β-グルクロニダーゼ（GUS）に基づく細胞死アッセイ

この手順の全体的な目標は、ガスレポーターシステムを使用して、特定の遺伝子の潜在的な死特性を分析することです。目的の遺伝子をGusカセットにクローニングし、35 sプロモーターの下で適切なアグロバクテリウムベクターで増殖させます。次いで、これらのベクターをアグロバクテリウム株LBA 44 0 4に変換し、ガス発現カセットを含む培養物と混合して、ニック・オセアナ・ハマナの葉に浸潤させる。

ガス活性は、組織化学的染色によって視覚的に評価することも、Fluorメトリックマグアッセイによって定量的に評価することもできます。DNAラダーやトンネルアッセイのような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、哺乳類のシステムで一般的に使用されていますが、植物での再現は困難であり、これは、ガス発現が起こるために生細胞が必要であるという単純な事実を利用した、高感度で迅速な植物ベースの一過性アッセイであるということです。今日、手順を実演するのはHua RAOです。

私たちの研究室のポスドク研究員は、浸透には、摂氏25度で栽培された生後3〜6週間のニコチアナハマナ植物の完全に拡張された健康な葉が必要です。このプロトコルを8日間にわたって実行する予定です。1日目には、細胞死アッセイ用のベクターを含むアグロバクテリウム腫瘍ファッサンのグリセロールストックと、Gus発現カセットを含むベクターには、複数の培養の組み合わせが試験される場合、常に空のベクターがネガティブコントロールまたはスタッファーとして含まれます。

プレートを摂氏28度で2日間インキュベートします。3日目に、各プレートから2ミリリットルの選択的LBに1つのコロニーを接種します。各培養物を28°Cで200 RPMで24時間振とうし、最大増殖密度に達するまでインキュベー

24時間のインキュベーション後、凝集がある場合はピペッティングで培養物を完全に再懸濁し、新鮮な選択的LBで各培養物の総量を10ミリリットルに増やして、アグロバクテリウム病原性遺伝子を誘導します。アセトンを25マイクロモルに添加し、各培養物を28°Cでさらに16時間振とうしながらインキュベートします。次のステップは、室温で 10 分間 4 、 000 G で各培養物を遠心分離し、 Resus で 10 ミリリットルの浸透培地にペレットを懸濁することです。

アセトンを加えないで、培養物を再度遠心分離しますが、今度はResusです。各ペレットを100マイクロモルのアセトンを含む5ミリリットルの浸透媒体に懸濁します。次に、600ナノメートルでODを測定します。

0.1 という低い濃度でもかまいませんが、0.9 を超える場合は、浸透前に浸透、中程度、アセトンで 0.9 に希釈してください。培養物を再び摂氏28度でインキュベーションし、インキュベーション後3時間振とうします。実験培養物とコントロール培養物を、Gusカセットを含む培養物と1対1の比率で混合します。

各培養物について、1ミリリットルの無針注射器を使用して、新たに出現した葉のABAシールまたは裏側に浸透します。浸透量は重要ではありません。水浸し領域が十分に形成されたら、同じ植物の対向する葉にネガティブコントロールとアッセイする遺伝子の両方を浸潤させ、その後、同じ方法でさらに2つの植物に浸透させます。

ですから、それぞれの文化には三重の植物があります。浸潤から3日後、葉を採取し、突風タンパク質の発現をアッセイします。組織化学分析は、完全に浸るまでxlu基質を葉全体に真空浸潤させることから開始します。

次に、葉を暗闇で室温で一晩、または青色の染色が明らかなときにはっきりとした青色の染色が現れるまでインキュベートします。葉を蒸留水ですすぎ、クロロフィルが除去されるまで70%エタノールで一晩インキュベートします。翌日、葉と蒸留水を洗い流し、GUSの発現レベルを評価します。

ガスの発現を定量化するために、基質マグカップを蛍光製品μに変換し、液体窒素を使用して乳鉢に浸潤した葉の円盤を粉砕することによって測定することができます。次に、サンプルを氷上に保持しながら、100マイクロリットルのGUS抽出バッファーを追加します。次に、懸濁液を摂氏4度で5分あたり14, 000GSで遠心分離し、ガスを含む全可溶性タンパク質を含む上清を収集します。

NanoDropを使用して全可溶性タンパク質濃度を測定し、Gus抽出バッファー中の各サンプルの濃度を総タンパク質100μgに調整します。次に、Gus抽出バッファーのマグカップ基質を各サンプルに加え、最終濃度が2ミリモルのマグカップになります。サンプルあたり100マイクロリットルの総容量をピペッティングで十分に混合し、反応を摂氏37度で1時間インキュベー

1時間後、800マイクロリットルの突風ストップバッファーを追加して反応を停止します。各サンプルのμ 100マイクロリットルを定量化するために、マイクロタイタープレートにロードし、プレートリーダーで分析します 蛍光 365ナノメートル励起455ナノメートルの発光波長で測定され、標準曲線と比較され、ガス活性は、次いで、総可溶性タンパク質のマイクログラム当たりのμmとして報告することができます 反応毎分GUS発現カセットが細胞死の負の調節因子または抗死遺伝子と共浸潤されるときに使用されるコンストラクトに応じて、さまざまな突風レベルが検出されます。

比較すると、高い突風レベルが観察されます。空のベクトル制御のガスレベルははるかに低くなっています。逆に、細胞死の陽性調節因子または死に至らしめる遺伝子を使用すると、空のベクターコントロールと比較して、Gus発現の市場減少が観察されます。

一度マスターすれば、このテクニックは約1週間で完了します。この手順を試みる際には、この手法が特定の遺伝子の可能性を判断するための最初のステップとして使用されることを覚えておくことが重要です。これらの初期結果を確認し、関与した細胞のタイプを決定するために、追加の作業を行う必要があります。