Name: 代謝標識とBioorthogonalクリックケミストリーによるゼブラフィッシュ胚でのイメージンググリカン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: 学ぶ、バイオオルソゴナルクリックケミストリーを用いてゼブラフィッシュ胚のフコシル化グリカンを代謝標識し、生体内イメージングで動的に可視化する方法です。発生生物学研究に有用です。

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と医学のアルバートアインシュタイン大学からスタートアップ資金、この作品は、部分的に国立衛生研究所（RDSへ3U54AI057158 - 06S1 PWにGM093282）によってサポートされていました。

1。卵の回収とDechorionation <ol><li>収集と35mmのペトリ皿にゼブラフィッシュ卵を転送、できるだけ多くの水のように削除してから、E3胚の培地で1 mg / mlのProneaseのE（5 mMのNaCl、0.17 mMの塩化カリウム、0.33 mMの塩化カルシウム2 · 2H 2 O、0.33 mMのマグネシウムを追加する絨毛膜を消化するために4、pH = 7.4）で。 </li><li> 3-5分後、魚の水（1リットル当たり60mgの"インスタントオーシャン"蒸留H 2 O）で満たされたビーカーに皿をマージし、穏やかにビーカーに卵を移すと、卵が水の中に"落ちる"ことができます。 </li><li>魚の水と卵を3回すすいでください。ほとんどの卵は、それらの絨毛膜から解放されます。 </li><li>ファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを用いて、E3胚の媒体が充填さアガロースコートしたペトリ皿にdechorionated卵を移す。 </li></ol> 2。 GDP - FucAlとマイクロインジェクション<ol><li>報告されたプロトコル7次の注入の料理を準備します。 </li><li> E3胚の媒体が充填注入皿にdechorionated卵を移す。 </li><li>針を準備し、2μL注入液で読み込みます。このソリューションでは、トレーサーまたは0.2 M KClの中のフェノールレッドローディング色素（0.1％w / v）のようchemoenzymatically 8とのAlexa Fluor ® 594 -デキストラン（5％w / v）のいずれかを合成したGDP - FucAl 20mMのが含まれています。ネガティブコントロールとして、注射液のGDP -フコースとGDP - FucAlを交換してください。 </li><li>針を破ると1 NL降下9を得るために射出圧力および持続時間を調整する。 </li><li>どちらのソリューションの1 NLと卵を注入する。 </li><li> E3胚の媒体が充填さアガロースコートしたペトリ皿に卵を移す。 </li><li> 28 ° Cで卵をインキュベートし、受精後3〜4時間以内に未受精卵を削除します。 </li></ol> 3。 BTTES - Cu系（I）触媒をクリックして化学反応<ol><li>胚は発達段階（例えば後期原腸胚、組織のセグメンテーションと早期の幼虫）、コート、アガロースと96ウェルプレートの基盤を求め達した時点で。 </li><li> 4μLのAlexa Fluor ® 488アジド（H 2 O、2.5 mMストックから）、2μLBTTES - 4 · 6時01分、複雑な、そしてミックスに軽く振る加え、次いで、各ウェルに92μLE3胚の培地を追加。 </li><li>よくファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを用いてクリックケミストリー試薬を含むに胚を移す。各ウェルは、5つの胚よりも少ないが含まれている必要があります。 </li><li>クリック反応3を開始するには2.5μL、新たに調製したアスコルビン酸ナトリウムを（H 2 O中の100mMのストックから）を追加します。各試薬の終濃度：のAlexa Fluor - 488アジ：100μM;のCuSO 4：50μM; BTTES：300μM、アスコルビン酸ナトリウム：2.5 mMの。 </li><li> 3分後、100μLE3の胚の培地で直ちに希釈して反応をクエンチするために、2μLバソクプロインスルホン酸（H 2 Oに50 mMストック）、生体適合性の銅キレート剤を加える。 </li><li>ガラスシャーレに胚を移し、15 mLのE3胚の培地で処理胚を2回洗浄する。 </li></ol> 4。イメージング<ol><li>マテックのガラス底マイクロウェル皿に超低融点アガロース（E3胚の培地では1.2％（w / v）の）の低下を置き、アガロースドロップに胚を置く。 </li><li>背側または横方向に胚を置き、アガロースドロップを固化するために氷上で5分間皿を置きます。それはアガロースドロップをカバーするまで、皿にそっとE3胚の培地を追加。 </li><li>蛍光と明視野の画像を順次共焦点顕微鏡を用いて取得されます。すべての胚の画像は、5μmのステップ間隔を使用して取得されます。複合数値は、ImageJのソフトウェアを用いて調製されています。 </li></ol> 5。代表的な結果図1は、私たちの二段階ラベリング戦略のワークフローを示しています。図2は、9.5時間後に受精（HPF）でBTTES介したCuAAC経由のゼブラフィッシュ胚のラベルを示しています。 BTTESは、トリス（トリアゾリルメチル）アミン系配位子です。それはその場生成される銅（I）との調整をするときに劇的にCuAAC加速、と明らかに毒性のな​​い生活システムで急速に付加環化反応を促進する。すぐに3分のクリック反応を以下、我々は、GDP - FucAl治療胚（図2、左のパネル）の堅牢なラベルを検出することができます。唯一のバックグラウンド蛍光は、GDP -フコース（図2、右側のパネル）にマイクロインジェクション制御の胚のために検出されます。 <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1ゼブラフィッシュ胚の包絡層にフコシル化糖鎖を標識する戦略。 <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。BTTES - Cu系（I）触媒クリックケミストリーを介してゼブラフィッシュ胚発生におけるフコシル化糖鎖のin vivoイメージング 。 1細胞期のゼブラフィッシュの胚は、GDP - FucAlの単回投与でマイクロインジェクションし、開発を許可されます9.5 HPFのop。胚はその後BTTES - Cu系（I）でのAlexa Fluor ® 488アジドの触媒と反応させる。反応胚は、共焦点顕微鏡を用いて画像化している。のAlexa Fluor ®蛍光488（上部パネル）の最大強度のz -投影画像、ブライトフィールド（下のパネル）。スケールバー：100μmである。 トラブルシューティング<table border="1"><tbody><tr><td>問題が</td><td>原因と</td><td>救済策</td></tr><tr><td>胚は不健康に見える</td><td>マイクロインジェクションのソリューションは、汚染物質が含まれています</td><td>ヌクレオチド糖の純度は85％以上でなければなりません。あなたのソースを確認してください。 </td></tr><tr><td>反応の後に表示は特にない</td><td>銅濃度は、以下の30μmである</td><td>銅の濃度が30μMのときに反応速度が著しく低下するとして、胚を追加する際に過剰E3胚の培地を加えることにより反応液を希釈しないように注意してください。 </td></tr><tr><td>胚は、反応後に死ぬ</td><td>胚の不適切な取り扱い</td><td>ピペットは、ファイアーポリッシュであり、反応容器を0.5％アガロースの非常に薄い層でコーティングされていることを確認します。 </td></tr><tr><td>画像がむらに見える</td><td>試薬は適切に胚を追加する前に混合されていません</td><td>試薬のほかの推奨順序に従ってください、とクリックケミストリー試薬が適切に胚を追加する前に混合されていることを確認してください。 </td></tr><tr><td>画像は、胚が損傷を受けている表示</td><td>反応中に激しく振盪損害胚</td><td>胚が溶液では1回、ゆっくりと10秒未満のために振る。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<ol><li>Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the glycome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).</li>
<li>Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+click+chemistry%3A+Covalent+labeling+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Qsar+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems.</a> Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).</li>
<li>Soriano del Amo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+copper%28I%29+catalysts+for+in+vivo+imaging+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).</li>
<li>Chang, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).</li>
<li>Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+membrane-associated+glycans+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish.</a> Science. 320, 664-667 (2008).</li>
<li>Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+enveloping+layer+glycans+during+zebrafish+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+synthesis+of+GDP-L-fucose+and+the+Lewis+X+glycan+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%2C+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

<p class="jove_content"&gt;イメージング生体分子<em&gt; in vivoで</em&gt;母国の環境でそれらの生物活性の重要な洞察を提供する。このビデオでは、我々はゼブラフィッシュ胚の包絡層におけるフコシル化糖鎖の標識がGDP - FucAlとBTTESを介した生体適合性CuAACを介して第二段階の蛍光団の共役による1細胞期胚をマイクロインジェクションすることによって実現される方法を示しています<sup&gt; 3</sup&gt;。堅牢な標識は、2〜3分以内に達成することができる、とラベルの付いた糖鎖は2.5 HPFには早くも検出可能である。重要なことは、GDP - FucAlの単回投与は、96 HPFまで検出可能なアルキンに依存した蛍光シグナルを得ることができる。同じアプローチは、2つの連続した​​CuAACを経由してゼブラフィッシュの開発にアルキンタグ付きfucosidesの人身売買を監視するために多色タイムラプスイメージングの実験に拡張することができます。しかし、ラベリングはクリックするだけで化学試薬の低い組織の浸透の深さに起因する胚盤の包絡層で実現されます。固定と透過性代謝GDP - FucAlで処理胚では、我々としてもインテリアの身体部分の...

<table border="1"><tbody><tr><td>試薬の名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td></tr><tr><td>硫酸銅（II）五水和物</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 203165 </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor ® 488アジド</td><td>インビトロジェン</td><td> A10266 </td></tr><tr><td>デキストラン、Alexa Fluor 594の</td><td>インビトロジェン</td><td> D - 22913 </td></tr><tr><td> （+）- L -アスコルビン酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A7631 </td></tr><tr><td> Bathocuproinedisulfonic酸</td><td>アクロスオーガニック</td><td> 164060010 </td></tr><tr><td>ガラス底マイクロウェル皿</td><td>マテック</td><td> P35G - 1.5 - 14 - C </td></tr></tbody></table>

代謝標識とbioorthogonalクリックケミストリーによるゼブラフィッシュ胚でのイメージンググリカン

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

in vivoでのイメージングの糖鎖は、最近、アジドまたはアルキンタグ付き単1、2細胞または生物を処理することにより、bioorthogonal化学レポーターの戦略を使用して有効になっている。糖鎖生合成機構によって処理される変更された単糖類は、細胞表面の複合糖質に組み込まれています。 bioorthogonalアジドまたはアルキンタグは、可視化用蛍光プローブと共有結合を許可する、または濃縮およびglycoproteomic分析のための親和性プローブ​​と。のエンベロープ層のフコシル化糖鎖を標識する）GDP - 5 - alkynylfucose（GDP - FucAl）、2と1細胞期胚の1）マイクロインジェクション：このプロトコルは、一般的に含むゼブラフィッシュ胚におけるフコシル化糖鎖の非侵襲的イメージングに使用する手順について説明します。共焦点顕微鏡3で生体適合性銅（I）触媒によるアジド-アルキン付加環（CuAAC）、及び3）イメージングを経由してアジド共役フルオロフォアとゼブラフィッシュ胚。方法は、ここで説明容易にゼブラフィッシュを開発する際に、他の生物において、糖鎖、シアル酸4とN -アセチルガラクトサミン5を含むなどの糖鎖、6の他のクラスを可視化するために拡張することができます。

ゼブラフィッシュ胚におけるアルキンタグ付き糖鎖の迅速、非侵襲的、および堅牢なラベリングを可能にするクリックケミストリーベースの方法が記載されている。後期原腸形成の段階におけるゼブラフィッシュ胚の包絡層におけるフコシル化糖鎖は、本研究では画像化した。

代謝標識とBioorthogonalクリックケミストリーによるゼブラフィッシュ胚でのイメージンググリカン

生体内の糖鎖をイメージングすることは、アジド基または...を含む化学リポーターを用いて細胞や個体を処理するバイオ直交化学リポーター戦略により、近年可能となりました。

近年の生体内（in vivo）での糖鎖イメージングの実証では、アルキンまたはアジドでタグ付けされた単糖を用いて細胞や生物体を処理するバイオ直交化学リポーター戦略が用いられています。糖鎖生合成系によって処理された修飾単糖は、細胞表面の糖接合体にバイオ直交アルキンまたはアジドタグとして取り込まれます。これにより、可視化のための蛍光プローブや、濃縮および糖プロテオーム解析のためのアフィニティプローブとの共有結合による接合が可能になります。このクリックケミストリーに基づいた手法により、ゼブラフィッシュ胚におけるアルキンまたはアジド検出糖鎖の迅速、非侵襲的かつ堅牢な標識が可能となり、さらに発生中の生物における他のクラスの糖鎖の可視化にも容易に拡張できます。レクチンや抗体を用いた糖鎖検出法などの既存の手法に対する本技術の主な利点は、ダイナミックなin vivoイメージングに適用できる点にあります。レクチンや抗体を用いたイメージング法では、ある特定の時点における糖鎖のスナップショットしか得られません。これらは動的な研究においては導入が困難です。さらに、レクチンや抗体を用いて糖鎖を標識する場合、目的の細胞や組織を本来の環境から取り出し、解析前に固定する必要があります。対照的に、バイオ直交化学リポーター戦略を用いて糖鎖を標識すれば、これらの制限を克服でき、ゼブラフィッシュ胚やC. elegans胚などの生体システムにおける糖鎖の非侵襲的なイメージングに直接的に適用することが可能です。Clickケミストリーの生体適合版であるBTT Es媒介Azide-Alkyne環化付加反応を用いることで、1～5分以内に堅牢な標識を行うことができます。本手順の詳細は、当研究室のデータに基づいています。まず、ゼブラフィッシュの卵を35 mmのペトリ皿に回収し、移します。可能な限り水を取り除いた後、絨毛膜を消化させるために、胚培養液で調製した1 mg/mLのpronase Eを加えます。3～5分後、絨毛膜に気泡が生じ始めたら、皿を魚用水で満たしたビーカーに浸します。卵を水の中に落とし込むようにして、ゆっくりとビーカーへ移します。魚の飼育水で十分に卵をすすぎ、ほとんどの卵が卵膜から外れるようにします。次に、火で先端を丸めたピペットを用いて、コーティングされた卵をアガロースコーティング済みのE3胚培養液を満たしたシャーレに移します。準備した注入用シャーレにE3胚培養液を満たし、コーティングされた卵を移します。次に、ニードルを準備し、20 mM GDP Fuk allと、トレーサーとしての5%lorまたは5 94 dextrin、あるいは陰性対照としての0.2 M 塩化カリウム中の0.1% フェニルレッド ローディング染料を含む注入溶液を 2 µL 装填します。注入溶液中の GDP FUCA を GDP

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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ゼブラフィッシュの化学スクリーンのための自動化された画像と解析の開発。

初期胚を形成する形態形成のプロセスを理解するための鍵は、高解像度での画像セルにできることです。ここでは、細胞膜をターゲットとする緑色蛍光タンパク質で全体のゼブラフィッシュの胚では細胞の単一細胞または小さなクラスターを標識するためのテクニックを説明します。...

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