Name: 運動によって変調された神経細胞の生理的、形態学的および神経化学的キャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-21T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 学ぶ運動中の哺乳類神経細胞の生理応答記録法。細胞内記録と免疫化学を組み合わせ、形態・神経化学的表現型とシナプス回路との関連を解析します。神経接続を保持したin vivo解析が可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私は 、in vivo細胞内記録と細胞内染色の技法の初期の開発に関するヘルプは、ブラウンとDavid Maxwell ので最初の訓練のためにアンソニーテイラーに感謝。私はcollocalizationマクロのヘルプはM.シルバーに感謝。多くの学者は、誰と私はR.東亜、M.森谷、P.羅、R. Ambalavanarを含むこの技術の開発に提供する洞察力を協力してきました。この手法は、NIHの助成金DE10132、DE15386とRR017971からかなりのサポートと開発されました。

1。動物の準備<ol><li>ペントバルビタールナトリウム（50mg/kg IP）と加熱パッド上の場所でラットを麻酔。動物のバリカンで後部頭蓋骨を覆う皮膚を剃る。麻酔のレベルの手術レベルはつま先を挟まないだけでなく、眼瞼反射欠如である場合撤退の反射や発声の有無をテストすることによって得られていることを保証するために動物を確認してください。麻酔15分ごとのレベルを確認し、ペントバルビタールナトリウム15mg/kgの注射は45分ごとでanesthetisaの外科的レベルを維持する。 </li><li>無菌操作を使用し、腹部と太ももの内側で形成された皺に鼠径部の切開だけで遠位にし、大腿静脈にカニューレ（1ミリメートル直径、クレイアダムス）、および大腿動脈に挿入する。顎下部の正中切開を行う、舌骨下筋を反映している。気管に小さな切開を行い、換気を可能にするカニューレを（直径2mm）を挿入します。動脈カニューレを介してplace.Monitor全身収縮期血圧および拡張期血圧でそれを確保するcannual trachael周り縫合糸をTYE。撤退と眼瞼反射の監視に加えて、今麻酔のレベルを評価するために血圧を監視する。静脈カニューレを介して必要なときに追加の麻酔を管理します。 </li><li>定位フレームにラットを置いて、小脳を露出させる開頭術を行います。齧歯類の人工呼吸器に気管カニューレを取り付けます。加湿空気と100/minの割合で2 cm 3の体積で動物を換気する。 1センチメートルH 2 Oの正側呼気圧力は肺の虚脱を防ぐために維持されるべきである。 15分ごとに無気肺を防ぐために、肺に超インフレにする。その後、温めたミネラルオイル（30℃）で脳の表面を覆う。直接壁と壁間の骨の間の接合部の下にある大静脈洞を避けるように注意してください。 </li><li>電磁振動に結合ロッドにシアノアクリレート接着剤を適用すると顎の正中離開でロッドを取り付けます。どちら/ Dコンピュータの出力または信号発生器から振動子に下顎を使用してコマンド信号を移動します。 </li><li>開頭術に隣接して皮膚の下に電極を接地siliver - 塩化銀を置きます。 </li></ol> 2。電極の準備<ol><li>水平方向の微小電極プラーを使用して石英やアルミノシリケートガラスから微小電極を作製。 </li><li> 0.25M KClおよび0.5Mトリス塩酸緩衝液（pH7.6）または生理食塩水で2％tetramethlyrhodamine（pHは6）に溶解した5〜10％のbiotinamideに微小電極を埋める。電極のテスターと電極のインピーダンスを確認してください。大径の軸索から記録するには60 - 80MΩのインピーダンスを持つ電極を作る、小さな軸索および介在、80 -150MΩのインピーダンスと電極を作る。 </li><li>エレクトロメータのヘッドステージに微小電極を配置。動物の頭の後ろの位置に固定されている小さな望遠鏡（同封のレチクル付き20X）を介して電極を視覚化する。それは電極を定位を高い精度で配置されることができるため、望遠鏡を使用することが重要です。 </li></ol> 3。電気生理学的記録と細胞内染色<ol><li>軟膜の小さな開口部を作成し、電極が脳に触れるとフィードバック信号が生成されるように容量のフィードバックを過度に補償する。これは、脳の表面の正確な位置を可能にします。 </li><li>繰り返される下顎変位を生成し、ステッピングモータと、脳に電極を進める。 </li><li>直流電位の急激な低下によって神経impalementsを認識し、継続的なシナプス活動によってintrasomatic神経impalementsを識別する。静電容量の過補償と電極を賑わっまたはめったに成功した細胞の浸透を生成しないタップ。ため、電極の高インピーダンスから、神経細胞応答はほとんど浸透する前に観察されない。 </li><li>あなたがニューロンを突き刺すと浸透が安定したと判断された後、ランプとホールドと正弦波顎の動きを使って神経細胞の応答を特徴付ける。マップ5ニューロンの受容野を非導電性プローブを用いて頭の周りの皮膚と内口腔をプローブすることにより木の棒など。研究に関連する場合、そのような筋収縮や侵害刺激のような他の機能的に関連刺激に対するニューロンの応答を調べて6一次求心性侵害受容ニューロンの受容体は、侵害刺激に応答する。ペントバルビタールナトリウムのような一般的なanestheseticsは、一次求心性ニューロンの軸索の伝導をブロックするのではなく、シナプス伝達を抑制することはありません。したがって、一次求心性神経細胞軸索の軸索伝導が維持されます。 </li><li> 15 70nA分の総噴射時間のために（DC、1 - 4NA）電流を注入。電流注入時の電極の侵入を監視し、膜電位が- 30mVのより肯定的になれば中止する。</li></ol> 4。組織の処理<ol><li>リンス血管にペントバルビタールの過剰投与（140mg/kg IV）と浸み込ませることにより動物を安楽死させる（0.9％塩化ナトリウム38℃ヘパリンと1ミリリットルの2％のCを含む500台を0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）中4％パラホルムアルデヒドに続いてキシロカイン。 </li><li>それはどちらの正面、矢状または水平面でビブラトームを用いて50 -100μmの時に脳やセクションを削除します。 Secionsは25℃のPBSで自由に浮遊して収集されます。 </li><li> 1から2パーセント正常ヤギ血清でインキュベートすることによりDABのための脳、1％トリトンX - 100、0.01M PBSでの処理アビジンビオチン複合体（1:50エリートステイン）でインキュベートした。 H 2 O 2とニッケル- DABを使用してセクションを反応する。テキサスレッド、4℃で一晩、PBSのアビジン - ビオチン複合体（1:50）で切片をインキュベート℃、その後4℃で一晩PBSTで4％テキサスレッドアビジンDCSでイン​​キュベート。ために処理するために23℃で蛍光ニッスル染色（NeuroTrace）20分で切片を対比</li><li>ニューロンは、ローダミンで注入した場合、蛍光顕微鏡（例545nm）を直接注入ニューロンを可視化する。 </li></ol> 5。逆行性標識法と組み合わせる方法、免疫細胞化学、共焦点イメージング、定量的局在解析他の方法でこの手法を組み合わせるの成功は、優れた細胞内ラベリングに大きく依存します。 <ol><li>方法は簡単に逆行性神経細胞のラベリングと組み合わせることができますここで可視化した。これを行うには7-10、動物を麻酔し、無菌操作を使用して、このような西洋ワサビペルオキシダーゼ（20％西洋ワサビペルオキシダーゼ。シグマVI、シグマ）などの神経トレーサーを注入し、1％小麦胚芽は、咬筋などのペリフェラルターゲット領域に西洋ワサビペルオキシダーゼ（Sigma）をaggultinated。このニューロントレーサーは、末梢軸索に取り込まと運動ニューロンのsomaの複数形に軸索輸送を介して輸送されます。咬筋の場合は、トレーサーの15μlの滅菌10マイクロリットルのマイクロシリンジを用いて筋肉に注入されます。麻酔から回復し、回復のために自分のケージの中で供されるまで、動物を加熱パッド上に配置して監視されます。 24時間後、動物を麻酔し、生理学的に神経細胞を特徴づけ、細胞内でそれらを染色。その後、コバルトと安定剤や強化などのchromagenとタングステン酸ナトリウムとしてテトラメチルベンジジン（TMB）を使用して、HRPの存在のために上記のように動物やプロセスの組織切片を灌流。 1％ナトリウムの場所のセクションを0.1M PBS（pH6.5）で、15で無水エタノールやアセトンに溶解した0.0007％TMBに溶解し、タングステン酸℃で20分間。て0.3％60分間インキュベーション溶液の100mlあたりH 2 O 2の1.0mlを添加することにより組織切片を反応する。 0.05％ジアミノベンジジン液（pH7.4）、0.02％、コバルト、及び0.01％H 2 10分間0.1M PBS（pH7.4）中のO 2で0.1M PBS（pH6.5）での組織や場所をすすぎます。 37℃説明されているようbiotinamideを注入されたニューロンの可視化のための組織を処理し、標識の感覚ニューロンと運動ニューロンの様々な間の関係を視覚化する。 </li><li>ここに示されているテクニックも容易にimmnocytochemistryと組み合わせることができます。6例として、免疫細胞化学的に正確にラベルされたニューロン内のシナプス（ 図3）を見つけるためにシナプトフィジンのための脳の処理。これを行うには、4℃で2日間C、その後23℃1時間のために抗マウスFITC（1:400）でインキュベーション℃でマウス抗シナプトフィジン抗体（1:10,000）の脳切片をインキュベート</li><li>蛍光マーカーで標識または蛍光イメージングのために処理のニューロンは、共焦点イメージングに最適です。図3は、軸索のブートンを通じて共焦点顕微鏡で得られた光学部の一例です。 （ 図3）。ラベル付けニューロン（ 図4）を介して複数の光のセクションを取得することにより標識されたニューロンのアニメーションを生成する。 </li><li>この方法で標識されたニューロンは、定量的局在の解析に使用することができます。これを行うには、NIHイメージ（http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htmで発見）と一緒に公開されているソフトウェアのマクロを使用してください。シナプトフィジン免疫細胞との細胞内のラベルを結合して単一の軸索終末内シナプトフィジンをローカライズする。6 </li></ol> 6。代表的な結果： この方法を使用して取得することができる代表的な結果の概要を図1に示します。この単一の脳幹ニューロンが電気生理学的に明確に見られるように、下顎運動中に記録していた、このニューロンの応答（ 図1左、水色下）が運動中に変調だった。このニューロンは電気生理学的特性評価後にbiotinamideを注入し、続いて視覚化のために処理した。再構築されたニューロン（ 図1中央の、緑色は）本当のことができます解剖学的ランドマーク、この場合には三叉神経運動核が指定（赤枠）のテッド。運動と再構成するときに、神経細胞の応答に基づいて、このニューロンは二筋紡錘求心性ニューロンとして同定することができる。 図2は、顎の変位時のニューロンの生理学的応答の代表的な例を示します。ニューロンの応答は瞬時発火頻度として表されます。神経細胞の応答が密接にこの特定のニューロンは下顎の位置に関連した感覚フィードバックを提供することを示す下顎変位を模倣している。 図3は、ノートでは、シナプスの染色とニッスル染色と組み合わせて細胞内で染色された軸索の高倍率の画像です。軸索神経繊維末端内シナプトフィジン（黄色）の共局在を注意してください。 図4は、シングル、生理学的特徴および細胞内に標識されたニューロンのアニメーションです。 <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1の方法の概要。左上：下顎の変位。単一のニューロン（黄色）から中央の細胞内記録（緑）。このニューロンの形態は、細胞内記録と注射後に再建されました。赤いアウトラインは三叉神経運動核の位置を示します。左下：顎運動時に、このニューロンの生理学的な応答を。 <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2下顎運動中に生体内で記録された単一の筋肉感覚神経の代表的な生理的反応。顎の変位と神経細胞応答の類似性に注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> プロービング筋肉中に応答した細胞内染色の感覚ニューロンのシナプスboutons（赤い腫れ）と図3。ターミナル軸索分岐。シナプトフィジンの後続免疫細胞化学的処理は、軸索ブートン（黄色）内のシナプトフィジンの局在を示しています。グリーンは蛍光ニッスル染色です。 図4。生理反応下顎運動時の生体内で記録された筋紡錘一次求心性ニューロンの軸索のアニメーションは、軸索は、細胞内染色し、可視化のために処理した。 <a href="/files/ftp_upload/2650/collateral4.avi">ここで図4の高解像度のビデオをダウンロード</a> <a href="/files/ftp_upload/2650/medres.mov">ここで図4の中解像度のビデオをダウンロード</a>

<ol><li>Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+sinusoidal+electrical+waves+along+the+spinal+cord+during+a+fictive+motor+task%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task.</a> J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).</li>
<li>Frigon, A., Gossard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+specialized+rhythm-generating+mechanisms+in+the+adult+mammalian+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord.</a> J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).</li>
<li>Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+cortical+representation+of+hand+translation+and+rotation+during+reaching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching.</a> J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).</li>
<li>Ma, C., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+investigating+cortical+control+of+stand+and+squat+in+conscious+behavioral+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys.</a> J. Neurosci. Meth. 192, 1-6 (2010).</li>
<li>Dessem, D., Donga, R., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary-+and+secondary-like+jaw-muscle+spindle+afferents+have+characteristic+topographic+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Primary- and secondary-like jaw-muscle spindle afferents have characteristic topographic distributions.</a> J. Neurophysiol. 77, 2925-2944 (1997).</li>
<li>Dessem, D., Moritaini, A., Ambalavanar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+craniofacial+muscle+primary+afferent+neurons+synapse+in+both+the+rostral+and+caudal+brain+stem%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem.</a> J. Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).</li>
<li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inputs+from+identified+jaw-muscle+spindle+afferents+to+trigeminothalamic+neurons+in+the+rat%3A+a+double-labeling+study+using+retrograde+HRP+and+intracellular%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular.</a> J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).</li>
<li>Dessem, D., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jaw-muscle+spindle+afferent+feedback+to+the+cervical+spinal+cord+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).</li>
<li>Luo, P., Wong, R., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+jaw-muscle+spindle+afferents+to+the+caudal+brainstem+in+rats+demonstrated+using+intracellular+biotinamide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide.</a> J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).</li>
<li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+anatomy+of+physiologically+identified+jaw-muscle+spindle+afferent+terminations+onto+retrogradely+labeled+jaw-elevator+motoneurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).</li>
<li>Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+intermingled+with+orexin+and+MCH+neurons+in+the+lateral+hypothalamus+discharge+maximally+during+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).</li>
<li>Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juxtacellular+labeling+of+tonically+active+neurons+and+phasically+active+neurons+in+the+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum.</a> Neuroscience. 168, 395-404 (2010).</li>
</ol>

動物実験は、実験動物の管理と使用に関するガイドに記載されているguidlinesと規則に従って（NIH出版番号86から23まで、1985年改訂）とメリーランド州の動物実験委員会の大学で行われた。

ここに示した方法は、単一ニューロンの機能に重要な洞察を提供し、どのように個々のニューロンの応答は、神経回路に貢献する強力な手法です。9この知識は、感覚運動機能を理解する上での基本です。この手法の最大の強みは、生理学、形態とシナプス形態と分布を含むニューロンに関する多数のパラメータの決定を可能にされているです。そのようなような神経回路のような逆行性神経標識の追加情報など、他の手法と組み合わせることで、特徴づけることができる。この方法の7,8別の利点は、ステップで学習できることです。例えば、細胞内記録は、免疫細胞や初期メソッドの習得後に追加された逆行性神経標識と細胞内染色に続いて、最初に行うことができる。おそらく、技術の最大の制限は、神経細胞の数が少ないがいずれの実験で標識することができるということです。通常、特定の生理型の2〜3のニューロンは、最初に表示されています。生理学と形態との間の潜在的な関係が定式化されると、追加の実験は慎重にのみ、単一のニューロンが標識されている実験ではこの関係を確認するために使用されます。 この方法の成功の最も重...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬や機器の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>電磁バイブレータ</td><td>リン動的システム</td><td> V101 </td><td></td></tr><tr><td>信号発生器</td><td>フィードバックシステム</td><td> PFG605 </td><td>台形の出力信号を作り出すことができる</td></tr><tr><td>電極のガラス</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> AF100 - 68から10 </td><td>フィラメントと</td></tr><tr><td>電極プラー</td><td>サターインスツルメンツ</td><td>モデルP - 2000やP - 80 </td><td></td></tr><tr><td> biotinamide </td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> SP - 1120 </td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td>テキサスレッドアビジンDCS </td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> - 2016 </td><td></td></tr><tr><td> tetramethlyrhodamine </td><td>分子プローブ</td><td> D - 3308 </td><td> 3000分子量、リジン修正可能な</td></tr><tr><td>マウス抗シナプトフィジン抗体</td><td>ケミコン</td><td> MAB5258 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光ニッスル染色</td><td> Neurotrace、分子プローブ</td><td> N - 21480 </td><td></td></tr><tr><td>電極のテスター</td><td>ウィンストンエレクトロニクス</td><td> BL - 1000 - B </td><td>電極のインピーダンスを測定する</td></tr><tr><td>電位計</td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td> Axoprobe 1A、Axoclamp 2B </td><td></td></tr></tbody></table>

運動によって変調された神経細胞の生理的、形態学的および神経化学的キャラクタリゼーション

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

個々の神経細胞と神経回路におけるそれらの機能の役割は、感覚と運動機能の神経機構を理解する上での基本です。動物が運動中に静的1,2または記録細胞外神経活動のときに感覚運動メカニズムのほとんどの研究は、神経細胞のいずれかの検査に依存しています。3,4これらの研究は、感覚運動機能のための基本的な背景を提供しているが、彼 ​​らはどちらかの機能的な情報を評価しないこれは、運動中に発生した場合、または完全にニューロンの解剖学、生理学、神経化学的表現型を特徴づけるために彼らの能力は限られています。技術は生体の運動の中に個々のニューロンの大規模な特性評価を可能にするここに示されています。この手法は、一次求心性神経細胞を研究するだけでなく、運動ニューロンと感覚運動の介在を特徴づけるためにだけ使用できます。最初に単一ニューロンの応答は、ニューロンの受容野の決定に続いて下顎骨の様々な動きの間に電気生理学的手法を用いて記録されます。神経トレーサーは、細胞内ニューロンに注入され、脳は、ニューロンが光、電子または共焦点顕微鏡（図1）可視化できるように処理されます。神経形態はニューロン（図2,3）の生理的応答と相関させることができるように特徴づけられる神経細胞の詳細な形態は、再構築されます。この通信ではこの手法の実装を成功させるための重要なキーの詳細とヒントが提供されています。貴重な追加情報は、他の技術とこの手法を組み合わせることにより、研究対象のニューロンのために決定することができます。逆行性神経標識は、標識されたニューロンのシナプスなるとニューロンを決定するために使用することができる、従って神経回路の詳細な測定を可能にします。免疫細胞は標識されたニューロン内の神経伝達物質を調べ、設定されたラベル付きニューロンのシナプスニューロンの化学的表現型を判定するために、このメソッドと組み合わせることができます。標識されたニューロンは、超微細構造の特徴とラベルされたニューロンの超小型回路を決定するために電子顕微鏡のために処理することができます。全体的にこのテクニックは、徹底的にこのように感覚運動機能におけるニューロンの役割にかなりの洞察を可能にする生体運動の中に神経細胞を特徴づけるために強力な方法です。

テクニックは運動中に哺乳類の神経細胞の生体内生理的反応の定量化と神経形態、神経化学的表現型とシナプス超小型回路とニューロンの生理学を相互に関連付ける説明されています。

個々のニューロンの役割およびニューロン回路におけるその機能は、感覚および運動の神経メカニズムを理解する上で不可欠です。

本手順の目的は、運動中の単一ニューロンの生理学的反応を記録し、さらにこれらのニューロンの形態および神経化学的特性を明らかにすることである。まず、動物を麻酔し、外科的に処置する。次に、運動中の単一ニューロンの細胞内反応を電気生理学的に記録する。動物の灌流と脳の処理後、最終ステップとして生理学的反応とニューロン形態の可視化および解析を行います。最終的に、細胞内ニューロン記録、免疫化学および解析の手法を組み合わせることで、運動中の単一ニューロンにおける膜電位の変調を明らかにします。細胞培養などの既存手法と比較した本手法の主な利点は、ニューロンの接続とシナプス入力が維持されており、ニューロンが体外に切り離されたり人工培地に置かれたりすることがない点にあります。実験の前日に、運動ニューロンを逆行性に標識するため、西洋わさびペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）などのニューロントレーサーを末梢標的領域に注入します。翌日、ラットを麻酔し、ヒーティングパッドの上に置く。無菌操作を用いてアニマルクリッパーで後頭部上の皮膚を剃毛する。内腿に切開を加え、追加麻酔用に大腿静脈にカニューレを挿入する。血圧をモニターするため、大腿動脈に別のカニューレを挿入する。最後に、気管にカニューレを挿入します。次に、ラットを脳定位固定装置に固定します。頭蓋骨を切開して小脳を露出させますが、その際、頭頂骨と間頭頂骨の接合部の直下にある大きな静脈洞を傷つけないよう注意してください。次に、脳の表面を温めたミネラルオイルで覆います。続いて、下顎を電磁振動子に連結したロッドに接着します。下顎の動きは、信号発生器から振動子に送られる指令信号によって制御されます。次に、開頭部位に隣接する皮膚下に接地電極を配置します。細胞内電極を準備するため、微小電極をIDEまたはテトラエチルアンモニウムジヨード染料溶液で満たします。電極インピーダンスは、大径軸索では60〜80 MΩ、小径求心性軸索および介在ニューロンでは80〜150 MΩとなります。次に、動物の頭部の背後に固定された小型望遠鏡を用いて、マイクロ電極をエレクトロメータのヘッドステージに挿入します。望遠鏡の20倍接眼レンズを通してマイクロ電極を確認してください。標的領域は、下丘の下縁から内側に約0.5 mmの位置にあります。次に、脳表面の正確な位置を特定できるよう、軟膜に小さな開口部を作ります。電極が脳に接触した際にフィードバック信号が生成されるよう、静電容量フィードバックを過剰に設定します。電極を脳内に挿入するまで前進させます。次のステップは、下顎の反復的な変位を活性化させることです。次に、ステッピングモーターを使用して、電極を脳内に進めます。直流電位の急激な低下と持続的なシナプス活動によってニューロンへの刺入が示されたら、電極の前進を停止します。穿刺が安定したと判断したら、ランプ・アンド・ホールドおよび正弦波状の顎運動を開始します。ニューロンの反応を記録し、その反応に基づいてニューロンの特性評価を行います。次に、ニューロンの受容野をマッピングするため、鈍端プローブを用いて頭部周辺および口腔内の皮膚を探索します。筋収縮や有害刺激などの他の刺激に対するニューロンの反応を調査します。記録が完了したら、1〜4 nano ampの直流電流を注入し、総注入量を15〜70 nano amp minutesにします。電極の貫通状態をモニターし、電流注入を停止してください。膜電位が-30 millivoltsより正になった場合は、次に脳組織の切片作成を行います。動物を安楽死させ、灌流した後に脳を取り出します。その後、前頭面、矢状面、または水平面のいずれかで50から100 micronの厚さに切片を作成します。ラベル付けされた感覚ニューロンとさまざまな運動ニューロンとの関係を可視化するには、組織に応じてH-R-P-D-A-BまたはTexas redで組織処理を行い、蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡による追加解析、または定量的な共局在解析ソフトウェアを用いた解析を行います。必要に応じて、ラベル付けされたニューロン内のシナプスを正確に特定するために、シナプトフィジンを用いた免疫化学的処理を行うことができます。この図は、電気生理学的な特性評価後にIDEを注入した脳幹ニューロンを示しています。運動中のニューロン反応に基づき、このニューロンは二次筋紡錘求心性ニューロンとして同定できます。茶色の枠線は三叉神経運動核の位置を示しています。この図は、下顎の変位時における感覚ニューロンの生理学的反応を示しています。ニューロンの応答は、瞬時発火頻度として的に表されています。この応答は下顎の変位を密接に模倣しており、この特定のニューロンが下顎の位置に関連する感覚フィードバックを提供していることを示している点に注目してください。この図は、筋肉のプローブ操作中に応答した感覚ニューロンを示しています。免疫化学的処理の後、ニューロンをideで染色した。赤色の膨隆として現れているシナプスバトンが、黄色のsynaptophysinと共局在しているのが見て取れる。緑色は蛍光ミッシル染色である。この図は、筋紡錘一次求心性ニューロンの軸索のアニメーションです。ラベル化されたニューロンの複数の光学切片を用いて、このアニメーションを作成しました。この手順の後、電子顕微鏡、共焦点顕微鏡、および順行性または逆行性ニューロンラベル法などの他の手法を用いて、ニューロンの超微形態的特性、神経伝達物質とシナプス小胞の共局在、およびニューロンの接続性に関するさらなる疑問を検討することが可能です。

physiological-morphological-neurochemical-characterization-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、長時間にわたって蛍光顕微鏡を介して神経細胞を生体内でミトコンドリアのイメージングを可能にするプロトコルを記述する。長期間にわたるイメージングは​​、我々の研究室で設計し、構築されたミトコンドリア標的蛍光蛋白質と安価なステージトップインキュベーターの使用のレンチウイルスを介した発現を介して実行されます。...

ニューロモデュレーションとミトコンドリア輸送：長時間にわたって海馬ニューロンのライブイメージング

数々の最近の研究では、脳の病理学に関連したシナプス蛋白の変異を同定した。初代培養皮質ニューロンは樹状突起スパイン形態と運動性にこれらの疾患関連タンパク質の影響を調べることで最大限の柔軟性を提供します。...

培養中枢神経系ニューロンの樹状突起スパイン形態の解析

神経細胞の形態形成および移行が適切な脳の発達の基礎となる重要なイベントです。ここでは、遺伝的に培養した小脳顆粒ニューロンおよび形態や神経細胞の遊走特性の評価のための開発小脳を操作する方法を説明します。...

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

このプロトコルは、神経固有のミトコンドリアを定量化を視覚化して三次元 (3 D) 画像処理・解析技術を使用します。テクニックは別の蛍光信号からデータのサブセットを分離する 1...

三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

膜輸送の研究は、神経機能を理解するために重要である。ここでは、ニューロンの小胞の運動性を定量化する方法を紹介します。これは、神経系における膜輸送の定量化に適合させることができる便利な方法である。...

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

このプロトコルは、パーキンソン病の認知と運動制御を測定するために一般的に使用される従来の臨床タスクの一部のデジタル化を提供します。臨床タスクはデジタル化され、生物物理学のリズムは、自発的、自発的、自動、自律神経に至るまで、神経系の異なる機能レベルから共登録されます。...

パーキンソン病における運動と認知機能の動的デジタルバイオマーカー

ミトコンドリアの輸送および形態の障害は、様々な神経変性疾患に関与している。提示されたプロトコルは、遺伝性痙攣対麻痺におけるミトコンドリア輸送および形態を評価するために、誘導多能性幹細胞由来前脳ニューロンを使用する。このプロトコルは、軸索に沿ったミトコンドリア人身売買の特徴付けとその形態の分析を可能にし、神経変性疾患の研究を容易にする。...

遺伝性痙性対麻痺におけるヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおけるミトコンドリア輸送と形態学の解析

眼球運動の監視（またはアイトラッキングは）空間に目がいつ、どのくらいの期間、残るかがわかります。ここで、我々は、アイトラッキングは、口頭、またはその他の明示的なレポートを必要とせずに、複数の参加者の集団でのメモリの整合性を調査するために使用することができる方法を示します。...

メモリの眼球運動のモニタリング

脳の両方の血行動態と電気生理学的なプロセスで無重力と重力の効果は脳波とNIRSの技術によって放物線飛行の際に従うべきとしている。中期と長期の宇宙飛行中に行うことが計画されているより複雑な実験、のフィージビリティスタディ。...

脳皮質機能および変更された重力状態の間、神経認知パフォーマンスとの間のコヒーレンス

ここでは、ラットやマウスはnocifensive動作を示している最低温度を決定するための迅速な信頼性と簡単な手順を説明し、...

糖尿病ラットの熱侵害受容閾値の迅速定量

学ぶ運動中の哺乳類神経細胞の生理応答記録法。細胞内記録と免疫化学を組み合わせ、形態・神経化学的表現型とシナプス回路との関連を解析します。神経接続を保持したin vivo解析が可能です。

運動によって変調された神経細胞の生理的、形態学的および神経化学的キャラクタリゼーション

さらに動画を探す