蛍光分光法により測定膜タンパク質フォールディングの熱力学

本実験の目的は、膜タンパク質のフォールディングに伴う熱力学的な特性を測定することです。まず、膜タンパク質のフォールディング環境として機能する小さなLAR小胞を構築し、その後、この小胞を用いて、タンパク質と系統的に濃度を変化させた尿素を含むサンプルを調製します。

次に、各サンプルのトリプトファン蛍光スペクトルを測定します。膜タンパク質の展開曲線を生成するために必要なデータを収集するため、トリプトファン蛍光スペクトルから作成された展開曲線に基づいて、膜タンパク質の展開におけるギブス自由エネルギーをどのように算出できるかを示す結果が得られます。こんにちは、私はカリフォルニア大学サンディエゴ校の助教授、Judy Kimです。

これからご覧いただく手法では、膜タンパク質の重要な特性について明らかにします。具体的には、脂質二重層に折りたたまれ、挿入されたタンパク質の安定性を測定する方法を説明します。私はカリフォルニア大学サンディエゴ校（UCSD）化学科の大学院生、ダイアナ・オッティンガーです。

本日は、代表的な膜タンパク質を用いてこの方法を実演します。しかし、この手法は汎用性があり、膜結合ペプチドや可溶性タンパク質などの他の生物学的システムにも適用可能です。それでは、始めていきましょう。

このプロトコルを開始する前に、1,2-ジミリスチイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DMPC）脂質のクロロホルム溶液を購入し、清潔なガラスバイアルに移します。1バイアルあたり20 mgの分量で分注し、脂質の酸化を防ぐために各バイアルに窒素ガスを充填して密封します。1回の実験につき、クロロホルムに溶解した20 mgの脂質を含むバイアルを1本使用します。

ストックベシクル溶液を調製するには、まずテフロンセプタムとニードルを用い、窒素ガス気流下でバイアルの内容物を1時間乾燥させ、溶媒が完全になくなるまで処理します。乾燥させた脂質に20 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.3）を1 mL加え、ウォーターバスで約30秒間再懸濁させます。得られた白濁した懸濁液を、円錐底のプラスチック製15 mLチューブにピペットで移します。

脂質が元々入っていた空のガラスバイアルに、リン酸緩衝液をさらに1 mL加え、超音波処理を繰り返します。得られた懸濁液を同じ15 mLチューブに加えます。この工程を計4回繰り返し、最終的に体積を4 mL、脂質濃度を5 mg/mLにします。

脂質小胞懸濁液を温水バスに入れ、超音波処理用マイクロチップを用いて、デューティサイクル50%で1時間ソニケーションを行います。温水バスは、脂質溶液が過熱することを防ぎ、水系脂質溶液の温度を二層相転移温度以上に維持する役割を果たします。

超音波処理した溶液を0.22 µmのシリンジフィルターでろ過してアトムチップの破片を除去し、ろ過後の溶液を37 °Cで一晩静置して平衡化させます。初期の蛍光アンフォールディングのサンプルを調製するため、20 mMリン酸緩衝液を用いた10 M尿素のストック溶液と、20 mMリン酸のストック緩衝液を調製します。記載されているプロトコルに従い、尿素濃度は屈折計を用いて屈折率を測定し、既知の値と比較することで実験的に決定する必要があります。

次に、8 M urea、20 mM リン酸緩衝液中に、タンパク質濃度が約 200 µM となるように変性タンパク質のストック溶液を調製します。このビデオでは、プロトコルの実演に膜タンパク質 OPA1 を使用しています。蛍光研究用のサンプルは、適切な量のタンパク質ストック溶液、脂質ストック溶液、10 M urea ストック溶液、およびリン酸緩衝液ストック溶液を混合し、タンパク質濃度が約 4 µM、脂質濃度が 1 mg/mL で、urea 濃度が 0 から 8 M まで 1 M 刻みとなるように調製し、最終容量を 200 µL とします。ブランクサンプルも同様の方法で調製します。

ただし、タンパク質の代わりに8 Mの尿素溶液を4 µL添加します。これらのブランクは、タンパク質の蛍光スペクトルに現れる散乱およびバックグラウンド信号を差し引くために作成します。蛍光スペクトルの測定前に、タンパク質試料とブランクを37 °Cで少なくとも2時間インキュベートしてください。

完全なフォールディングを確実にするため、測定の1時間前にフルオリメーターの電源を入れておきます。一般に、膜タンパク質は温度が脂質二重層の相転移温度を上回っている場合にのみ、合成脂質中でフォールディングします。したがって、DMPCの場合、フルオリメーターのサンプルホルダーの温度は30 °Cに設定します。

定常状態蛍光光度計を用いて蛍光実験の準備を行い、各サンプルのトリプトファン蛍光をブランク差しで測定します。チロシン残基の励起を避けるため、励起波長は290 nanometersに設定し、305から500 nanometersの範囲で蛍光を収集します。入射および出射のバンドパスは3 nanometersを使用してください。

波長増分と積分時間は、S/N比に合わせて最適化できます。波長増分と積分時間の一般的な値は、それぞれ1ステップあたり1 nmおよび0.5 sです。容量160 µLのマイクロボリューム合成石英Q Vetにサンプルを200 µLピペッティングし、そのQ Vetを装置のQ Vetホルダーに設置します。

最後に、蛍光測定を開始できます。蛍光スペクトルのXYデータシートを、Igor Pro、MATLAB、Origin、またはExcelなどのソフトウェアに読み込みます。このデモンストレーションでは、Igor Proを使用して、尿素および脂質ベシクルの背景を削除し、ブランク試料の蛍光スペクトルにSスケーラーを掛け合わせ、それをタンパク質脂質溶液の未処理の蛍光スペクトルから差し引きます。対応する尿素濃度における、補正後のスペクトルの最大蛍光波長（λmax）をリスト化してください。

各尿素濃度について。完全に変性した膜タンパク質の代表的な値は350 nanometersです。一方で、折り畳まれたタンパク質は約330 nanometersであるため、lambda max値の範囲を0から1の範囲に変換することで、表形式の波長を解離分率に変換し、lambda max値を変性個体群の割合に相関させます。

次に、変性したタンパク質の割合を尿素濃度に対してプロットします。変性率Fと尿素濃度Cのプロットは、タンパク質が折り畳み状態または変性状態のいずれかで存在すると仮定する方程式に適合させることができます。係数Mは変性剤濃度に対する自由エネルギーの変化率に対応し、CMは折り畳み状態の集団と変性状態の集団が等しくなる尿素濃度の中間点に対応します。

Rは気体定数、Tは温度（ケルビン）です。フィッティングの手順により、係数mおよびcmの値が算出されます。

これらの係数を掛け合わせることで、尿素非存在下における展開のギブス自由エネルギーであるdelta Gを決定します。上述の展開曲線は、lambda maxに最大の変化をもたらす尿素濃度の範囲を示しています。展開の自由エネルギーを正確に決定するため、この範囲は通常狭く、展開の大部分はこの狭い範囲内で起こります。

最適化された最小二乗法によるフィッティングに必要な多くのデータポイントを含むプロットを得るために、この領域で追加のサンプルを分析する必要があります。例えば、タンパク質が2 Mから4 Mの間で変性する場合、展開曲線のこの重要な領域の形状をより正確に明らかにするために、これらの尿素濃度の間で0.2 M刻みのサンプルを作成します。最良の結果を得るには、少なくとも0.5 Mステップごと、および0.2 Mステップごとにブランクを含める必要があります。

このプロットから得られる展開の自由エネルギーは、元の展開曲線から得られた値とはわずかに異なる場合がありますが、より正確な値に基づいています。ここでは、単一のトリプトファン残基を含む代表的な膜タンパク質 om a のトリプトファン蛍光スペクトルを示します。プロトコルに記載されている通り、タンパク質の生データからブランクの生データが差し引かれ、補正後のスペクトルが得られています。

記載された手法に基づき、さまざまな尿素濃度における膜タンパク質の補正済みトリプトファン蛍光スペクトルをここに示します。この実演では、タンパク質が折り畳まれた状態か展開された状態のいずれかであり、安定した中間状態は存在しないという仮定の下で、展開曲線を作成しました。パラメーターMは展開時に溶媒にさらされるポリペプチド量を反映し、CMは折り畳まれた集団と展開された集団が同数になるために必要な変性剤濃度を示す重要な値です。

CMおよびMの値が大きいことは、タンパク質が安定していることを示します。この手順に従い、OPA αの展開ギブス自由エネルギーを算出したところ、6.2 kilo calories per moleでした。タンパク質折り畳みの熱力学に関する同様の情報を得るために、熱、pH、その他の化学的変性剤などの他の展開方法を用いることができます。

このビデオを視聴することで、折りたたみ状態と変性状態の異なる蛍光特性に基づいて、タンパク質の安定性を測定する方法を十分に理解できるはずです。あるいは、使用する分析ツールにかかわらず、タンパク質のコンフォメーションに関する報告がなされる方法であれば、円二色性などの他の手法を用いて変性曲線を作成することも可能です。変性曲線による手法は汎用性が高く、幅広い膜タンパク質および可溶性タンパク質に適用できます。