免疫細胞：ヒト神経幹細胞

こんにちは、スティーブです。私は、アーバインにあるカリフォルニア大学医学部の病理学科にあるフラナガン博士の研究室で働いています。そして今日は、ヒト神経前駆細胞の免疫化学を行う方法をお見せします。

このプロトコルには、細胞をLain Coated Cover Slipsに載せ、一次抗体中の細胞を一晩ブロッキングしてインキュベートし、その後、いくつかのISを行い、二次抗体を室温で置くことが含まれます。そして最後に、カバーを顕微鏡のフライトに取り付けます。さっそく始めましょう。

そこで、まず、幅12mmの無菌のドイツ製ガラスカバースリップを3枚、24ウェルプレートにセットしてラミネートします。さて、プレートにカバースリップを入れ、まずPDLポリリジンの溶液を加え、カバーサブをPDLで室温で5分間インキュベートします。さて、5分後にPDLを取り出してラミニンを塗り、カバースリップをラミネートで少なくとも4時間以上一晩インキュベートします。

そこで、プレートをラミネートで一晩インキュベートし、次に、すでにカウントしたPBSとプレートのヒト神経前駆細胞でカバースリップをすすぎます。そこで、ラミネート液を取り外したばかりで、今度はPBSでカバースリップを抑制します。そこで、PBSを取り外して、メディアソリューションを装着します。

そしてついに、細胞を見る準備が整いました。だから、私はミルあたり10万個の細胞を見るつもりです、つまり、24ウェルプレートの場合、私はウェルあたり50, 000個の細胞を追加するつもりです。そこで、プレートを左右に傾けて、セルがカバースリップの表面に均等に広がるようにします。

そして今、私はそれらをインキュベーターに少なくとも24時間入れて、免疫化学のために落ち着いて広げるつもりです。細胞は24時間成長しており、それらを見てみると、それらは付着してきれいに広がっています。だから今、私は5分間4%perforの高さでそれらを修正するつもりです。

しかし、最初にメディアを取り出し、細胞を乾燥させたくありません。そこで、メディアを取り外し、同時に固定剤を追加します。だから、それは両手技と呼ばれています。

そこで、細胞を固定液で室温で5分間インキュベートします。だから5分経ちました。PFAを除去してPFA廃棄物容器に入れ、PBSを追加すると同時にPFAを除去して、細胞が乾燥しないようにします。

そこで、このプラスチック製吸引ピペットの1つを使用してPFAを引き上げ、タイマーを5分に設定します。そこで、細胞をPBS洗浄液で洗浄している間に、Triton X 100を使用して透過可視化液を調製します。非イオン性洗剤で、非常に粘性があります。

そのため、すべての溶液がピペットに入るまで待つことが重要です。そこで、PBSに0.3%の溶液を調製し、PBSを10ミル加えます。そして、この10ミルのPBSに、次の100マイクロリットルのトライを追加します。

そこで、30マイクロリットルのトライリットルを次の100〜10ミルのPBSに追加します。そこで、すべてのソリューションをヒントに入れるために、約10秒を追加します。だから私は、ここに私のパーマ利用ソリューションがあります。

ローテーターに10分間置いてから、ボルテックスして粘性のあるトリットンが完全に溶けたことを確認します。これで、透過の視覚化ステップを実行する準備が整いました。そして、私は賢明に、室温で5分間行くつもりです。

だから5分経ちました。これから5分間のPBS洗浄を3回行い、トリトンをすべて洗い流します。そこでもう一度、時計を5分に設定します。

だから私は、ちょうど私のすべての洗浄ステップを終えたので、ブロッキングステップを行う準備ができました。そこで、ブロッキングステップでは、PBSに5%BSA溶液を調製しました。そして、すべての洗浄と同様に、PBSを取り外し、同時にブロッキングソリューションを追加します。

そして、ブロッキングステップは室温で1時間進行します。そこで、細胞がブロッキングしている間に、一次抗体のインキュベーションのためにプレートを準備します。そこで、このガラス板から始めて、このサイズのパラフィルムを切り取ります。

そして、私がやろうとしていることは、それを包み込むつもりで、テープが必要なので、テープが4枚必要になります。だから、私はそれらすべてを準備するつもりです。そこで、このパラフィルムを取り出して、表面がきれいで滑らかになるようにまっすぐにします。

そして、両端をガラス板の裏側にテープで貼り付けます。そこで、これをもう一方の端を引っ張って表面がまっすぐになるようにし、もう一方の端を後ろにテープで固定します。だから今、私は最初のものと同じサイズのペアフィルムの別の部分が必要です。

そして、基本的には私も同じことをするつもりです。そこで、1枚目のパラフィルムの上に2枚目のパラフィルムをテープで貼り付けましたが、1枚目と同じように、2枚目のパーフィルの片方の端を緩めたままにしたのは、抗体溶液を置くため、1枚目でパワースリップするためです。そして、その上にサンドイッチを作るための2つ目のピースを置きます。

しかし、今は、抗体溶液を置く場所にラベルを貼り、カバーするつもりです。そこで、細胞をブロッキング溶液に1時間入れたので、これから一次抗体の液滴にカバースリップを貼って一晩インキュベートします。そこで、35マイクロリットルの一次抗体を一滴入れ、泡を発生させたり、抗体の抗原結合を妨害したりする可能性があるため、すべての液体を排出しないように細心の注意

ですから、3滴すべての一次抗体に泡が入らないようにし、これらの液滴に細胞の入ったカバースリップを覆う準備ができています。そこで、これからやることは、カバースリップを手に取ることです。そこで、まずカバースリップを横に動かし、ピンセットを開けた状態でそっと持ち上げてみます。

カバースリップを握ったように感じたらすぐに、ピンセットをゆっくりと閉じ、カバースリップをウェルからそっと持ち上げます。つまり、今のセルはカバースリップの上にあります。そこで、私がやろうとしていることは、反転して反転させ、滴にそっと触れて、泡を作らずにゆっくりと液滴の上に置きます。

そこで、2枚目と3枚目のカバースリップでも同じ手順を繰り返します。そして最後のステップは、パラフィルムの2枚目を上に置くことです。そして、私がそれを行う方法は、そのように一気にそれを置くことです。

動かないようにしたい、左右に動かしたい。そして最後に、別のテープでプレートの底に固定します。そしてついに、細胞を4°Cで一晩インキュベートする準備が整いました。これが免疫化学の1日目の終わりです。

これは免疫化学の2日目で、PB S3でカバースリップを5分間洗浄します。その後、二次抗体を室温で2時間インキュベートします。まず、パラフィルムをそのようにカットして、カバースリップを外すことができるようにします。

そして、パラフィルムの上部をゆっくりと持ち上げて、カバースリップがケアパラフィルムの下部に残るようにします。それで、最初のピースを取り外し、PBS洗浄液の入ったプレートを用意しました。そこで、各カバースープを持ち上げてウェルに入れ、エピトープに付着しなかった残りの一次抗体を洗い流します。

そこで、カバースリップを持ち上げるには、まずカミソリの刃でそのように持ち、そっと拾い上げてみます。そして、細胞が抗体溶液に直面しているので、私はそれらをひっくり返して彼らが上に来るようにし、それをウェルにスライドさせて上にまだ残るようにします。そして、残りのパワースリップについても手順を繰り返します。

そして、5分間洗われることになります。だから5分経ちました。PBSソリューションを交換します。

フックダイスを追加します。今度は5分間インキュベートします。それで、フックのインキュベーションが終了し、今、私はカバーsosをマウントする準備ができて、それらを見て。

だから最初に私はalkクワッドベクトルシールドに行く、これは漂白のための蛍光ダイムを防ぐのに役立ちます。まず、スライドにカバースリップの番号をラベル付けし、次に10マイクロリットルのベクトルシールドを配置します。ベクターシールドは、油分で本当に粘性があるので、全てが先端に入るまで少し待つことも大切です。

そこで、顕微鏡のスライドにベクトルシールドを配置し、これでカバースリップを顕微鏡のスライドに配置する準備が整いました。まず、カバースリップを手に取り、カバースリップの裏側を脱イオン水ですすいでくい、そうしないと、乾燥するとPBSに含まれていた塩分が結晶化し、蛍光ダイの光学特性に支障をきたすからです。だから、脱イオン水を用意しました。

そこで、カバースリップを手に取り、その裏側を脱イオン水ですすいでいきます。そして、ブリキのおしりふきを触って乾かします。そして、再び反転させて、細胞側が反転して顕微鏡スライドに下がるようにします。

そして、先ほどと同じように、ベクトルシールドの滴に触れて、泡を閉じ込めずにゆっくりと下げていきます。そして、すべてのカーゴフリップについて、同じ手順を繰り返します。それでは、見てみましょう。

これは、免疫化学を行い、写真を取得し、オーバーレイなどを作成した後に得られる可能性のあるものの例です。ですから、この画像では、これは、出生後のマウスのへこみから分離された海馬神経幹細胞の画像です。今日は、ヒト神経前駆細胞の免疫化学を行う方法を紹介しました。

そして、お気づきの方もいらっしゃると思いますが、この技術により、膨張性のある抗体試薬を保存することができます。パーフィルに少量の滴を垂らし、その上に細胞を載せた状態でカバースリップを反転させることにより、非常に少量の一次抗体と二次抗体を使用しました。それでは、続けて、免疫療法化学を行い、私を見ていただきありがとうございます。