環境試料中の有機Pのハイスループット測定と分類

この手順の目的は、土壌または堆肥サンプルの抽出液中に含まれる酵素分解可能な有機態リンを分類することです。まず、水酸化ナトリウムEDTA溶液でサンプルを抽出し、抽出液のpHを調整します。その後、調整した抽出液を2種類の異なる酵素溶液と共にインキュベートすることで、この目的を達成します。

96ウェルプレートを用いて、最終ステップとしてモリブデンブルー比色法により酵素で放出された正リン酸を測定します。最終的に、土壌または堆肥サンプル中のほとんどの天然正リン酸モノエステルリンおよびジエステルリン形態は、酵素加水分解法による正リン酸の差分放出に基づいて分類することが可能です。この手法は、あらゆる標準的な研究室で低コストに実施できます。

リン31核磁気共鳴分光法などの既存の手法と比較した最大の利点は、土壌に天然に存在する酵素が、将来的に有機エンドウ化合物から正リン酸を放出させる潜在能を測定できる点にあります。したがって、この手法で得られたデータは、土壌肥沃度の予測や、藻類が利用可能な正リン酸を有害な量だけ放出する土壌の潜在能を予測するのに役立ちます。50 mLのコニカルチューブに入れた2 gの湿潤または乾燥サンプルに、0.25 Mの水酸化ナトリウム溶液を30 mL加えます。

室温で16時間、撹拌しながらインキュベートします。サンプルを3000 ×gで30分間遠心分離し、100 µLを酢酸緩衝液が入った1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。調整後のサンプルの全量は1 mLで、pHは5.0となります。

freshly prepared 0.1 molar sodium acetate pH 5 を 10 mL 用意し、酸ホスファターゼを 0.5 units/mL の濃度で含むストック溶液を2本調製します。次に、酸ホスファターゼストック溶液の 10 mL チューブのうち1本に、再構成した Penicillium Citron 由来の凍結乾燥ヌクレアーゼ NP1 を加え、最終濃度が 2.5 units NP1/mL となるようにし、チューブを数回反転させて穏やかに混合します。これら2つの酵素溶液を 3000 ×g で 30 分間遠心分離します。検量線を作成するために、まず 1.5 mL 遠心チューブに 1 millimolar リン酸カリウムストック溶液を 1 mL 加え、0.5 mL ずつ 7 回の連続希釈を行います。最初のチューブは廃棄し、最終的な希釈範囲が 20 µM から 0.625 nM リンとなるようにします。

次に、ORTHOPHOSPHATE標準液をプレートの最後の2列に移します。行Aの0 NM orthophosphateから始めて、行Hの20 nm orthophosphateまでを10列目の最初の3ウェルに入れます。10列目の次の3ウェルに、40 µLのPPおよびGP酵素溶液を加えます。続いて、40 µLのPP、GPおよびNPの1酵素溶液を加えます。

最後に、すべての6つのウェルに100 millimolar 酢酸緩衝液を 40 microliters 加えます。これで、列10の最初の6つのウェルには、それぞれ 80 microliters の溶液が入っているはずです。次に、10 M glucose と 6 phosphate を含む酢酸ナトリウム溶液 40 microliters と、PP および GP 酵素溶液 40 microliters を加えます。

テストする各サンプルについて、すべてのサンプルの分注が完了した後、pH調整済みのサンプル抽出液 40 µLを最大8行の1〜9ウェルに分注します。マルチチャンネルピペットを使用して、1〜3列目にPP＋GP酵素溶液を、4〜6列目にPP＋GP＋NPを、7〜9列目に0.1 M l酢酸ナトリウム緩衝液を分注します。すべてのサンプルが同等のインキュベーション時間となるよう、この操作は迅速に行います。

96ウェルプレートに蓋をし、サンプル、酵素溶液、コントロール、および検量線を、脱イオン水中で37 °Cで正確に1時間インキュベートします。4種類のストック溶液をそれぞれ50 mLずつ調製します。溶液Aは、マルチチャンネルピペットを用いて毎日迅速に調製する必要があります。

96ウェルプレートのすべてのウェルに、SDS 25 µL、溶液A 100 µL、溶液B 20 µL、および溶液C 50 µLを加えます。プレートに蓋をし、室温で30分間インキュベートします。最後に、波長可変マイクロプレートリーダーを用いて850 nmでの吸光度を測定し、表計算アプリケーションで記録します。

まず、x軸に0から20 nanomoles phosphorus、y軸に2回の吸光度測定値の平均値をプロットして無機リン酸の検量線を書き、線形回帰を行い、最適適合直線の式を求めます。次に、1列目から3列目の値を平均し、そのデータセットに検量線を適用することで、バックグラウンド無機リン酸量を算出します。続いて、加水分解されたリン酸モノエステル由来のリンを決定するため、4列目から6列目の3連サンプルの値を平均し、そこからコントロール酵素溶液とバックグラウンド無機リン酸量を差し引きます。

次に、加水分解されたリンからリン含有量を算出するため、DERsは7列目から9列目の3反復サンプルの平均値を求め、そこから4列目から6列目のコントロール酵素溶液、バックグラウンド無機リン、および加水分解されたモノエステルリンの値を差し引きます。標準的な96ウェルプレートでは、8つのサンプルと検量線の結果が表示されます。コントロールは10列目にあります。

1列目から3列目、および4列目から6列目にかけての色の強度の増加は、加水分解されたモノエステルリン化合物によるものであり、4列目から6列目、および7列目から9列目の間は、加水分解されたジエステルリン化合物によるものです。ここでは、高スループット酵素加水分解法を用いて、バーモント州の土壌試料の0.25 M 水酸化ナトリウムおよび0.05 M EDTA抽出液におけるリンクラスの分布を正常に分析しました。このビデオを視聴することで、酵素加水分解を用いて土壌または堆肥抽出液中の天然正リン酸、モノエステル、およびジエステルリン化合物を測定する方法について深く理解できるはずです。

この手法は、環境化学や養分管理の分野の研究者が、土壌または堆肥系における有機態Pの挙動を探索するための道を開くのに役立つ可能性があります。