のBalb / Cの脳組織の高感度5 hydroxymethylcytosine検出

本実験の全般的な目的は、ゲノムDNAの特定の領域における5-メチルシトシンおよび5-ヒドロキシエチルシトシンを分析および定量することです。これは、5-ヒドロキシエチルシトシンのヒドロキシル基を保護することで、切断可能なMSP1部位を切断不可能な部位に変換することによって達成されます。第二段階として、制限酵素MSP1およびHPA2を用いてゲノムDNAを消化します。これらの酵素のメチル化に対する感受性の違いを利用して、グルコースに関連する5-ヒドロキシエチルシトシン部位を特定します。

次に、当該遺伝子座を解析するためにPCRを行います。その結果、特定の遺伝子座に5-ヒドロキシエチルシトシンが存在することが示されました。QPCRを用いることで、5-メチルシトシンおよび5-ヒドロキシエチルシトシンの量を定量することが可能です。

重亜硫酸塩シーケンシングなどの他の手法に対する本手法の主な利点は、5-メチルシチジンと5-ヒドロキシエチルシチジンを区別できることです。本日の実験を実演するのは、New England Biolabs社で本キットの主要開発者を務めたRomas Vice Villa氏です。本プロトコルの開始前に、書面の手順に従ってB Cマウスの脳組織からゲノムDNAを精製しておいてください。1.5 mLの反応チューブ内で、ゲノムDNA、UDP-glucose、NEB buffer 4、および全量を310 µLにするのに十分なヌクレアーゼフリー水を混合します。

この反応混合物を、155 µLずつ2本のチューブに分注します。次に、一方のチューブに30 units（または3 µL）のT4 β-glucosyltransferaseを加えます。ピペッティングで穏やかに混ぜ合わせます。

2本目のチューブはコントロール反応であるため、T4 BGTは添加せず、代わりに3 µLの水を必ず加えてください。両方のチューブを37 °Cで12〜18時間インキュベートします。この間に、BGTがサンプル中の5-ヒドロキシエチルシトシン基のヒドロキシル基にグルコースを付加します。制限酵素消化を開始するために、反応混合液を50 µLずつ、1から3まで番号を付けた3本の0.2 mL PCRストリップチューブに分注します。

次に、コントロール混合液 50 µL ずつを、4から6のラベルを貼った3本のPCRストリップチューブに分注します。msp 100 units をチューブ1と4にそれぞれ加えます。続いて、HPA 2 50 units をチューブ2と5にそれぞれ加え、ピペッティングで穏やかに混ぜ合わせます。

チューブ3と6はコントロールであるため、何も添加しないでください。6本すべてのチューブを37 °Cで少なくとも4時間インキュベートします。その後、各チューブに1 µLのproteinase Kを加え、40 °Cで30分間インキュベートします。

最後に、95 °Cで10分間インキュベートしてプロテアーゼKを不活化します。この手順では、エンドポイントPCR用にNEB LongAmp Taqを使用していますが、他のPCR試薬や手順を用いて、氷上の0.2 mL PCR反応チューブで代用することも可能です。

5× LongAmp TAC反応バッファー、dNTPs、フォワードおよびリバースプライマー、 previously obtained template DNA、LongAmp Taq DNAポリメラーゼを加え、ヌクレアーゼフリー水を加えて最終容量を50 µLにします。必要に応じて反応液を穏やかに混合し、短時間の遠心分離によってすべての液体をチューブの底に集めます。PCRチューブを氷上から、ブロックを94 °Cに予熱したサーモサイクラーに移し、標準的な3ステップPCRのサイクリングプログラムを開始します。

最初に94°Cで30秒間の初期変性を行い、続いて94°Cでの変性を15秒間、55〜65°Cでのアニーリングを30秒間、そして65°Cでの伸長を20秒間（または1 kbあたり50秒間）とするサイクルを30回繰り返します。その後、最後に65°Cで5分間の最終伸長を行います。また、5-メチルシトシンおよび5-ヒドロキシメチルシトシンの量を定量するために、リアルタイムPCRを行うことも可能です。

詳細については、nb. comにある製品マニュアルをご参照ください。エンドポイントPCRおよびリアルタイムPCRを用いて、Locus 12における5つのヒドロキシエチルアイン量の比較を行いました。脳、肝臓、心臓、脾臓を含む4種類のマウスBSY組織サンプルを分析しました。

比較のため、エンドポイントPCRサンプルの枠で囲まれたゲルレーンに5-ヒドロキシエチルシトシンの変動が示されています。リアルタイムPCRデータは未切断DNAで正規化し、標準曲線を用いてコピー数を決定しました。サンプルのコピー数を未消化コントロールのコピー数で除することで、サンプルの正規化を行いました。

ここでは、黄色のバーを比較することで5-ヒドロキシエチルシトシンの変動を確認できます。本手法を実施する際の注意点をいくつか挙げます。すべての酵素反応を完全に完結させることが極めて重要です。BGTについては、すべてのDNA部位を共分離させるために、一晩反応させてください。MspIおよびHEPA2については、反応が完結することを確実にするため、少なくとも4時間は反応させる必要があります。

最後に、対照反応を並行して実施できるよう、DNAコントロールおよびプライマーコントロールを提供します。