磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

本実験は、脂質結合タンパク質を同定し、定義された脂質膜環境における脂質とタンパク質の相互作用を解析することを目的としています。細胞ホモジネートの脂質結合タンパク質を、ホスファチジルセリンとセラミドから調製した新鮮な脂質ベシクルと共にインキュベートします。その後、反応混合液にXin V結合磁気ビーズを添加し、脂質ベシクルに結合したタンパク質を磁気ビーズに固定します。次に、磁気活性化細胞分取法（MACS）を用いて、タンパク質結合脂質ベシクルを精製します。

脂質結合タンパク質の解析結果を特定するために、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングを用いて、MDCK細胞で発現させた内因性および組換え型の非定型PKCと、特異的なセラミド結合ドメインの精製を確認します。ELISAや表面プラズモン共鳴分光法などの既存の手法と比較した本新規手法の主な利点は、脂質とタンパク質の相互作用が膜に近い環境で達成され、結合タンパク質を精製および解析できる点にあります。これらの疾患では生理的な脂質・タンパク質相互作用が損なわれているため、本手法の意義は脂質が関与する疾患の治療および診断へと展開されます。

これらの疾患の一部では、標的タンパク質さえ特定されておらず、同定する必要があります。脂質ベースの治療法を設計するには、まず、等モル量のphosphatidyl serineとC 16 ceramideの乾燥混合物を100 µLのsical bufferに調製して脂質slesを作成します。0.1 mMの塩化マンガンを添加した300 µLのsical bufferを加えた後、1時間超音波処理を行います。サンプルを4 °Cで20分間、12,000 Gで遠心分離し、その後、得られた巨大脂質小胞のペレットを100 µLのsical bufferに再懸濁します。1 nMのvibrant cm DII蛍光染料を添加し、37 °Cで1時間インキュベートして、max分離後のSLE画分の可視化を容易にします。遠心分離により、vibrant cm daiで染色されたphosphatidyl serineおよびceramide slesのピンク色のペレットを回収し、100 µLのtris bufferに再懸濁します。

次に、界面活性剤を用いない細胞溶解液を調製するため、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含む10 mM tris-HClの高張緩衝液300 µL中で細胞をソニケーションし、遠心分離します。膜状のデブリを除去するため、得られた透明な細胞溶解液を脂質物理懸濁液に加え、混合物を4 °Cで2時間インキュベートします。細胞溶解液にはホスファテリンを含む内因性膜が含まれている可能性があるため、追加の遠心分離ステップによって溶解液からこれらの膜を除去することを推奨します。

反応混合物にXNV結合バッファー20 µLと、XNV接合磁気ビーズを含む溶液50 µLを添加し、4 °Cで1時間インキュベートした後、製造元のプロトコルに従って磁気活性化細胞分取（MACS）を行います。次に、抗体競合アッセイにおけるリポソームの存在と量を判定するため、マイクロプレート蛍光リーダーを用いて、通り抜け分画および溶出分画のVibrant CM DII蛍光をモニタリングします。aPKCのセラミドホスホセリン小胞に対する結合反応の特異性を検証するために、1 µgのanti-PKCζウサギポリクローナル抗体を細胞溶解物と共に4 °Cで1時間インキュベートし、続いて脂質小胞と共にインキュベートします。

in vitroでの脂質タンパク質極性複合体の再構成における最大溶出液中のセラミドリンスリン酸セリンへのタンパク質結合を解析するため、SDS-PAGEおよびイムノブロッティング分析を継続します。まず、先に示したように、Vibrant CM-DiIで染色されたリンスリン酸セリンセラミド小胞のピンク色のペレットを準備します。これらの小胞を、100 µM gamma S GTP、1 mM GDP、および目的の組換えタンパク質の混合物を添加した100 µLのTRI緩衝液に再懸濁します。次に、反応液を4 °Cで3時間インキュベートします。その後、20倍濃縮のXn-V緩衝液5 µLと、Xn-Vコンジュゲート磁性ビーズ50 µLを添加します。

混合物を4°Cでさらに30分間、緩やかに撹拌しながらインキュベートします。沈殿を促進させるため、製造元のプロトコルに従い、NX NV磁気活性化細胞ソーティングを継続して行います。溶出分画に10 µgの純粋なe albuminを添加します。

Weyl-Flue沈殿法によりタンパク質を濃縮します。下層はクロロホルム・メタノールであり、濃縮されたvibrant cm diiを含みます。茶色の界面層には、磁性ビーズと沈殿したタンパク質が含まれています。

Weyl-flu反応の有機クロロホルム・メタノール相において、鮮やかなピンク色のcm diiを検出することにより、ellu脂質小胞を定量します。サンプル間のタンパク質量を正規化するために等量の脂質小胞を用い、SDS-PAGEおよびイムノブロッティングにより解析します。

全長PKC ζ（C末端に緑色蛍光タンパク質またはセラミド結合ドメインが連結されたもの）を発現させたMDCK細胞の界面活性剤フリー溶出液。PKC ζのC末端をホスホセリンとともにインキュベートした。

Maxカラムの溶出後、セラミドベシクルのタンパク質を免疫ブロット法により分析した。セラミド結合断片C 20 Zeta、EGFP、および全長PKC ZetaがMaxカラムの溶出液から回収され、これはlyx手順の特異性と有効性と一致していた。リン酸セラミドベシクルに結合しなかった陰性対照のEGFPは、溶出液中では検出されなかった。

LinxをSDS-PAGEやウェスタンブロッティング、あるいはプロテオミクス解析などの他の手法と組み合わせることで、脂質結合タンパク質複合体にどのタンパク質が含まれているかといった、さらなる疑問を解消することが可能です。LabXの開発後、単一脂質研究分野の研究者は、神経幹細胞や上皮細胞におけるセラミド誘発アポトーシスおよび細胞極性の探索への道を切り拓いてきました。