全血刺激のためのアッセイを用いて炎症性サイトカインIL -1βの正確かつ簡単に測定

この手順の全体的な目的は、全血刺激アッセイで産生される前炎症性サイトカインを測定することです。まず、遠心分離によって全血の細胞成分を血漿から分離し、アニリンオレンジ染色を用いて白血球数を計測します。次に、細胞を播種し、LPSで刺激した後にTPを添加して、微生物パターン認識受容体を持つ細胞によるサイトカイン産生を誘導します。その後、刺激開始後の特定のタイムポイントで培養上清を回収します。

最後に、上清中のサイトカイン濃度を96ウェルプレートを用いたマルチプレックスアッセイで測定します。この簡便な手法を用いることで、異なるドナー由来の刺激細胞によって産生される前炎症性サイトカインの濃度変動を迅速に評価することが可能です。本手法は、病理学的な抗炎症反応を示す患者において、特に採取可能な血液量が限られている状況下で、IL-1を介した炎症性疾患を特定する際に特に有用です。

サイトカイン濃度を測定する際、既存の手法に対する本手法の主な利点は、Luminexベースの技術を用いることで、少量のサンプル量で複数のサイトカインを同時に測定できることです。罹患個体および、年齢と性別を一致させた健康なコントロールから、10 milliliters以上の静脈血サンプルを採取します。サンプルはナトリウムヘパリン入りVacutainer採血管で回収し、EDTAなどの他の抗凝固剤が添加されていないことを確認してください。これらの薬剤はアッセイを妨害するためです。また、採取後できるだけ早くサンプルを処理してください。必要に応じて、サンプルは室温、暗所条件下で最大24時間まで保存可能です。

血液サンプルを、ブレーキをオフにした状態で、室温にて3000 RPMで10分間遠心分離します。遠心分離後、単核細胞を含むバフィーコート層を乱さないように注意しながら、チューブ上層の血漿を除去します。バフィーコートと下層の赤血球ペレットを室温の無血清RPMI培地で再懸濁し、混合液を穏やかにピペッティングして細胞を洗浄します。

次に、回収チューブから細胞を50 mLコニカルチューブに移します。RPMIを加えて全量を50 mLにし、各チューブを緩やかに転倒混和します。さらに、3000 RPMで10分間、細胞を再度遠心分離します。

次に、細胞ペレットを乱さないように注意しながら、上清を吸引します。不純物を除去し、細胞結合性サイトカインを排除するため、この洗浄工程を2〜4回繰り返します。細胞の洗浄が完了したら、無血清RPMIを用いて全量を20 millilitersに再懸濁します。細胞数を計測するために、試料とアニリンオレンジを1:1で混合した液を20 microliters、使い捨てのソータービジョンチャンバーにロードします。最終濃度1 microgram/milliliterでアニリンオレンジを使用すると、有核白血球のみが染色されるため、赤血球と区別することが可能になります。

細胞数の算定後、D陽性細胞のみをカウントします。サンプルを無血清RPMIで再懸濁し、最終濃度を1 mLあたり2 million cellsにします。各サンプルについて、テストする実験条件を記載し、24ウェルプレートの2つのウェルに重複して分注します。

本ケースにおける条件は、無刺激、LPS単独、a TP単独、およびLPSとa TPの併用です。各ウェルに希釈した細胞を1 mLずつ加え、適切なウェルにLPSを最終濃度1 µg/mLとなるように添加します。サンプルを5% CO2インキュベーターにて37 °Cで2時間40分間インキュベートします。この初期インキュベーション期間の後、a TP単独およびLPSとa TP併用のウェルに、a TPを最終濃度2 mMとなるように添加します。その後、プレートを37 °Cでさらに20分間インキュベートします。

2回目のインキュベーションが完了したら、各ウェルから細胞をあらかじめラベルを貼った別の1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移し、室温で10, 000 RRP Mで2分間遠心分離します。その後、各チューブから上清を新しいラベル付きのEORチューブに移します。上清はすぐにサイトカインの測定に使用するか、IL one betaまたは他のサイトカインの濃度を評価するために冷凍保存します。本サンプルでは、Bio Plex 200システムを用いて、bio plex pro、human cytokine X plexを使用します。

製造元の指示に従ってください。この図における、正常な全血細胞をLPSまたはATP、あるいは両方を併用して刺激した際のIL-1β産生の解析では、LPSとATPの両方を加えた場合に反応が見られ、その大きさは刺激される細胞数に依存します。健康なコントロールとは対照的に、自己炎症性疾患を示す患者の全血アッセイでは、ATPを外因性に添加しなくても、LPS刺激後にIL-1β産生が亢進することが明らかになっています。血液などのヒト体液を取り扱うことは非常に危険である可能性があるため、この手順を実施する際は、常に標準的な予防策を講じてください。