Name: ナチュラルキラー細胞傷害性アッセイにおけるHIV - 1感染プライマリCD4 + T細胞を標的細胞としての準備と使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-14T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: 学ぶHIV-1感染CD4+T細胞を標的としたナチュラルキラー細胞傷害性アッセイの手法。CD4ダウンモジュレーションを利用した高純度感染細胞の分離と、フローサイトメトリーおよびクロミウム51放出アッセイによるNK細胞応答評価の詳細なプロトコルを解説する。

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<ol><li>Ruscetti, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+effector+mechanisms+against+HTLV-I-+and+HTLV-III%2FLAV-infected+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells.</a> J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).</li>
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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

正しく完了したら、このプロトコルで説明されているアッセイは、反対脱顆粒およびHIV - 1感染細胞を（図5を参照）溶解するNK細胞の能力の代表的な画像を提供する必要があります。 HIV感染細胞とNK細胞の溶解、HIV感染細胞への応答におけるNK細胞の脱顆粒は10に直接比例しているべきです。 HIV感染細胞に細胞毒性応答を測定するには、2つのNK細胞の機能アッセイのための信頼性の高い結果が非常にNK細胞だけでなく、感染細胞の高度に精製された人口の精製分離に依存しています。 NK細胞とHIV - 1感染細胞を精製したことは、細胞率を目標とし、かなり正確なエフェクターを達成するための非常に重要です。同様に、標的細胞集団から死とアポトーシス細胞の除去は、エフェクター細胞との51 Cr標識またはインキュベーションの前に重要です。 の51 Crの同位体標識のステップ中に死亡またはアポトーシス細胞の存在とアポトーシスを起こした細胞によって内在化されることがあります高い自発リリースになりますし、計算された％特異的溶解が歪みます。また、死またはアポトーシス細胞の存在は、CD107aの発現の異常に高​​いレベルで、その結果、NK細胞の脱顆粒を引き起こすことがあります。各レプリケートから削除上清の量の違いがよく高い標準偏差につながるとして、51 Cr放出アッセイにおけるNK細胞と標的細胞のインキュベーション後の細胞フリー上清を除去する際に正確なピペッティングが必要です。変更は、特定の受容体またはリガンド6,11への敵対的抗体との共培養の前にエフェクターや目標をインキュベートすることにより、HIV感染細胞のNK細胞の溶解をトリガーに特定のNK受容体の役割を評価するために、これらのプロトコルに行うことができます。サイトカイン処理したNK細胞（例えば、IL - 2、IL - 15）刺激NK細胞が12の機能を評価するために使用することができます。同様に、抗体依存細胞毒性アッセイは、これらのプロトコルを用いて行うことができる。抗HIV抗体は（例えば、抗gp120の）NK細胞の低親和性のFc受容体CD16 13により認識のための標的細胞に添加することができます。これらのアッセイは、HIV感染細胞に対するNK細胞の細胞傷害性応答を測定するための設定が、また、HIV感染細胞の認識を以下のサイトカインを産生するNK細胞の能力を測定するように変更することができます。我々はこのプロトコルでは、標的細胞として、in vitroで感染した細胞の使用を説明したが、我々は最近、HIVに感染した患者から標的細胞の生成を説明してきました。これは、インターロイキン-2 11の存在下でマイトジェンで刺激後2週間にわたって細胞の拡大が続くCD4 + T細胞の分離を必要とします。拡張の2週間後、この資料に記載されているプロトコルは、標的細胞を単離するために使用されています。

<table><tbody><tr><td>Vacutainerチューブ（ヘパリンナトリウム）</td><td>BD Biosciences</td><td>367874</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep CD4+ T細胞分離キット</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>CMF PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>リンパ球分離培地</td><td>Cellgro</td><td>25-072-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Cellgro</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>T細胞増殖キット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-441</td><td></td></tr><tr><td>CMF HBSS (1x)</td><td>Hyclone</td><td>SH30588.01</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA</td><td></td><td>46-034-Cl</td><td></td></tr><tr><td>NK細胞ネガティブ分離キット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-657</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12440-046</td><td></td></tr><tr><td>CD4+ ポジティブ分離キット</td><td>Invitrogen</td><td>113.31D</td><td></td></tr><tr><td>死細胞除去キット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PacificBlue</td><td>BD Biosciences</td><td>558117</td><td></td></tr><tr><td>CD14 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>325616</td><td></td></tr><tr><td>CD20 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>302328</td><td></td></tr><tr><td>CD56 APC</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td></td></tr><tr><td>CD69 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555531</td><td></td></tr><tr><td>CD107a FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;51&lt;/sup&gt;クロム</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEZ030002MC</td><td></td></tr><tr><td>ガンマカウンターチューブ</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1270-401</td><td></td></tr><tr><td>2470 自動ガンマカウンター</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>2470-0050</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td>643629</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FJ-9-1YR</td><td></td></tr></tbody></table>

ナチュラルキラー細胞傷害性アッセイにおけるhiv - 1感染プライマリcd4 + t細胞を標的細胞としての準備と使用

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

ナチュラルキラー（NK）細胞はウイルス感染細胞に対する自然免疫応答の重要なコンポーネントです。 HIV感染細胞に対するNK細胞の機能で任意のaberrancyを識別することが潜在的にそれらの細胞溶解活性を増強する治療法につながる可能性があるため、HIV - 1感染細胞を認識し、溶解するNK細胞の能力を理解することが重要です。ではなく、標的細胞としてのHIV感染の主なT細胞の芽球細胞毒性アッセイで感染- T -細胞のラインを使用する必要があります。 T -細胞株は、さらに感染することなく、NK細胞溶解に非常に敏感です。さらに、溶解をもたらす標的とエフェクター細胞の間に主要組織適合遺伝子複合体クラスIのミスマッチを防ぐために、自家一次電池を使用する必要があります。主なHIV感染細胞に対するNK細胞の細胞溶解反応を評価した初期の研究では、感染細胞の1,2の重要な殺害を示すことはできなかった。しかし、NK細胞の機能的アッセイで標的細胞として、一次T細胞のHIV - 1感染を使用すると、非感染細胞3を汚染する原因が存在することは困難であった。非感染細胞の比率にこの矛盾した感染細胞は、ドナーNK細胞機能の変動が原因ではないかもしれないサンプル間のNK細胞死滅の変化になります。従って、それは実験3,4の間に細胞の比率を標的とするエフェクターを標準化するために精製された感染した細胞集団で作業することが有益であろう。ここでは、死んでいるまたは死にかけている細胞の3-6を削除するには、感染した細胞や市販キットの利用可能性にダウンモジュレートCD4するHIV - 1の能力を活用することによって、HIV - 1感染細胞の高度に精製された人口の分離を示しています。精製された感染した一次T細胞の芽球は、5月7日エフェクター人口としてNK細胞を精製した脱顆粒や細胞毒性アッセイのいずれかでターゲットとして使用できます。脱顆粒アッセイにおけるエフェクターとしてNK細胞の使用は、8は &quot;細胞傷害性顆粒&quot;と呼ばれる特殊なリソソームの溶菌内容を解放するNK細胞の能力を評価します。 CD107a、細胞溶解性顆粒が形質膜に融合するNK細胞表面に発現してなるリソソーム膜タンパク質に対する蛍光標識抗体で染色することによって、我々は、細胞認識をターゲットに反応して脱顆粒、NK細胞の何パーセントを決定することができます。また、NK細胞溶解活性は、NK細胞の存在下で標的細胞内からの51 Crの放出により溶解標的細胞の割合の決定を可能にする細胞傷害性アッセイで評価することができます。

HIV感染細胞にナチュラルキラー細胞溶解反応を測定するために細胞毒性のアッセイは、標的細胞の純度によって制限されます。ここでは、CD4をダウンモジュレートするHIV - 1の能力を活用することにより、HIV - 1感染の主なT細胞芽球の高度に精製された人口の分離を示しています。

ナチュラルキラー細胞傷害性アッセイにおけるHIV - 1感染プライマリCD4 + T細胞を標的細胞としての準備と使用

ナチュラルキラー（NK）細胞は、ウイルス感染細胞に対する自然免疫応答の極めて重要な構成要素である。NK細胞の能力を理解することは重要であり…

この手順の全体的な目的は、HIV-1感染細胞に対するNK細胞の細胞傷害性応答を評価することです。まず、静脈血からCD4陽性T細胞を単離して感染させ、次に同一ドナーからナチュラルキラー細胞を単離することで、これを達成します。次に、非感染のCD4陽性T細胞を感染細胞から分離します。最後に、感染細胞とNK細胞をそれぞれターゲット細胞およびエフェクター細胞として、2種類のアッセイのいずれかでNK細胞の細胞傷害性を評価します。最終的に、フローサイトメトリー分析で判定されるCD107aの発現上昇、またはガンマカウンターで検出される51Cr放出を通じて、NK細胞がHIV-1感染細胞に反応できることを示す結果を得ることができます。この手法により、NK細胞はHIV-1感染細胞に反応するか、NK細胞とT細胞の相互作用においてどの受容体・リガンド相互作用が重要か、そしてHIV-1ウイルス蛋白がHIV-1感染細胞に対するNK細胞の反応を修飾するかといった、HIV-1領域における重要な疑問に答えることができます。ヒト末梢血から分離したCD4陽性T細胞を、抗CD3および抗CD28が結合したビーズを用いて72時間刺激します。得られたT細胞集団をヘモサイトメーターで計数し、培養液を2つのグループに分けます。非感染コントロール群として、約2×10⁶個のT細胞を15mLコニカルチューブに分注し、残りのCD4陽性T細胞懸濁液を感染群として50mLコニカルチューブに入れます。両方のグループを300 G、22 °Cで10分間遠心分離し、その後、上清を吸引して除去します。50 mLチューブからCD4陽性T細胞を、ヴィロンを含む培養液に直接懸濁させ、ポリブレインを最終濃度10 mg/mLになるように添加します。その後、細胞を1200 ×g、20～25 °Cで2時間スピン感染させます。ここで、細胞にDHIV threeを感染多重度5で感染させています。スピン感染の完了後、上清を除去し、感染させた細胞を100 units/mLのIL twoを添加したRPMI完全培地を用いて、3×10⁶/mLの密度で再懸濁します。次に、非感染細胞および新規感染細胞を6ウェルプレートで72時間培養します（複製不能ウイルスの感染に使用した場合は72時間、複製可能ウイルスの感染に使用した場合は5〜7日間）。感染したCD4陽性T細胞培養液を含む上清を回収し、22°Cで300 G、10分間、ブレーキをかけて遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを2% FBSおよび2mM EDTAを含む2mLのPBSに再懸濁し、CD4陽性分離キットを用いてヘモサイトメーターで細胞数を計測します。CD4陽性の未感染T細胞を回収します。CD4陽性T細胞の単離については、メーカーの指示に従いますが、A1 anti-CD4 B/cell比を使用する点だけ変更してください。その後、死細胞除去キットを用いて、精製したウイルス保有細胞集団から死細胞を除去します。製造元の指示に従い、生存T細胞集団を回収し、精製した細胞を300 Gで10分間遠心分離します。ブレーキをかけた状態で上清を除去し、ペレットを1 mLのRPMI完全培地に懸濁して細胞数をカウントします。末梢血NK細胞は、CD4陽性T細胞と同じドナーから最初に単離します。一晩の培養後、ヘモサイトメーターでNK細胞をカウントし、ブレーキをかけた状態で300 Gで10分間遠心分離します。その後、細胞をRPMI完全培地で再懸濁し、最終濃度を10⁶ cells/mLに調整します。次に、精製された感染T細胞懸濁液および対照の非感染T細胞懸濁液を回収し、300 Gで10分間遠心分離します。ブレーキをかけた状態で上清を除去し、ペレットを再懸濁します。RPMI完全培地を用いて、1 mLあたり2×10⁶個の濃度で調製します。ポジティブコントロールとして、NK細胞による溶解感受性を持つK 562細胞を約2×10⁶個使用します。K 562細胞を300 Gで10分間、ブレーキをオフにして遠心分離し、上清を除去して、ペレットを1 mLあたり2×10⁶個の濃度のRPMI完全培地で再懸濁します。すべての細胞集団の洗浄および実験濃度への再懸濁が完了した後、NK細胞をK 5 62細胞、非感染T細胞、またはHIV感染T細胞のいずれかと共に配置します。96ウェルV底プレートの個々のウェルにおいて、非特異的なNK細胞の脱顆粒を測定するために、標的細胞型あたり1つの反復のみを使用します。1つのウェルに100 µLのNKエフェクター細胞と100 µLの培地のみを加えてください。各ウェルに10 µLの蛍光色素標識抗CD107A抗体を加え、ブレーキをオンにした状態で22 °C、20 ×gで2分間、プレートを遠心分離します。次に、37 °C、5% CO2条件下で4時間、プレートをインキュベートします。インキュベート後、ブレーキをオンにした状態で22 °C、400 ×gで5分間プレートを遠心分離し、P200チップを装着した2 mL吸引ピペットを用いて上清を除去します。次に、各ウェルに100 µLのフローバッファーを加え、anti CD 3 14 20 Pacific blue抗体およびanti CD 56 APC抗体を用いて、氷上で20分間細胞を染色します。染色の後、各ウェルに200 µLのフローバッファーを加え、プレートを400 ×gで5分間遠心分離します。ブレーキをかけた状態で22 °Cに設定し、各ウェルからフローバッファーを慎重に吸引します。200 µLのマイクロピペットチップを装着した2 mLのアスピレーティングピペットを用い、ペレットを乱さないように注意しながら、細胞を再度洗浄し、その後、カルシウムおよびマグネシウムフリーPBSで調製した1%パラホルムアルデヒド200 µLでペレットを再懸濁します。最後に、細胞懸濁液をフローチューブに移し、各チューブに1%パラホルムアルデヒド（カルシウムおよびマグネシウムフリーPBS調製）を約100 µL加えて、全量を300 µLにします。次に、FACSDivaソフトウェアを用いたフローサイトメトリーにより、NK細胞のイベント数を2×10⁴個まで測定し、FlowJoソフトウェアを用いてデータを解析します。ポジティブコントロールとして、精製したHIV V1感染および非感染T細胞標的細胞を、15 mLコニカルチューブ内で37 °C、5% CO2条件下で、10⁶個あたり125 µCiの生理食塩水希釈クロム51で2時間ラベルします。同様に、10⁶個のK562細胞を100 µCiのクロム51で2時間ラベルします。同一の培養条件下で行います。RPMI完全培地を用いて、各細胞集団の染色液の最終容量を500 µLに調整します。標的細胞に添加するchromium 51の量については、標的細胞のラベル化中にPerkinElmer社のウェブサイトにある汎用放射能崩壊計算機を使用して算出します。あらかじめ単離しておいたNK細胞を培養液から回収し、細胞数を計測します。NK cellsを300 Gで10分間、ブレーキをかけた状態で遠心分離し、沈殿した細胞ペレットをRPMI完全培地で再懸濁します。得られた細胞懸濁液を3本の15 mLコニカルチューブに分注します。細胞密度を、1本目のチューブでは10⁵/mL、2本目のチューブでは2.5×10⁵/mL、3本目のチューブでは5×10⁵/mLに調整します。これらのNK細胞は、chromium 51放出試験において、それぞれ1:1、2.5:1、5:1の比率でエフェクター細胞として使用されます。ラベル付けした標的細胞をインキュベーターから取り出し、各チューブに4.5 millilitersのRPMI完全培地を加えます。チューブを300 Gで10分間遠心分離します。その後、ペレットを乱さないように注意して、上清を放射性液体廃棄物用容器に注ぎます。吸収されなかった$^{51}\text{Cr}$をすべて除去するため、標的細胞をさらに2回洗浄します。3回目の洗浄の上清は、非放射性液体廃棄物用容器に廃棄してかまいません。次に、標的細胞をRPMI完全培地に再懸濁し、$^{51}\text{Cr}$遊離試験の標準的なセットアップ例として示す、最終細胞密度$10^5/\text{mL}$に調整します。各群を3反復で実施することに留意してください。標識したターゲット細胞を、1ウェルあたり10⁴個となるように、96ウェルV底プレートの指定された各ウェルに100 µLずつ分注します。次に、適切に指定されたエフェクター細胞対ターゲット細胞の比率に従い、NK細胞懸濁液100 µLをターゲット細胞に加えます。その後、最大放出群および自発的放出群については、エフェクター細胞を含まない対応するウェルにターゲット細胞100 µLを加えます。自発的放出群にRPMI completeをさらに100 µL添加し、プレートを20 Gで2分間、ブレーキをオンにした状態で遠心分離した後、37 °C、5% CO2の条件下で4時間インキュベートします。4時間のインキュベーション後、最大放出ウェル以外の各ウェルに、RPMI completeで1/10に希釈したヒト赤血球を5 µL添加します。次に、最大放出ウェルに10% sodium dodecyl sulfateを100 µL添加し、プレートを400 Gで5分間遠心分離します。細胞をペレット化するため、実験群および対照群の各ウェルに対応するガンマカウンターチューブにラベルを貼ります。96ウェルプレートの各ウェルから、セルフリー上清を100 microliters回収し、各ウェルの上清をあらかじめ用意したチューブに移します。PerkinElmer 24 70自動ガンマカウンターを用いて、各チューブ内のchromium 51量を測定します。以下の散布図は、CD 1 0 7の結果を解析するための典型的なフローサイトメトリーのゲーティング戦略を示しています。脱顆粒アッセイです。まず、FSCA対FSCHのプロットを用いて、凝集細胞やダブルレットを除外してシングルセルをゲーティングします。次に、FSCA対SSCでプロットされたシングルセルゲートから、ピンク色の楕円で示されたリンパ球集団をゲーティングします。次に、リンパ球ゲートを用いて、垂直なピンク色の楕円で示されるCD 56陽性かつCD 3 14 20陰性の集団をゲーティングし、CD 3 14 20対CD 56でプロットします。ここで、脱顆粒したNK細胞を可視化するため、NK GAをCD 1 0 7 A対CD 56でプロットします。続く2つの図には、HIV 1感染細胞に対するナチュラルキラー細胞の細胞毒性応答を評価した代表的な結果を示します。ターゲット細胞がない場合、およびK 5 62細胞、初代CD 4陽性T細胞、HIV感染初代T細胞に応答した場合のNK細胞の脱顆粒能を、表面CD 1 0 7 Aを発現するNK細胞の割合によって評価しました。各クアドラント内の数値は、この図における全NK細胞に占める割合を表しています。NK細胞のK 5 62細胞、非感染CD4陽性T細胞、およびHIV-1感染T細胞に対する溶解能を、エフェクター細胞と標的細胞の比率を2.5:1、5:1、および7.5:1として、Acromium 51放出アッセイにより評価しました。この技術の開発により、HIV-1生物学分野の研究者が、HIV感染患者においてナチュラルキラー細胞がHIV-1感染細胞にどのように反応するかを探索する道が開かれました。

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ヒト NK 細胞活性の評価の流れのフローサイトメトリーを用いた細胞毒性の試金

CAEBV 患者から NK と T 細胞クローンを取得するための簡単な方法は、IL-2...

NK と慢性的なアクティブなエプスタイン ‐ バーウイルス感染症から T 細胞株を確立する効率的かつ簡単な方法

ここでは、モデル腫瘍抗原に対する細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) 応答における immunodominance...

腫瘍特異的 CD8+ T 細胞応答における Immunodominance を研究するためのインビボ細胞毒性アッセイ

ここでは、特にHIV-1感染に重点を置いて、小胞体(ER)ストレスとアンフォールデッドタンパク質応答(UPR)の活性化を決定するためのいくつかの確立された方法について説明します。この記事では、ER ストレス/UPR が HIV-1...

HIV-1感染T細胞における小胞体ストレスとアンフォールドタンパク質応答の測定とHIV-1複製におけるその役割の解析

学ぶHIV-1感染CD4+T細胞を標的としたナチュラルキラー細胞傷害性アッセイの手法。CD4ダウンモジュレーションを利用した高純度感染細胞の分離と、フローサイトメトリーおよびクロミウム51放出アッセイによるNK細胞応答評価の詳細なプロトコルを解説する。

ナチュラルキラー細胞傷害性アッセイにおけるHIV - 1感染プライマリCD4 + T細胞を標的細胞としての準備と使用

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