Name: β-グルクロニダーゼ（GUS）に基づく細胞死アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学ぶGUSレポーターシステムを用いた植物細胞死アッセイ法。Nicotiana benthamiana葉を用いた迅速な遺伝子機能解析手法で、組織化学染色と蛍光定量法で可視化・定量化します。

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タバコbenthamiana植物は25℃での温度制御成長チャンバーで栽培されています。 3月6日週令の植物の完全に展開された健康な葉が使用されます。 ヒント：より良い結果が新たに出現した葉を使用して得られる 1。アグロバクテリウム一時的な浸透のプロトコル： 日1 <ol><li>細胞死のために、アッセイする遺伝子（群）とを含むベクターを用いて適切なベクターを含むアグロバクテリウムツメファシエンス（LBA4404株）のグリセロールストックを持つストリークLB /リファンピシン（25μg/ mlの）/カナマイシン（100μg/ ml）を寒天プレート構成的プロモーターの下でGUSカセット。常にネガティブコントロールとして空のベクターコントロールが含まれています。 </li><li> 28℃で2日間インキュベートする。 </li></ol>日3 <ol><li>以前に縞各LB /リファンピシン/カナマイシンプレートから単一コロニーとリファンピシン（25μg/ mlの）とカナマイシン（100μg/ ml）を含むLB 2 mlを接種する。 </li><li>最大成長の密度に達するまで、200rpmで24時間28℃で振盪することにより、各培養液を、。 </li></ol> ヒント：クランピングは、時々ケースの文化は徹底的に進める前に（ピペッティングすなわち）再懸する必要があるで、観察される。 日4 <ol><li>インキュベーションの後、新鮮なLB（適切な抗生物質を含む）とアセトシリンゴン（最終濃度25μM）で10 mLまでの総容積を増加させる。 </li><li>別の16時間28℃で振盪することにより、各培養液を、。 </li></ol>日5 <ol><li>翌日は、室温で10分間4000 × gで（アセトシリンゴンを追加しない）浸潤の培地（10 mMのMgSO 4を 7H 2 O、9mmのMES、pHは5.6）と遠心分離を10 mlを加えることによって二度、それぞれの文化を洗う。 </li><li>最後の遠心分離工程の後に、アセトシリンゴン（100μM）を含む5mlの浸透培地中でそれぞれの文化を再懸濁します。 </li><li> OD 600nmのを測定し、0.1と0.9の間で測定値が許容範囲です。 ヒント：0.1と低いのOD 600nmのは問題もなく使用されている、しかし、より高いODSは、より一貫性のある結果を生むかもしれません。 </li><li>感染症のためのアグロバクテリウム培養液を準備するより3時間培養をインキュベートする。 </li><li>分析する遺伝子（群）とGUSカセットを含む培養と1:1の比率で、ネガティブコントロール（アグロバクテリウムは、空のベクターを含む）を含む混合培養。 </li><li> 1mlの無針注射器（図1）を使用して新興の葉の背軸（下）側に潜入。 ヒント：ネガティブコントロールの混合物（空のベクトル+ GUSカセット）と同じ植物の反対側の葉の上に（遺伝子X + GUSカセット）、アッセイする遺伝子を含有する混合物の両方に潜入。それぞれの治療のために三重工場を使用してください。 </li><li> 3日後の浸潤の消費税は、GUS蛋白質の発現のために葉やアッセイに潜入。 </li></ol> 2。組織化学的GUSアッセイ日8 <ol><li>切除した葉にX - gluc基板媒体に潜入掃除機。 </li><li>室温で一晩、または個別の青色染色が表示されるまで、暗闇の中でインキュベートする。 </li></ol>日9 <ol><li>蒸留水ですすいでください。 </li><li>クロロフィルが削除されるまで、再び蒸留水に転送し、70％エタノールでインキュベートする。視覚的にGUSの発現レベルを評価する。 </li></ol> 3。蛍光MUGアッセイ： 日8 <ol><li>液体窒素を使用して、すり鉢で浸透した葉ディスクを粉砕することにより総タンパク質を分離します。 GUS抽出バッファー（50mMのNAPI液（pH7.0）、10mMのEDTA、0.1％トリトンX - 100、0.1％N -ラウロイルサルコシンナトリウム塩、β-メルカプトエタノール（0.7μL/ ml）を氷上でサンプルを保ちながらの100μLのを追加。 </li><li> 4℃で5分間、14,000 gでサスペンションを遠心し、全可溶性タンパク質として上清を取る。 </li><li>製造元の指示に従って光度計を使用して濃度を測定します。 </li><li> GUS抽出バッファーを使用して、各サンプルの総可溶性タンパク質100μgのためにタンパク質の濃度を調整します。 </li><li> 2 mMの最終濃度にGUS抽出緩衝液中で調製MUG基板（4 - メチルウンベリフェリル-β- D -グルクロニド三水和物）を追加します。サンプルあたり100μL（タンパク質+マグの基板）の合計量は十分なはずです。 </li><li> 37℃で1時間反応をインキュベート℃に</li><li> GUSストップバッファー（0.2 M Na 2 CO 3）を800μlを添加して反応を停止します。 </li><li>蛍光が365 nmと455 nmの発光波長の励起波長でプレートリーダーを使用してMU標準曲線に値を比較測定します。蛋白質/分nmolのMU /μgの全可溶性としてGUS活性のレベルを報告する。 </li></ol> 4。株式とソリューション： <ol><li>アセトシリンゴン（1 M）株式（FW = 196.2グラム） サブ&gt; - DMSO 5mL中0.981グラム</li><li>カナマイシン（100 mg / ml）を株式には、 -のdH 2 0で準備する-フィルター滅菌</li><li>リファンピシン（25 mg / ml）の株価は - DMSOで準備</li><li>ルリア - ベルターニ（LB）液体増殖培地：（1L） 1％（w / v）のバクト - トリプトン、10gの 0.5％（w / v）のバクト酵母エキス、5gの 170 mM塩化ナトリウム10グラム pHは - 7 </li><li>アセトシリンゴン（25μM）を1mlの最終容量の1Mストックの=25μlの</li><li>浸透ミディアム：（1L） 10mMのMgSO 4を 0.7のdH 2 0（FW = 246.48グラム）、2.4648グラム 9mmのMES（FW = 213.25グラム）、1.91925グラム pH値 - 5.6 </li><li>アセトシリンゴン（100μM）を1mlの最終容量の1M株式=100μlの</li><li> GUS抽出バッファー 50mMのNAPI液（pH7.0）、10mMのEDTA、0.1％トリトンX - 100、0.1％N -ラウロイルサルコシンナトリウム塩、β-メルカプトエタノール（0.7μL/ ml）を</li><li> 2倍のリン酸緩衝液 0.2MのNaH 2 PO 4、0.2 MのNa 2 HPO 4 pHを7 </li><li> X - Gluc基質溶液 0.1mlのメタノール5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドリルBD -グルクロニド（X - Gluc）1mgを溶解する。 、20μlの0.1Mフェリシアン化カリウム、10μlのトリトンX - 100を10％、蒸留水850μlを1ミリリットル2倍のリン酸緩衝液を追加します。 </li></ol> 5。代表的な結果： 細胞死が発生したときに、このプロトコルに続いて、GUSの発現の消失が期待されている。我々は同時にCYTO -保護シロイヌナズナのBcl - 2関連athanoGene（BAG）ファミリーのメンバーを持つβ-グルクロニダーゼレポーター遺伝子、（GUS）を発現している。我々の共同浸潤N. benthamianaは、アグロバクテリウム LBA4404株を用いて35S駆動型BAGの発現カセットとGUSベクターをpCAMBIA 2301を残します。図2に示すように、GUS染色で可視増加は、この浸潤後に観察された。逆に、Bcl - 2ファミリーの既知のアポトーシスメンバーBAXが使用された時、GUS染色の著しい減少は、（図2）が観察された。どちらの場合でも、GUS発現は、コントロールに比べて目に見えて違っていた。しかし、表現の差は少ないが明らかであるときは、蛍光MUGアッセイは、GUS発現をquanitateに行うことができます。 <img src="/files/ftp_upload/2680/2680fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 Nの背軸側のアグロバクテリウムの混合物の浸透の例benthamianaは、1mlの無針注射器を使用して残します。 <img src="/files/ftp_upload/2680/2680fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 GUSのベクトルはNで共発現されたbenthamianaは抗死の遺伝子、および細胞死の既知の誘導剤で残します。 GUSのレベルは空のベクトル制御（GUSコントロール）と比較した。

<ol><li>Jefferson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUS+fusions%3A+%2C+%CE%B2-glucuronidase+as+a+sensitive+and+versatile+gene+fusion+marker+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.</a> EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).</li>
<li>Nishihara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+%CE%B2-Glucuronidase+Gene+in+Pollen+of+Lily+%28Lilium+longiflorum%29%2C+Tobacco+%28Nicotiana+tabacum%29%2C+Nicotiana+rustica%2C+and+Peony+%28Paeonia+lactiflora%29+by+Particle+Bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of the β-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment.</a> Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).</li>
<li>Hodal, L. Plant Science. 87, 115-115 (1992).</li>
<li>Kabbage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BAG+proteins%3A+a+ubiquitous+family+of+chaperone+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci.+%22%5BJournal%5D)">The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators.</a> Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).</li>
<li>Kang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtBAG6%2C+a+novel+calmodulin-binding+protein%2C+induces+programmed+cell+death+in+yeast+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants.</a> Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).</li>
<li>Yan, J. Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).</li>
<li>Takayama, S., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperone+targeting+and+regulation+by+BAG+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins.</a> Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).</li>
<li>Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+analysis+of+BAG-1%3A+a+novel+Bcl-2-binding+protein+with+anti-cell+death+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity.</a> Cell. 80 (2), 279-279 (1995).</li>
<li>Vitha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+%CE%B2-glucuronidase+assay+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Quantitative β-glucuronidase assay in transgenic plants.</a> Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).</li>
<li>Otha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+Expression+in+Tobacco+of+a+%CE%B2-Glucuronidase+%28GUS%29+Reporter+Gene+Containing+an+Intron+Within+the+Coding+Sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Construction and Expression in Tobacco of a β-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence.</a> Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

<p class="jove_content"&gt;これは、哺乳類のシステムでは一般的な植物で細胞死の検出技術を使用することは困難です。 GUSレポーターシステムと組み合わせることで、我々は細胞死のプレイヤーの検出と解析のための植物ベースの、敏感な手法を提案する。このメソッドは、生きている細胞が発生するGUSの発現に必要であるという単純な事実を利用しています。意味のある結果と再現性を確保するためには、GUSのカセットと、アッセイする遺伝子を保有する文化が等しい割合で浸透していることが重要です。追加の潜在的な細胞死のプレーヤーを比較するときにこれらの比率は維持されるべきである。上記のように、我々が正常に多くの遺伝子の潜在的な死の機能を調査するために私たちのラボでこのメソッドを使用している。そのシンプルさで、我々はこのシステムを日常的に死の変調を検出するために使用することができると信じています。さらに、メソッドは単一の文化の混合物に複数の遺伝子を収容するために調整することができます。時々あることですが、特定の遺伝子の細胞死の機能は、他のプログラム細胞死のエフェクターでその活性化/抑制によって左右されます。したがって、複数の遺伝子がこれらの可能性を調査するためにGUSカセットを持つ単一の...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>リファンピシン</td><td> VWR </td><td> IC19549001 </td><td> DMSOに25mg/mLの株式</td></tr><tr><td> 4&#39; -ヒドロキシ-3&#39;、5&#39; -ジメトキシ（アセトシリンゴン） </td><td> VWR </td><td> TCD2666 </td><td> DMSOの0.981グラム/ mLの（1M株） </td></tr><tr><td> 2 - （4 - モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物（MES） </td><td> VWR </td><td> EM - 6110 </td><td>浸透培地1 Lを作るための水の1.92グラム/ L </td></tr><tr><td>バクトトリプトン</td><td>フィッシャー</td><td> BP1421 - 2 </td><td> LB培地1 Lを作るための水で10g / L </td></tr><tr><td>バクト酵母エキス</td><td> VWR </td><td> EM1.03753.0500 </td><td> LB培地1 Lを作るための水に5グラム/ L </td></tr><tr><td>ナトリウム塩化</td><td> VWR </td><td> EM - 7710 </td><td> LB培地1 Lを作るための水で10g / L </td></tr><tr><td>ナトリウム一塩基性リン酸一水和物</td><td> VWR </td><td> MK - 7868〜12 </td><td>バッファNAPIの50mmの作るための水に2.5グラム/ L </td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム、二塩基七水和物</td><td> VWR </td><td> EMD - SX0715 - 1 </td><td>バッファNAPIの50mmの作るための水に5グラム/ L </td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td> VWR </td><td> EM - MX0070 - 1 </td><td>浸透培地1 Lを作るための水では2.5 g / Lの</td></tr><tr><td> N -ラウロイルサルコシン</td><td> VWR </td><td> TCL0151 - 500G </td><td> GUS緩衝液で0.1％v / vの</td></tr><tr><td> 5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドキシル-β- D -グルクロニドシクロヘキシル塩（X - gluc） </td><td>ゴールドのバイオテクノロジー</td><td> G1281C </td><td>メタノール100％の1mg/100uL </td></tr><tr><td> 4 - メチルウンベリフェリル-μ- D -グルクロニド水和物（MUG） </td><td>シグマ</td><td> M5664 </td><td> GUS抽出バッファー100μlの2 mMの</td></tr><tr><td>フェロシアン化カリウム三水和物</td><td> VWR </td><td> EM - PX1460 - 1 </td><td> X - glucの基質溶液のための100mMの株式</td></tr><tr><td> β-メチルウンベリフェロン（MU） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M1381 </td><td> MU検量線の使用GUS抽出バッファー用</td></tr><tr><td>ナトリウム炭酸</td><td> VWR </td><td> EM - SX0395 - 11 </td><td> GUSストップバッファを作るための水に0.2 M </td></tr></tbody></table>

β-グルクロニダーゼ（gus）に基づく細胞死アッセイ

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

我々は、同時に細胞死の推定正または負の調節で、レポーター遺伝子、β-グルクロニダーゼ（GUS）を発現する新規の一時的な植物発現システムを開発した。このシステムでは、N. benthamianaの葉を分析する遺伝子を含む35S駆動発現カセットと同じ場所に浸潤、およびGUSベクターpCAMBIA 2301車両としてアグロバクテリウム株LBA4404を使用しています。生きている細胞が発生するGUSの発現に必要とされているため、このマーカー遺伝子は、細胞死の正の調節因子と共発現されると、GUS活性の損失が予想されます。同様に、GUS活性は、抗アポトーシス遺伝子をベクターコントロールと比較して使用する場合に観察される増加した。以下に示すように、我々が正常にプロと抗死のプレーヤーの両方を分析するために私たちのラボでこの制度を利用しています。これらは、植物の抗アポトーシスBcl - 2の関連athanoGene（BAG）家族だけでなく、そのようなBAXのような細胞死の既知の哺乳類の誘導を、含まれています。さらに、我々はこれらのタンパク質の可能な翻訳後修飾/アクティベーションについての手がかりを提供することができるタンパク質内の特定の切り捨て、の死の機能を解析するためにこの制度を利用しています。ここで、我々は、特定の遺伝子の死の機能を検討する上で最初のステップとして、迅速かつ高感度の植物ベースの手法を提案する。

一般的にこのようなDNAラダーやTUNELアッセイのような哺乳類のシステムで使用されるプログラム細胞死のアッセイは、しばしば植物に再現することは困難です。 GUSレポーターシステムと組み合わせることで、我々は特定の遺伝子の潜在的な死の特性を解析するために迅速、植物ベースのトランジェントアッセイを提案する。

β-グルクロニダーゼ（GUS）に基づく細胞死アッセイ

我々は、レポーター遺伝子である$\beta$-グルクロニダーゼ（GUS）と、推定上の...を同時に発現させる、新しい植物一過性発現系を開発しました。

本手順の全体的な目的は、Gusレポーターシステムを用いて、特定の遺伝子が持つ潜在的な死の特性を解析することです。目的遺伝子をGusカセットにクローニングし、35 Sプロモーター下で適切なアグロバクテリウムベクター内で増殖させます。次に、これらのベクターをアグロバクテリウム菌株LBA 44 0 4に形質転換し、Gus発現カセットを含む培養液と混合して、Nick Oceana Hamanaの葉に浸潤させます。Gus活性は、組織化学的染色による視覚的な評価、または蛍光定量的なmugアッセイによる定量的な評価が可能です。DNAラダリングやTUNELアッセイのような既存の手法に対する本手法の主な利点は、哺乳類系では一般的であるものの植物では再現が困難な点に対し、本手法は高感度かつ迅速な植物ベースの一過性アッセイであり、Gusの発現には生細胞が必要であるという単純な事実を利用している点にあります。本日の手順の実演はHua RAOsが行います。当研究室の博士研究員による浸潤法では、25°Cで生育させた生後3〜6週の健康で完全に展開したnicotiana hamanaの葉が必要です。このプロトコルは8日間で実施するように計画してください。1日目に、細胞死アッセイ用のベクターおよびGUS発現カセットを含むベクターを保持するAgrobacterium tumefaciensのグリセロールストックをプレートにストリークします。複数の培養組み合わせをテストする場合は、常に空ベクターを陰性対照またはスタッファーとして含めてください。プレートを28°Cで2日間インキュベートします。3日目に、各プレートから単一コロニーを2 mLの選択的LB培地に接種します。各培養液を28°C、200 RPMで24時間振盪培養し、最大増殖密度に達するまでインキュベートします。24時間の培養後、凝集が見られる場合はピペッティングによって培養物を完全に再懸濁し、アグロバクテリウムの病原性遺伝子を誘導するため、新鮮な選択LB培地を用いて各培養物の全量を10 millilitersまで増やします。アセトンを25 micromolarまで添加し、28 degrees Celsiusでさらに16時間振盪培養します。次に、各培養物を室温で4,000 Gs、10分間遠心分離し、ペレットを10 millilitersの浸潤用培地で再懸濁します。アセトンは添加せず、培養液を再度遠心分離します。次に、各ペレットを100 µMのアセトンを含む浸潤培地 5 mLで再懸濁してください。その後、600 nmでODを測定します。0.1という低濃度でも許容されますが、0.9を超える場合は、浸透処理の前に浸透媒質とアセトンで0.9まで希釈してください。培養後、再び28 °Cで3時間振盪培養します。実験群の培養液と対照群の培養液を、Gusカセットを含む培養液と1:1の比率で混合します。各培養サンプルについて、1 mLの針なしシリンジを用いて、ABAシールまたは新葉の裏面に浸潤させます。浸潤量は重要ではありません。水浸状の領域が形成されるのに十分な量が添加されたら、同一個体の対面する葉に、ネガティブコントロールとアッセイ対象の遺伝子の両方を浸潤させ、その後、さらに2個体の植物に対しても同様に浸潤させます。したがって、各培養につき植物を3連（トリプリケート）で用意します。浸潤から3日後、葉を回収し、gustタンパク質の発現をアッセイします。葉全体をxlu基質で完全に浸るまで真空浸潤させ、組織化学的分析を開始してください。次に、葉を室温の暗所で、はっきりとした青色の染色が見られるまで一晩インキュベートします。青色の染色が確認されたら、葉を蒸留水で洗浄し、クロロフィルが除去されるまで70% ethanolで一晩インキュベートします。翌日、葉を蒸留水で洗浄し、GUS発現レベルを評価します。Gus発現を定量するため、基質mugを蛍光産物muに変換し、これを測定します。まず、液体窒素を用いて乳鉢で浸潤させた葉ディスクをすり潰します。次に、サンプルを氷上に保持したまま、100 µLのGUS抽出バッファーを加えます。続いて、懸濁液を4 °Cで5分間、14,000 ×gで遠心分離し、Gusを含む全可溶性タンパク質を含む上清を回収します。NanoDropを用いて全可溶性タンパク質濃度を測定し、Gus抽出バッファーを用いて各サンプルの全タンパク質濃度を100 µgに調整します。次に、Gus抽出バッファーに溶解したmug基質を各サンプルに加え、最終濃度が2 mM mugとなるようにします。1サンプルあたり合計100 µLの容量で十分であり、ピペッティングで十分に混合した後、37 °Cで1時間反応させます。1時間後、800 µLのGUS停止緩衝液を加えて反応を停止させます。定量を目的として、各サンプル100 µLをマイクロタイタープレートに分注し、プレートリーダーで分析します。励起波長365 nm、蛍光波長455 nmで測定し、標準曲線と比較します。これにより、GUS活性を、全可溶性タンパク質1 µgあたりの1分間あたりのMUs（mu）として報告できます。GUS発現カセットを細胞死の負の調節因子または抗死遺伝子と共浸潤させた場合、使用したコンストラクトに応じて様々なGUSレベルが検出されます。比較すると、高いGusレベルが観察されます。空ベクターコントロールにおけるGusレベルは大幅に低くなります。逆に、細胞死の正の調節因子または促進遺伝子を用いた場合、空ベクターコントロールと比較してGus発現の顕著な減少が観察されます。この手法に習熟すれば、約1週間で完了させることができます。本手順を実施する際は、この手法が特定の遺伝子のポテンシャルを判断するための初期段階として用いられるものであることを忘れないでください。これらの初期結果を確認し、関与している細胞の種類を特定するには、さらなる検討が必要です。

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