Name: 免疫細胞：ヒト神経幹細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-24T00:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 41 s
Description: 学ぶ免疫細胞化学法を用いたヒト神経前駆細胞の解析手法。一次抗体と二次抗体を用いた染色プロトコルで、抗原局在を可視化し、抗体使用量を削減して神経科学研究の再現性を向上させます。

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著者らは、小児病院、パラフィルムの染色技術で最初の命令のためにエモリー大学でhNSPC文化や博士ゲイリーBassellを提供するためのオレンジカウンティ研究所で国立ヒト神経幹細胞資源の博士フィリップH.シュワルツ氏に感謝します。

1日目：ドイツのガラス製カバースリップとその種の細胞を調製する 注 ：ドイツのガラス製カバースリップは、多くの場合、培養一次神経幹細胞および神経細胞に対して好ましい。我々は、細胞接着と拡散を改善するために以下の洗浄プロトコルを使用してください。カバーの両側に液体のアクセスを許可する小さなラック内の位置は、カバースリップ。最初に、脱イオン水で3回洗浄に続いて10分間1％Liquinoxにカバースリップを、インキュベートする。は石鹸の泡が残っていないことを確認してください。次に、30分間1M HCl中でインキュベートスリップは、脱イオン水で3回洗浄した。 65℃乾燥したカバースリップ℃で一晩。ガラス皿と滅菌するオートクレーブにカバースリップを転送します。 <ol><li>組織培養フードの中で、適切なサイズのウェルプレートに滅菌カバーグラスを置く。 </li><li>細胞接着のためのラミニンでコートカバースリップ。室温で5分間10μg/ mlのポリ滅菌水でD -リシン（PDL）でカバースリップをインキュベートする。 37℃の組織培養インキュベーターで、一晩4時間、またはのためのEMEM 20μg/ mlのラミニンでPDLとインキュベートカバースリップを取り除きます。 <ol><li> 注 ： 継代ヒト神経幹細胞の記事（への参照<a href="/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> ）とカウントヒト神経幹細胞の記事（ <a href="/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com /インデックス/ Details.stp？ID = 262</a> hNSPCsを再懸濁し、カウントする方法を学ぶ）。 </li></ol></li><li>各カバースリップを含む一定の密度でも（私たちはしばしば、我々は免疫染色のためにメッキされたセルのための100,000-300,000細胞/ mlの初期播種密度を使用）にPBSとシード細胞とラミニンでコーティングされたカバースリップをすすぐ。 </li><li>場所は37のプレート℃の組織培養インキュベーターおよび細胞はカバースリップ（通常4時間の最小値が必要とされる）に付着することができます。 </li></ol> 2日目：固定、透過性、ブロッキング、および細胞に一次抗体を追加する 注 ：我々は、細胞の形態を維持するために、以下の4％パラホルムアルデヒド固定液を使用する。レシピは、パラホルムアルデヒドが溶液に入るようにするpHの移行が含まれています。より高い温度で蛍光を使用するときにバックグラウンド染色を増加させることができますギ酸の生成につながる可能性があるので、この方法ではなく、パラホルムアルデヒドを溶解するために熱の使用を好む。他の全体的な形態（ショ糖）を維持するのに役立つしながら固定ヘルプの一部のコンポーネントは、細胞骨格構造（MgCl 2及びEGTAを）維持する。 細胞を4％パラホルムアルデヒド固定液<table style="border-collapse: collapse; border: medium none" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 試薬と手順： </td><td> 固定液の100mLのための金額： </td></tr><tr><td> MilliQ水</td><td> 75ミリリットル</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド（ドラフト内で秤量） </td><td> 4グラム</td></tr><tr><td> 10N NaOHは、かき混ぜると解決策が解消されるまで滴下して加える</td><td>必要に応じて</td></tr><tr><td> 10 × PBS </td><td> 10ミリリットル</td></tr><tr><td> 1M MgCl 2の </td><td> 0.5ミリリットル</td></tr><tr><td> 0.5 M EGTA </td><td> 2ミリリットル</td></tr><tr><td>スクロース</td><td> 4グラム</td></tr><tr><td> 6N塩酸、pH7.4に滴定する</td><td>必要に応じて</td></tr><tr><td> MilliQ水</td><td> 100mlに持参</td></tr><tr><td colspan="2">最大1週間まで4℃で保存する。 37℃くらいまで温め、使用前に</td></tr></tbody></table><ol><li>ベンチで、メディアを取り出して、温めておいた固定液を加える。 5-15分（検出する抗原に応じて、我々は通常10分を使用）インキュベートする。この、室温では、次の手順を実行します。 </li><li>多くの機関が有害廃棄物としてホルムアルデヒドを取り扱うよう、適切なコンテナに固定液を捨てる。 PBS、5分ごとに時間で細胞を3回洗浄。細胞からソリューションを削除する際に、吸引は細胞を乾燥させないこと。また、いつものコートが、それらは非常に細胞が乾燥して残っていないしているソリューションを削除する前にセルを追加する一方で、次のソリューションを持っている。 </li><li>目的の抗原が細胞内にある場合、細胞膜は、抗体のエントリを可能にするために透過性にする必要があります。細胞を透過性に、PBSで新鮮な0.3パーセントトリトンX - 100溶液を使用してください。ピペットは、徐々にトリトンは粘性であり、そして洗剤が完全に細胞に添加する前に、PBSに溶解されていることを確認しますので。 PBS、5分ごとに時間で細胞を3回洗浄した細胞を5分、透過処理。 </li><li>細胞は、抗体の非特異的結合を防ぐためにブロッキング剤で処理する必要があります。我々は、ブロッキング剤としてウシ血清アルブミン（BSA）を使用してください。 （それは溶解に時間がかかるので、ロッカーやローテーター上で）ブロッキング溶液をPBSに5％BSAを溶解して作られてからゾルをフィルタリング0.45μmのシリンジフィルターでution。室温で1時間5％BSA / PBS溶液に細胞をブロックする。 </li></ol> 1％BSA / PBS（5％BSA / PBSから希釈して調製）で事前に決められた濃度に（興味の蛋白質のためうまくいけば、特定のである）一次抗体を希釈します。場所は、パラフィルムで覆われたガラス板上に一次抗体（25mmのカバースリップあたり30μL、18 mmのカバースリップあたり20μlの、12mmのカバースリップあたり15μl）を希釈した。細胞は下向きに、そして細胞が抗体と接触しているように抗体溶液の上に置くように反転させる、固定された細胞をカバースリップを拾う。構造全体での秒パラフィルムストリップを配置。 4℃で一晩インキュベートする。 3日目：洗濯、二次抗体のインキュベーション、核染色および取付け<ol><li>慎重に細胞が上直面しているので、トップパラフィルムストリップを取り外して、カバースリップをピックアップ、それを反転し、洗浄のために各ウェルにPBSでプレートに戻して置きます。 </li><li> PBS、5分ごとに時間で細胞を3回洗浄。 </li><li>一次抗体がウサギで行われた場合には、一次抗体を検出する二次抗体を選択して、例えば、、二次抗体はウサギIgGを認識すべきである。また、抗体（IgG、IgM抗体、等）抗体のアイソタイプが一致するように注意してください。複数の一次抗体を使用している場合、それらが異なる種またはアイソタイプ、および二次抗体に接続された別のマーカーを検出するために計画からのものであることを確認してください。たとえば、緑色の蛍光体に結合した抗マウス二次で赤蛍光体に抗ウサギ二次結合を使用することができます。一次と同じ技法を用いて、室温で暗所で2時間、1％BSAで適当な濃度に希釈した二次抗体溶液で細胞をインキュベート（ビデオには示されていないステップ）。二次はグリセリン溶液（25 mmのカバースリップあたり40μlの、18mmのカバースリップあたり30μL、12 mmのカバースリップあたり25μlの）として格納されている場合、インキュベーションに必要な二次抗体の量は、一次抗体のそれよりわずかに大きくなることがあります。 <ul><li> 注 ：あなたが二次抗体を可視化する蛍光分子を使用している場合は、試料が二次抗体が追加された後、光から保護される必要がある。暗闇の中で、またはフォイルカバープレートでインキュベートする。 </li></ul></li><li>一次抗体のために説明するように慎重にパラフィルムからカバースリップを取り除きます。細胞を2μg/ mlをヘキスト核PBSで希釈した染色（核の対比染色を優先する場合）で1分間のインキュベーションに続いて、PBSで2回、各時間5分を、洗う。ヘキスト染色した場合、古いですし、信号が弱過ぎないか、あなたは、インキュベーションの時間および/または濃度を増やすことができます。ヘキストとのインキュベーションの後、5分間PBSで1回洗浄する。 </li><li>カバースリップを顕微鏡で可視化するためのマウントメディアとスライド上にマウントする必要があります。蛍光分子は、二次抗体の可視化のために使用されるケースでは、マウントメディアは退色最小限に抑えるために薬剤が含まれている必要があります。我々は、蛍光用の取り付けメディアとしてVectashieldを使用してください。顕微鏡スライド上にVectashieldの適切なサイズのドロップ（25 mmのカバースリップあたり12μlの、18mmのカバースリップあたり6μL、12 mmのカバースリップあたり3μl）を置きます。 </li><li>慎重にカバースリップをピックアップし、塩を（PBSから）削除するには、脱イオン水で背中を洗う。キムワイプまたはペーパータオルで余分な水分をオフDAB、とは下に向けてセルを持つVectashieldのドロップに横たわっていた。角度でカバースリップを置き、トラップの気泡を避けるために徐々に下降することができます。日付と任意のサンプル情報を使用してスライドにラベルを付けます。 </li><li>カバーグラスとスライドはカバースリップの端の周りから（暗所で）過剰Vectashieldオフして吸引を乾燥することができます。必要に応じてカバースリップのエッジは今（カバーグラスを倒立顕微鏡で表示される場合に特に便利）、マニキュアで密封することができます。我々は通常、-20℃の冷凍庫に私たちのスライドを保存する。 </li></ol>

<ol><li>Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamin+A%2C+the+Arp2%2F3+complex%2C+and+the+morphology+and+function+of+cortical+actin+filaments+in+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells.</a> J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).</li>
<li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li>
<li>Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+analysis+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Human+Stem+Cell+Manual%3A+A+Laboratory+Guide%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical analysis of stem cells.</a> In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li>
</ol>

このプロトコルは、必要な抗体の量を最小限に抑え、信頼性の高い細胞の染色を与えるhNSPCsための免疫染色の手順を説明します。として説明する手順は、細胞内抗原に最適ですが、細胞表面分子を染色したり、細胞骨格の染色を高めるために変更することができます。

<table><tbody><tr><td>ドイツ製カバーガラス (Deutsche Spiegelglas)</td><td>器具</td><td>Carolina Biological</td><td>WW-63-3029</td><td>12, 15, 18, 22, 25 mmのカバーガラスが利用可能</td></tr><tr><td>Liquinox リン酸フリー洗剤</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273279</td><td>高粘度</td></tr><tr><td>ポリ-D-リシン臭化水素酸塩</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン (天然マウス)</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>EMEM (1X)</td><td>試薬</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>MT-10-010-CV</td><td>記載のカタログ番号でFisherより販売</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>器具</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>高粘度</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>潜在的な発がん性物質であり、粉末および溶液形態での使用には注意が必要</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (IgGフリー)</td><td>試薬</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-161</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>H-1399</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>試薬</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>粘性あり</td></tr></tbody></table>

免疫細胞：ヒト神経幹細胞

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

免疫細胞は、最も一般的に存在を決定するための非常に強力で、かなり簡単な方法、細胞内局在、及び目的の抗原の相対量、培養細胞での蛋白質、である。このプロトコルは、それらの染色質の高い、再現性の定性的および定量的データを取得中に研究者が一次および二次抗体を節約することを可能にする手順のわかりやすいシリーズを紹介。染色のために必要な抗体の量を節約するために役立つ、このプロトコルには2つの側面があります。一つは、細胞は組織培養プレートのウェルに配置されている小型の、円形のカバーグラス上で増殖されています。固定後、カバースリップ上の細胞は、プレートのウェルから除去することができます。抗体染色の場合は、セルとカバースリップをパラフィルム上に抗体溶液の小滴の上に反転し、乾燥を防ぐためパラフィルムの2番目の部分で覆われている。この方法を使用して、抗体溶液のだけ〜25μlの染色される各カバースリップ（またはサンプル）のために必要です。このプロトコルは、ヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCs）の免疫染色について説明します、しかし他の多くの細胞型に使用することができます。

免疫細胞が存在、細胞内局在性、および培養細胞における目的の抗原の相対量を決定する強力な方法です。このプロトコルは1つの抗体を節約し、自分の染色を最大限に活用することを可能にする手順のわかりやすいシリーズを紹介。

免疫細胞化学は、...の存在、細胞内局在、および相対的な存在量を決定するための、非常に強力でかなり簡便な手法です。

こんにちは、スティーブです。私は、アーバインにあるカリフォルニア大学医学部の病理学科にあるフラナガン博士の研究室で働いています。そして今日は、ヒト神経前駆細胞の免疫化学を行う方法をお見せします。このプロトコルには、細胞をLain Coated Cover Slipsに載せ、一次抗体中の細胞を一晩ブロッキングしてインキュベートし、その後、いくつかのISを行い、二次抗体を室温で置くことが含まれます。そして最後に、カバーを顕微鏡のフライトに取り付けます。さっそく始めましょう。そこで、まず、幅12mmの無菌のドイツ製ガラスカバースリップを3枚、24ウェルプレートにセットしてラミネートします。さて、プレートにカバースリップを入れ、まずPDLポリリジンの溶液を加え、カバーサブをPDLで室温で5分間インキュベートします。さて、5分後にPDLを取り出してラミニンを塗り、カバースリップをラミネートで少なくとも4時間以上一晩インキュベートします。そこで、プレートをラミネートで一晩インキュベートし、次に、すでにカウントしたPBSとプレートのヒト神経前駆細胞でカバースリップをすすぎます。そこで、ラミネート液を取り外したばかりで、今度はPBSでカバースリップを抑制します。そこで、PBSを取り外して、メディアソリューションを装着します。そしてついに、細胞を見る準備が整いました。だから、私はミルあたり10万個の細胞を見るつもりです、つまり、24ウェルプレートの場合、私はウェルあたり50, 000個の細胞を追加するつもりです。そこで、プレートを左右に傾けて、セルがカバースリップの表面に均等に広がるようにします。そして今、私はそれらをインキュベーターに少なくとも24時間入れて、免疫化学のために落ち着いて広げるつもりです。細胞は24時間成長しており、それらを見てみると、それらは付着してきれいに広がっています。だから今、私は5分間4%perforの高さでそれらを修正するつもりです。しかし、最初にメディアを取り出し、細胞を乾燥させたくありません。そこで、メディアを取り外し、同時に固定剤を追加します。だから、それは両手技と呼ばれています。そこで、細胞を固定液で室温で5分間インキュベートします。だから5分経ちました。PFAを除去してPFA廃棄物容器に入れ、PBSを追加すると同時にPFAを除去して、細胞が乾燥しないようにします。そこで、このプラスチック製吸引ピペットの1つを使用してPFAを引き上げ、タイマーを5分に設定します。そこで、細胞をPBS洗浄液で洗浄している間に、Triton X 100を使用して透過可視化液を調製します。非イオン性洗剤で、非常に粘性があります。そのため、すべての溶液がピペットに入るまで待つことが重要です。そこで、PBSに0.3%の溶液を調製し、PBSを10ミル加えます。そして、

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Research

JoVE Journal

Biology

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細胞表面マーカー（SSEA-3/SSEA-4）のためのヒト多能性幹細胞（hPSCs）の懸濁液を免疫細胞化学染色を観察し、定量化のための細胞の単層を作成するために自作サイトスピン装置の使用に基づいて達成された。...

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このビデオプロトコルは、神経コロニー形成細胞アッセイを用いて神経前駆細胞の混合集団で善意の神経幹細胞を区別して列挙する方法を示しています。...

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このビデオでは、EdU取り込みを使用して脳組織切片で新たに増殖した神経幹細胞を染色し、続いて免疫蛍光法で特定のタンパク質を可視化する手順を示し、細胞の動態と増殖の理解を深めます。...

マウス脳切片における増殖神経幹細胞の可視化のための免疫蛍光染色

出典:Becker-Kojić, Z. A., et al., GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells.J. Vis.

末梢血由来細胞から分化した神経細胞の免疫蛍光顕微鏡法

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大人の齧歯類の脳の従来の従来にない地域から神経幹細胞を増殖させる

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自家蛍光法を用いた in vitro での神経幹細胞の活性化状態の分類

学ぶ免疫細胞化学法を用いたヒト神経前駆細胞の解析手法。一次抗体と二次抗体を用いた染色プロトコルで、抗原局在を可視化し、抗体使用量を削減して神経科学研究の再現性を向上させます。

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