法と比較した本手法の主な利点は、ニューロンの接続とシナプス入力が維持されており、ニューロンが体外に切り離されたり人工培地に置かれたりすることがない点にあります。実験の前日に、運動ニューロンを逆行性に標識するため、西洋わさびペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）などのニューロントレーサーを末梢標的領域に注入します。

翌日、ラットを麻酔し、ヒーティングパッドの上に置く。無菌操作を用いてアニマルクリッパーで後頭部上の皮膚を剃毛する。内腿に切開を加え、追加麻酔用に大腿静脈にカニューレを挿入する。血圧をモニターするため、大腿動脈に別のカニューレを挿入する。

最後に、気管にカニューレを挿入します。次に、ラットを脳定位固定装置に固定します。頭蓋骨を切開して小脳を露出させますが、その際、頭頂骨と間頭頂骨の接合部の直下にある大きな静脈洞を傷つけないよう注意してください。

次に、脳の表面を温めたミネラルオイルで覆います。続いて、下顎を電磁振動子に連結したロッドに接着します。下顎の動きは、信号発生器から振動子に送られる指令信号によって制御されます。

次に、開頭部位に隣接する皮膚下に接地電極を配置します。細胞内電極を準備するため、微小電極をIDEまたはテトラエチルアンモニウムジヨード染料溶液で満たします。電極インピーダンスは、大径軸索では60〜80 MΩ、小径求心性軸索および介在ニューロンでは80〜150 MΩとなります。

次に、動物の頭部の背後に固定された小型望遠鏡を用いて、マイクロ電極をエレクトロメータのヘッドステージに挿入します。望遠鏡の20倍接眼レンズを通してマイクロ電極を確認してください。標的領域は、下丘の下縁から内側に約0.5 mmの位置にあります。

次に、脳表面の正確な位置を特定できるよう、軟膜に小さな開口部を作ります。電極が脳に接触した際にフィードバック信号が生成されるよう、静電容量フィードバックを過剰に設定します。電極を脳内に挿入するまで前進させます。

次のステップは、下顎の反復的な変位を活性化させることです。次に、ステッピングモーターを使用して、電極を脳内に進めます。直流電位の急激な低下と持続的なシナプス活動によってニューロンへの刺入が示されたら、電極の前進を停止します。

穿刺が安定したと判断したら、ランプ・アンド・ホールドおよび正弦波状の顎運動を開始します。ニューロンの反応を記録し、その反応に基づいてニューロンの特性評価を行います。次に、ニューロンの受容野をマッピングするため、鈍端プローブを用いて頭部周辺および口腔内の皮膚を探索します。

筋収縮や有害刺激などの他の刺激に対するニューロンの反応を調査します。記録が完了したら、1〜4 nano ampの直流電流を注入し、総注入量を15〜70 nano amp minutesにします。電極の貫通状態をモニターし、電流注入を停止してください。

膜電位が-30 millivoltsより正になった場合は、次に脳組織の切片作成を行います。動物を安楽死させ、灌流した後に脳を取り出します。その後、前頭面、矢状面、または水平面のいずれかで50から100 micronの厚さに切片を作成します。

ラベル付けされた感覚ニューロンとさまざまな運動ニューロンとの関係を可視化するには、組織に応じてH-R-P-D-A-BまたはTexas redで組織処理を行い、蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡による追加解析、または定量的な共局在解析ソフトウェアを用いた解析を行います。必要に応じて、ラベル付けされたニューロン内のシナプスを正確に特定するために、シナプトフィジンを用いた免疫化学的処理を行うことができます。この図は、電気生理学的な特性評価後にIDEを注入した脳幹ニューロンを示しています。

運動中のニューロン反応に基づき、このニューロンは二次筋紡錘求心性ニューロンとして同定できます。茶色の枠線は三叉神経運動核の位置を示しています。この図は、下顎の変位時における感覚ニューロンの生理学的反応を示しています。

ニューロンの応答は、瞬時発火頻度として的に表されています。この応答は下顎の変位を密接に模倣しており、この特定のニューロンが下顎の位置に関連する感覚フィードバックを提供していることを示している点に注目してください。この図は、筋肉のプローブ操作中に応答した感覚ニューロンを示しています。

免疫化学的処理の後、ニューロンをideで染色した。赤色の膨隆として現れているシナプスバトンが、黄色のsynaptophysinと共局在しているのが見て取れる。緑色は蛍光ミッシル染色である。

この図は、筋紡錘一次求心性ニューロンの軸索のアニメーションです。ラベル化されたニューロンの複数の光学切片を用いて、このアニメーションを作成しました。この手順の後、電子顕微鏡、共焦点顕微鏡、および順行性または逆行性ニューロンラベル法などの他の手法を用いて、ニューロンの超微形態的特性、神経伝達物質とシナプス小胞の共局在、およびニューロンの接続性に関するさらなる疑問を検討することが可能です。