Name: 蛍光分光法により測定膜タンパク質フォールディングの熱力学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学ぶトリプトファン蛍光法による膜タンパク質フォールディングの熱力学測定法。LAR小胞を用いてGibbs自由エネルギーを算出し、膜タンパク質の安定性と動態を解析する実験手法を解説します。

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私たちは、彼女のデータの使用のために北京呉に感謝。この作品は、JEKにNSFのキャリア賞によってサポートされていました

1。膜タンパク質のフォールディングのための〜50 nmの直径小さな単層小胞（SUV車）の調製<ol><li> 1,2 -ジミリストイル- sn -グリセロ-3 -ホスホコリン（DMPC）、クロロホルム中脂質の溶液を保存用バイアルの量あたり20 mgで購入し、清浄なガラスバイアルに小分けされています。窒素ガスの層は、脂質の酸化を防ぐために、各バイアルに添加され、そしてバイアルをキャップし、パラフィルムで密封されている。バイアルは使用するまで-20℃の冷凍庫に保存されます。 </li><li>クロロホルムの20 mgの脂質のアリコートを含む単一のバイアルは、各実験に使用されます。バイアルの内容は、無溶剤のままになるまで1時間窒素ガスの流れを用いて乾燥している。 </li><li>乾燥脂質は、〜30秒間、水浴の超音波処理を用いて20 mMリン酸カリウム緩衝液（pH = 7.3）1mLに再懸濁する。中断された脂質のこの溶液は濁り表示され、円錐形の底部にプラスチックを15 mLの試験管に移している。リン酸緩衝液の別の1mLのアリコートはもともと脂質が含まれている空のガラス製バイアルに添加され、そして超音波処理が繰り返されます。溶液は、次いで同じ15 mLの試験管に追加されます。チューブの最終容量は、この株式の小胞の溶液中で5 mg / mLの脂質の濃度で、その結果、4 mLのようになるまでこのプロセスを4回の合計が繰り返されます。 </li><li>脂質ベシクル溶液4 mLのボリュームが置かれている暖かい（〜30℃）の水浴、および50％のデューティサイクルで1時間ultrasonicatorのマイクロチップを使用して超音波処理。水浴の目的は2つあります。最初に、それがために超音波処理プロセスのあまりに高温になることから、脂質溶液を防ぎます。 DMPCのために、この転移温度は〜23℃であり、第二に、温かいお風呂は、水性脂質溶液の温度は超音波処理中に、二重層の相転移温度以上に保つことができます</li><li>超音波処理ソリューションは、超音波処理器の先端からゴミを削除するには、0.22μmのシリンジフィルターを通過し、このろ液は37℃で一晩平衡化される℃です。 </li></ol> 2。初期蛍光アンフォールディングカーブのための試料調製<ol><li> 20mMリン酸緩衝液（pH7.3）で10 Mの尿素の原液が行われます。それは尿素の大量の溶液中でかなりのボリュームを占有しているので、水が固体（およびその逆）に追加されることが不可欠です。この尿素溶液はきれい、空の瓶に溶質を追加し、目的の最終容量まで水を加えることによって行うことができます。このソリューションは、水浴や溶質を溶解するために、攪拌しながらホットプレート上で温めて必要となる場合があります。尿素は吸湿性であるため、尿素の原液の実際の濃度は、屈折率を用いて決定してください1。 </li><li> 20mMリン酸液（pH7.3）の株式の緩衝液が行われます。 </li><li>折り畳まタンパク質のストック溶液を調製した。この株式のタンパク質溶液は、8 M尿素、20 mMリン酸緩衝液で〜200μMの蛋白質の濃度を持つ必要があります。 </li><li>蛍光研究のためのサンプルは、次の方法で製造されています。株式の蛋白質の適切な量（2.3節）、株式の脂質溶液（5 mg / mLの脂質、第1項）、株式10 Mの尿素溶液（セクション2.1）、および株式のリン酸緩衝液（セクション2.2）〜4を含む試料を作るために結合されてμMタンパク質、1 mg / mLの脂質、および1 Mの単位で0〜8 M尿素。各サンプルの合計量は200μLです。例のスプレッドシート（​​表1）はリストのボリュームが200μMストックタンパク質溶液を使用して必要なことが含まれています。 </li><li>ブランクサンプルは2.4節で説明するように作られている、しかし、タンパク質が追加されません。他の成分の濃度は、2.4節の場合と同じになるように、タンパク質の代わりに、8 M尿素溶液4μLを加えてもよい。これらのブランクが散乱し、タンパク質の蛍光スペクトルに現れる他のバックグラウンド信号を減算するために使用されます。 </li><li>セクション2.4および2.5からのサンプルは完全な折り畳みと平衡を確保するための蛍光スペクトルの測定の前に少なくとも2時間、37℃でインキュベートされている。 </li></ol> 3。蛍光スペクトルの測定各サンプルとブランクのトリプトファンの蛍光は、定常状態蛍光光度計を用いて測定されます。蛍光スペクトルは、チロシン残基の励起を避けるために、290nmの励起波長で記録、および305〜500nmのスキャンする必要があります。典型的な入口と出口のバンドは3 nmである。波長の増加と積分時間は、信号対雑音比を最適化することができます。波長の増加と積分時間の典型的な値は1nm /ステップと、それぞれ0.5秒/ステップ、です。膜は、温度が二重層の相転移温度以上である場合にのみ合成脂質に一般的に倍のタンパク質。したがって、DMPCのこのケースでは、試料の温度は30℃一定に保たれています℃に160μLの容量を持つ微量石英キュベットは、これらの元で利用されているperiments。 4。アンフォールディング膜タンパク質のギブス自由エネルギーの初期アンフォールディング曲線と推定の世代<ol><li> XYデータセットの形で蛍光スペクトルは、イゴールプロ、Matlabの、起源、またはExcelなどのソフトウェアにロードされます。 </li><li>尿素と脂質小胞のバックグラウンドからの信号は、次の手順を使用して減算する必要があります。 脂質小胞と尿素の特定の濃度の存在下でタンパク質の=生の蛍光スペクトルスペクトル。 ない蛋白質は、ブランク試料に存在しない、脂質小胞とスペクトルと同じ尿素の濃度を含む、対応するブランク試料のスペクトルは、B =生の蛍光スペクトル。 補正スペクトル=スペクトラムA - C *スペクトルB. Cは1.0に典型的に等しいスカラです。いくつかのケースでは、Cが原因で発生する散乱問題のより小さいか1.0より大きいオーバーまたは〜305〜320 nm領域の近減算下。 </li><li>最大蛍光の波長、λmaxは 、それぞれの尿素濃度の補正されたスペクトルから表にあらわしています。折り畳まれたタンパク質のそれは〜330 nmの間に完全に展開した膜タンパク質の典型的な値は350 nmである。表形式の波長は折り畳ま人口の割合にはλmaxの値を相関させるため0.0から1.0の範囲にはλmaxの値（〜350 nmまで〜330）の範囲を変換することで展開した分数に変換されます。例えば、330 nmのλmaxの値が0.0に対応し、350nmのは、1.0に対応し、340nmのは、展開した分数の面で0.5に対応しています。折り畳まタンパク質のこの画分を尿素の濃​​度に対してプロットされている。前述したように、尿素の濃度は、屈折率を測定することによって実験的に決定されるべきである。 </li><li>我々は、タンパク質が2つの状態のいずれかに存在することができることを前提としています。折り曲げたり広げた。分数のプロットは、fを伸ばしたのに対し、尿素の濃度、Cは 、式に適合することができます：2 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq2.jpg" alt="式2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="式（2）"> 係数mは、変性剤濃度に対する自由エネルギーの変化率に相当し、そしてC mは折られた人口が展開人口が等しくなる中間点の尿素の濃度に相当する。これらの値は、Rは （0.001987 kcal / molの•K）気体の法則は一定である。データ解析ソフトウェアによって最小二乗フィッティングから得られたフィッティングの変数であり、Tは （303 K）の温度である。 </li><li>近似​​から得られる係数は、尿素の存在下で展開のギブスの自由エネルギー量（kcal / mol）を決定するために利用されています： <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq3.jpg" alt="式3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="式（3）"> 。 </li></ol> 5。アンフォールディングのギブス自由エネルギーのより正確な測定のためのアンフォールディング曲線を最適化。 <ol><li>上記の展開曲線はλmaxで最大の変化を引き起こす尿素濃度の範囲を明らかにする。この範囲は一般的に小さくなり、展開の大半は、この小さな範囲内で発生します。展開の自由エネルギーを正確に決定するために、追加のサンプルが最適化された最小二乗フィッティングのために必要な多くのデータポイントが含まれているプロットを取得するために、この領域で分析されます。より正確に展開曲線のこの重要な領域の形状を明らかにするために0.2 Mの単位で4 Mの尿素 - タンパク質が2と4 M尿素との間で繰り広げられるたとえば、サンプルは2を含むことを行うことができます。それは、それぞれの尿素濃度でブランクのスペクトルを測定する必要はなく、すべての〜0.5 Mのステップ空白のスペクトルを測定するのに十分です。 </li><li>このプロットから得られた展開の自由エネルギーは、オリジナルの展開曲線で得られたものとは多少異なるが、より正確な値を反映している可能性があります。 </li></ol> 6。代表的な結果： <table border="1"><tbody><tr><td>サンプル</td><td>最後の[尿素]、M </td><td>株式のタンパク質（μL） </td><td>株式の脂質（μL） </td><td>株式10 M尿素（μL） </td><td>株式バッファー（μL） </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 〜0.16 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 156 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 20 </td><td> 136 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 40 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 60 </td><td> 96 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 80 </td><td> 76 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 100 </td><td> 56 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 6 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 120 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 7 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 140 </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> 表1。蛍光サンプルを作るのに必要な原液の量<img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1単一のトリプトファン残基を含んでいる〜5μMの代表的な膜蛋白質のトリプトファン蛍光スペクトル。蛋白質の（A）生の蛍光スペクトル（スペクトル4.2から）、空白の（B）生の蛍光スペクトルは、（4.2からスペクトルB）、（C）4.2からスペクトルを修正しました。 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2は、。多数の尿素の濃度については、図1から膜タンパク質のトリプトファン蛍光スペクトルを修正しました。 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。4.4に式に合わせて、図2のデータから得られた曲線を広げる。ギブスの自由エネルギーは、セクション4.5に従って計算されます。

<ol><li>Shirley, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShirley%2C+BA+%22Protein+Folding+and+Stability%22">Protein Folding and Stability</a>. Shirley, B. A. , Humana Press. 177-190 (1995).</li>
<li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+Analysis+of+Urea+and+Guanidine+Hydrochloride+Denaturation+Curves%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves.</a> Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).</li>
<li>Lau, F. W., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Assessing+the+Stability+of+a+Membrane+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein.</a> Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).</li>
<li>Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Barrel+Proteins+that+Reside+in+the+Escherichia+coli+Outer+Membrane+in+Vivo+Demonstrate+Varied+Folding+Behavior+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">β-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro.</a> J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).</li>
<li>Booth, P. J., Curnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+scene+investigation%3A+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding scene investigation: membrane proteins.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).</li>
<li>Hong, H., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+coupling+of+integral+membrane+protein+stability+to+lipid+bilayer+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).</li>
<li>Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Tryptophan+Microenvironment%2C+Soluble+Domain%2C+and+Vesicle+Size+on+the+Thermodynamics+of+Membrane+Protein+Folding%3A+Lessons+from+the+Transmembrane+Protein+OmpA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA.</a> Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

現在のプロトコルは、トリプトファン残基を含む膜関連タンパク質およびペプチドの曲線を展開の生成を説明します。ここでは、トリプトファンの蛍光がタンパク質が折り畳まと合成脂質小胞に挿入、または溶液中で折り畳まれているかどうかを反映することを前提としています。追加のような変性剤濃度との自由エネルギーの二状態フォールディングと線形依存性などの仮定、、現在のレポートで作られて、別の方程式にこれらの仮定の結果の変更を行う実験的なプロトコルは簡単に別の分光観測量を利用するように変更することができる、など。円二色性、吸収、または外因性色素からの蛍光は、3と同様にゲル電気泳動など4さらに、アニオン性脂質などのグアニジン、酸性溶液、または温度だけでなく、別の脂質/小胞などの異なる変性剤、、、大単層小胞、またはミセルは、最終的に5,6、プロトコルは、任意の膜タンパク質、膜関連ペプチド、及び可逆折りたたみの基準を満たしている水溶性タンパク質/ペプチドに適用することができます。活用、およびそれが示すことができる分光または他の異なる構造状態のための観測可能なマーカー。可溶性タンパ...

<table><tbody><tr><td>DMPC</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>MP Biomedicals</td><td>04821527</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二カリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>リン酸一カリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285</td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光分光法により測定膜タンパク質フォールディングの熱力学

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

膜タンパク質の折り畳みは、基本的な健康関連の両方の意味を持つ新たなトピックです。細胞の基礎となってタンパク質のこのユビキタス家族の折りたたみの包括的な研究の必要性の膜タンパク質の豊富さ。さらに、ミスフォールドタンパク質に関連する疾患を特徴付けるために我々の能力の進歩は、タンパク質の折り畳みの分野で重要な実験と理論の努力を動機としている。この重要な分野で急速な進歩は、残念なことに、膜タンパク質や折りたたみ機構の複雑さに関連する固有の課題によって妨げられている。ここでは、Eからの代表的な内在性膜タンパク質を、変性剤、ΔG · H 2 Oの存在下で展開のギブス自由エネルギーの熱力学特性を測定するための実験手順の概要を説明大腸菌 。このプロトコルは、変性剤濃度の関数としての折り返しと展開した状態の平衡個体数を決定するために蛍光分光法の応用に焦点を当てています。合成脂質小胞だけでなく、データ解析の手順の重要なステップの準備のための実験的な考慮事項が強調表示されています。この手法は汎用性があり、温度やpH、同様の脂質とミセルの様々な折りたたみ環境などの変性剤の様々なタイプ、と追求されることがあります。現在のプロトコルは、以下に説明する一連の基準を満たす任意の膜または可溶性タンパク質に一般化することができるものです。

トリプトファン蛍光法による膜タンパク質の折り畳みのギブス自由エネルギーを得るためにこのビデオの記事の詳細は、実験手順。

膜タンパク質の折りたたみは、基礎的な意義と健康に関連する意義の両方を併せ持つ、新たな研究テーマとなっています。細胞内における膜タンパク質の豊富さは...

本実験の目的は、膜タンパク質のフォールディングに伴う熱力学的な特性を測定することです。まず、膜タンパク質のフォールディング環境として機能する小さなLAR小胞を構築し、その後、この小胞を用いて、タンパク質と系統的に濃度を変化させた尿素を含むサンプルを調製します。次に、各サンプルのトリプトファン蛍光スペクトルを測定します。膜タンパク質の展開曲線を生成するために必要なデータを収集するため、トリプトファン蛍光スペクトルから作成された展開曲線に基づいて、膜タンパク質の展開におけるギブス自由エネルギーをどのように算出できるかを示す結果が得られます。こんにちは、私はカリフォルニア大学サンディエゴ校の助教授、Judy Kimです。これからご覧いただく手法では、膜タンパク質の重要な特性について明らかにします。具体的には、脂質二重層に折りたたまれ、挿入されたタンパク質の安定性を測定する方法を説明します。私はカリフォルニア大学サンディエゴ校（UCSD）化学科の大学院生、ダイアナ・オッティンガーです。本日は、代表的な膜タンパク質を用いてこの方法を実演します。しかし、この手法は汎用性があり、膜結合ペプチドや可溶性タンパク質などの他の生物学的システムにも適用可能です。それでは、始めていきましょう。このプロトコルを開始する前に、1,2-ジミリスチイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DMPC）脂質のクロロホルム溶液を購入し、清潔なガラスバイアルに移します。1バイアルあたり20 mgの分量で分注し、脂質の酸化を防ぐために各バイアルに窒素ガスを充填して密封します。1回の実験につき、クロロホルムに溶解した20 mgの脂質を含むバイアルを1本使用します。ストックベシクル溶液を調製するには、まずテフロンセプタムとニードルを用い、窒素ガス気流下でバイアルの内容物を1時間乾燥させ、溶媒が完全になくなるまで処理します。乾燥させた脂質に20 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.3）を1 mL加え、ウォーターバスで約30秒間再懸濁させます。得られた白濁した懸濁液を、円錐底のプラスチック製15 mLチューブにピペットで移します。脂質が元々入っていた空のガラスバイアルに、リン酸緩衝液をさらに1 mL加え、超音波処理を繰り返します。得られた懸濁液を同じ15 mLチューブに加えます。この工程を計4回繰り返し、最終的に体積を4 mL、脂質濃度を5 mg/mLにします。脂質小胞懸濁液を温水バスに入れ、超音波処理用マイクロチップを用いて、デューティサイクル50%で1時間ソニケーションを行います。温水バスは、脂質溶液が過熱することを防ぎ、水系脂質溶液の温度を二層相転移温度以上に維持する役割を果たします。超音波処理した溶液を0.22 µmのシリンジフィルターでろ過してアトムチップの破片を除去し、ろ過後の溶液を37 °Cで一

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我々は単一細胞の蛍光を用いて立体構造変化の部位特異的解析と並んで膜タンパク質のイオン輸送の動態を測定する方法を説明します。この手法は、イオンチャネル、トランスポーター、イオンポンプに適応可能であり、タンパク質サブユニット間の距離の制約を決定するために利用することができます。...

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