Name: の高分解能3次元イメージング生体外生物試料 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学ぶX線マイクロCTによる生体外3次元イメージング手法。マウスの大腿骨やラットの肺など、鉱化・非鉱化組織の高分解能可視化を実現し、組織構造と病理学的洞察を提供します。

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研究は、アーヴィングと科学のワイツマン研究所のナノとバイオナノイメージングのためのChernaモスコウィッツセンターで実施されました。 我々は、このプロトコルの設計と実行の援助の彼女Orna Yegerに感謝しています。

1。サンプルの準備<ol><li>検討する組織を抽出した後、石灰化組織は、楽器に配置して撮像することができます。画像にマウスの大腿骨1つは、次の手順に従ってください。 <ol><li> C57/BL6胚18.5日postceutus（E18.5）から死後の足を投稿取り外します。 </li><li>エポキシ樹脂または他の接着剤を使用して、ポリスチレンのピペットチップ（20〜200μl）の狭い方の端をシールし、作業バッファ（PBSまたは他の）で先端を埋める。 </li><li>しっかりと先端に足にフィットし、パラフィルムのシートを持つもう一方の端をシール。 </li><li>適当なホルダーにピペットチップを置き、第3章からプロトコルに従ってください。マウスの足の胚から大腿骨を可視化するため、楽器は40 KV、200μAを設定されています。 8μ解決のために4倍1000投影画像は、取得する必要があります。 </li></ol></li><li>非石灰化組織は、8,9、多くの利用可能なプロトコルのいずれかを使用して目的の組織のX線の減衰量を増加させるために、最初に固定して染色する必要があります。ラットの肺と同じようなサンプルについては、準備のプロトコルは、次のとおりです。 <ol><li>ヌードラットの肺の非小細胞肺癌（NSCLC）NCI - H460のOrthotopical注入</li><li>肺癌の結節は、移植から4週間に検出され始める</li><li>ラットを犠牲にし、直ちにヘパリンと混合生理食塩水でそれを吹き込む</li><li>気管支循環を染色するために左心室にMicrofil（Flowtech）の希釈溶液、（化合物の溶液2 ml、希釈剤と硬化剤0.3mlを3mlの）のにそれを注入する</li><li>ラットの肺と心臓を抽出</li><li> 50 mlのプラスチック製の試験管にしっかりとフィットして、サンプルを（プロトコルの第2章を参照）固定化</li><li>チューブの底にエタノールで減衰布を配置することにより、飽和エタノールの大気を作成する</li><li>楽器のホルダーに接着剤やスクリュー管</li><li>イメージングパラメータを（3章）の設定に進みます。ラットの肺の完全なイメージングのためのソースは、40KV、100μAに設定されています。 16μ解像度を達成するために、ひとつは0.5倍の倍率で2500投影画像を取得する必要があります。 </li></ol></li></ol> 2。サンプルの固定化高分解能で、測定時の試料位置の変化を避けることが大切です。このため、サンプルはしっかりとそのサイズに合うプラスチックの受信者に固定されています。ポリスチレンのピペットチップ、プラスチック製パスツールピペットまたは特別に作られたプラスチック製のホルダーはこの点で使用されています。実験的な要件によると、試料は空気中で調べることができますまたはエタノールまたは緩衝溶液に浸漬。典型的な固定化と楽器のマウス胚の脚部の最終的な位置決めは、図1に示されています。 <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。マイクロCT測定器で、マウス胎児の足の最終的な位置決め。 3。取得パラメータを設定する：X線の電圧と電流、CCDの露光時間<ol><li>ホルダーに入れ、試料は測定器の回転ステージに置かれている</li><li>最初のX線画像は、電圧と電流を任意に設定して取得されます。 </li><li>画像が暗すぎる場合は、1つは、最初の光子の数を増やす必要がありますので、電流が少し増加する。これが十分でない場合、一つはX線管の電圧、すなわち、わずかにX線光子のエネルギーを増やす必要があります。 </li><li>画像が明るすぎる場合は、まず、電圧、電流を小さくする必要があります。 </li><li>画像の明るさは、ビニング増加させることができる。 2のビニングでは2x2のピクセルの各行列の和をとるのに対し、1のビニングでは、考慮に画像の各ピクセルの輝度を取ります。画像はビニング1の場合と比べて約4倍明るくなりますが、半分の解像度を持つことになります。 </li><li>最適な明るさを設定した後、その人が側に最高のコントラストと別の側の実験の合理的な期間の間に妥協するカメラの露光時間を最適化する必要があります。 </li><li>特に低吸収サンプルの画像、、のコントラストは、主に低エネルギーの光子のこと、光子束を低減するフィルタを、使用することによって改善することができます。 </li></ol> 4。サンプルの位置決め<ol><li>作業倍率を選択します。可能な選択肢は、0.5倍4倍、10倍、20倍と40倍です。ビューのフィールドには、増加倍率で減少する。 </li><li> X線源と試料の間に、サンプルと検出器間の距離を設定して、ビューの最適な解像度とフィールドを取得します。サンプル距離にソースを大きくすると、ビューのフィールドを減少させ、分解能を向上させます。検出器の距離にサンプルが逆の効果が得られます。 </li></ol> 3Dで見ることが全体のフィールドは、に存在する必要があります全画角で投影像。一つは、異なる角度で試料を回転させることによって、回転軸にできるだけ近いサンプルを持って来ることによって、これを確認する必要があります。このため、一つには、次の手順に従う必要があります。 <ol start="3"><li> 0度で画像を撮影し、-20℃でサンプルを回転させる。目的のボリュームが横方向にずれている場合、片方が回転軸を再配置することによって、位置を修正する必要があります。 </li><li>補正後は、サンプルは別の角度で回転させることで、興味のある分野は、-90から90度までのすべての角度で画像の内側になるまでの位置は、再び修正。 </li></ol> 5。高分解能の断層像<ol><li>測定中、試料は一度に小さな角度によって、それぞれの角度one投影画像で回転が行われます。画像の総数は常に片側に目的の解像度と別の側面で測定し、ファイルのサイズの時間との兼ね合いで決まります。図2に示すように、一つ一つの突起は別の上の1つを重ね合わせ、サンプル中のすべてのスライスが含まれ、したがって、試料の3次元構造を明らかにすることはできません。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 0 °（）、45 °（B）と90 °（C）の回転角度でのラットの肺の投影画像。 <ol start="2"><li>唯一の少なくとも-90から90度の間で投影画像を撮影した後、一つは、サンプルボリュームの再構築に進むことができます。再建には、使用するソフトウェアのおよび予測の数の応じて、10分、2時間かかります。再び、3D画像の最終的な品質は、目的の解像度と一費やすしたい時間と結果のファイルのサイズとの兼ね合いで決まります。 </li></ol> 6。画像スケールのキャリブレーション再構成画像のピクセルのレベル（値）は、その画像に対して一意です。つの異なる画像を比較するために、独自の輝度スケールは、各画像に課されなければならない。このため<ol><li>サンプルと同じ実験条件を使用して、標準ファントムによる断層撮影を実行します。 </li><li>ファントムについて得られた値を使用してサンプル画像をキャリブレーション。最も一般的なスケールはハンスフィールド（またはCT）のスケールです。 4倍の場合は15,000（水またはPBS用）のバックグラウンドの値を0に置き換えられ、骨のための35,000の最大値が3000の標準のハンスフィールド値で置き換えられました。他のピクセル値は、それらの制限に基づいて線形補間または外挿に起因する。 </li></ol> 7。画像処理と解析高解像度の画像を取得した後、一つは画像解析ソフトウェアを使用して関連情報を抽出する必要があります。使用するソフトウェアパッケージは、非常に大きなファイル（最大20Gbのまで）で動作するように設計する必要があります。 8。代表的な結果胎生18.5（E18.5）のC57/BL6マウスからの大腿骨の表現 - 四日間鉱化プロセスの開始後は、図3に示します。鉱物層は軟組織がこの準備に表示されなくなってから、（白）はっきりと見える。我々は4倍の線形倍率で1000投影画像を取った。最終的な分解能は8ミクロンです。図1に示すようにボリュームレンダリングの慎重な分析は、骨の体積分率（石灰化組織によって占有されている骨の体積の割合）が0.18であることを示しており、骨密度は、723ミリグラム/ cm 3である。これらの値は、私たちは開発の他の段階にある骨で、この構造体を比較することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。マウスの大腿骨の胚の3D画像の別の表現。横（断面）は（A）、矢状（メディオ横ずれ）セクション（B）とボリュームレンダリング（C）のスナップショットが表示されます。 図4は、非小細胞肺癌（NSCLC）NCI - H460との同所移植した12週齢の雌のヌードラット（RNU）、、の肺の3次元画像を示しています。 2500投影画像は、16ミクロンの最終的な分解能を確保する、0.5倍の線形倍率で撮影された。画像は、（ダウン20ミクロンの直径の）Microfilステンド血管を示しています。画像解析の4週間注入した後、複数の癌結節が形成されていることを示しています。彼らは、肺気量（17％）のかなりの部分を覆っている。肺染色のほとんどは、腫瘍の周辺部で発見された。著しく、図4Bに示すように、いくつかの血管がそのボリュームの約3％の予備的分析によれば、カバー、結節の内部にも存在しています。 <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4ラットに成長する癌結節の三次元画像肺。ボリュームレンダリング（）と体積の断面（B）のスナップショットが表示されます。癌の結​​節は、矢印でマークされます。 映画は1。図1のマウスの大腿骨のボリュームレンダリングが。 <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie1.mpg">映画を鑑賞するためにはここをクリックしてください。</a> 図2のラット肺の2。ボリュームレンダリングムービーが 。 <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie2.mpg">映画を鑑賞するためにはここをクリックしてください。</a> 映画（3）肺を介してシリアルセクション。結節は、スライスの大部分のグレーの領域として表示されます。 <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie3.mpeg">映画を見て、ここをクリックしてください。</a>

<ol><li>Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+micro-CT+in+small+animal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Application of micro-CT in small animal imaging.</a> Methods. 50, 2-13 (2010).</li>
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<li>Endo, M., Komatsu, S., Kandatsu, S., Yashiro, T., Baba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combination-weighted+Feldkamp-based+reconstruction+algorithm+for+cone-beam+CT%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">A combination-weighted Feldkamp-based reconstruction algorithm for cone-beam CT.</a> Phys. Med. Biol. 51, 3953-3965 (2006).</li>
<li>Marxen, M., Thornton, M. M., Chiarot, C. B., Klement, G., Koprivnikar, J., Sled, J. G., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+scanner+performance+and+considerations+for+vascular+specimen+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging.</a> Med Phys. 31, 305-313 (2004).</li>
<li>Plouraboué, F., Cloetens, P., Fonta, C., Steyer, A., Lauwers, F., Marc-Vergnes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+high-resolution+vascular+network+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">X-ray high-resolution vascular network imaging.</a> J Microsc. 215, 139-148 (2004).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

胎生18.5（E18.5）のC57/BL6マウスは、4日間の鉱化のプロセスの開始後です。開発のこの段階で、将来の骨は、明らかに図3に見られるように、石灰化osteoidsの多くのレイヤーで構成されています。この時点で、一つは鉱化組織が少なくサンプルの処理を必要とするさまざまな楽器と低い解像度で可視化できることを強調してください。より高い分解能を提供するだけでなく現在のプロトコルは（とそれに使用されるマイクロCT機器）、測定のための最善の幾何学的パラメータを選択するため、最高の柔軟性を提供しています。 図4の結果は、同所性肺癌の動物モデルにおいて、ヒト非小細胞肺がんは、血管と血管新生の募集を誘導できることを示している。我々は、肺組織はどちらも移動されなかったことを考慮し、またその形状は、測定中に変更されています。ユーザーは、断層撮影中にこのような変更を避けるために、特別な予防策を講じる必要があります。一部のサンプルについては、特に柔らかい組織のために、一つは、測定中に完全に試料を固定する特殊な保持装置を構築する必要があります。残念なことに腫瘍の周囲に造影剤の高い漏れの存在は、末梢血管の信頼性の定量化を防いだ。その結果、画像ははっきりとムービー2と3に存在する、特に端でいくつかの染色剤によって汚染されます。我々は、この流出を防ぐことができなかったが、その大きさ、形状及び内部の血管の存在を含む癌の結節、に関する有用な情報には影響しませんでした。私たちは、明らかに腫瘍の内部にもいくつかの血流が存在して、少なくともここで検討した気管支循環のために、末梢血液の供給が腫瘍血流に関与すると結論付けている可能性があります。

画像取得のために我々はマイクロXCT - 400 Xradia、コンコード、米国で生産さmicrofocussed X線断層撮影システムを使用している。 画像が処理すると、ImageJ（NIH、米国）、Avizo（VSG、フランス）とMicroView（ゼネラルエレクトリック、米国）のソフトウェアパッケージを用いて分析した。使用可能な任意の画像解析ソフトを代わりに使用することができます

の高分解能3次元イメージング生体外</emマイクロctによる>生物試料

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

非破壊ボリュームの可視化は、最も効率的ではX線マイクロコンピュータ断層撮影（μCT）となっている断層の技術によって達成することができます。 高解像度μCTは、ex - vivoで生体試料1、2の3次元検査のための非常に多目的な、まだ正確な（分解能1〜2ミクロン）技術です。電子線トモグラフィーとは対照的に、μCTは4cm厚さのサンプルまでの検査が可能になります。組織の週に比べてこの手法は、測定のわずか数時間を必要とします。さらに、μCTは、2D stereologicモデルに依存しないので、それは補完可能性があり、いくつかのケースでも、両方の時間がかかり、破壊的な組織学的方法3、4を 、置き換えることができます。 μCTでサンプル調整と位置決めが簡単ですし、逆に構造に影響を及ぼす可能性のある高真空や低温を必要としません。サンプルが配置され、シンチレータと正確なCCDカメラを含むmicrofocused X線源と検出器の間に180 °または360 °回転させ、それぞれの角度は2次元画像が取得されますし、ボリューム全体が1つを使用して再構築さ​​れています別の使用可能なアルゴリズム5-7。 3D分解能は回転ステップの減少と共に増加する。現在のビデオプロトコルは、高解像度でのイメージングに続いて、サンプルの準備、固定化とポジショニングの主要なステップを示します。

非破壊ボリュームの可視化は、最も効率的ではX線マイクロコンピュータ断層撮影（CT）となっている断層の技術によって達成することができます。

の高分解能3次元イメージング生体外</emマイクロCTによる>生物試料

非破壊的な体積可視化はトモグラフィー技術によってのみ達成可能であり、その中で最も効率的な手法がX線マイクロコンピューター断層撮影（X線マイクロCT）です。

この手順の全体的な目的は、石灰化組織および非石灰化組織の3次元X線マイクロトモグラフィーを行うことです。まず、検査対象となるサンプルを採取し、次にマイクロCT装置内でサンプルを固定し、位置合わせを行います。手順の第3ステップでは、各サンプルの収集パラメータを設定し、画像を収集します。最終的に、X線CTによりサンプルの高解像度3D画像が得られます。MRI、超音波、または電子顕微鏡などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、1 µmの解像度でダニの体積に関する情報を提供できることです。この手法は、多くの生物学的組織における知見を得るために利用可能です。また、電子工学、材料科学、および考古学においても活用できます。作製方法は、石灰化組織と非石灰化組織で異なります。石灰化組織は、サンプルの位置が変わらないよう、密閉容器に封入する必要があります。高解像度測定を行う際、容器の形状は組織の形態に合わせて変更されます。例えば、胚齢18.5日のマウス大腿骨は、ピペットチップに収まるサイズです。まず、ポリスチレン製ピペットチップの先端の狭い部分を、エポキシ樹脂などの接着剤で密封します。次に、チップ内を作業バッファーで満たします。この場合、PBSを用いて、大腿骨を露出させた脚をチップにしっかりと固定します。ピペットチップを適切なホルダーに設置し、もう一方の端をパラフィルムで密封します。付属の原稿に記載されている手順に従って、動物を犠牲にし、灌流を行います。その後、染色された肺と心臓を摘出し、あらかじめ用意した50 milliliterの試験管に移します。摘出した臓器を乾いた紙の上に置きます。最終測定用の試験管にサンプルを入れ、試験管の底部にエタノールで湿らせた布を敷きます。エタノールで飽和した環境を作るため、サンプルはチューブ内でしっかりと固定されている必要があります。サンプルに緩みがある場合は、ワイヤーで締め付け、布の直上のチューブ底部付近で固定してください。次に、チューブを装置のホルダーに接着またはネジで固定し、画像取得パラメータの設定に進みます。まず、サンプルホルダーを装置の回転ステージに設置します。次に、電圧と電流に任意に選択した値を設定し、X線画像を撮影します。画像が暗すぎる場合は、まず光子数を段階的に増やして調整してください。これは、電流を段階的に増加させることで行います。電流を 200 microamps まで上げても画像が明るくならない場合は、電圧を上げてX線光子のエネルギーをわずかに段階的に増加させます。画像が明るすぎる場合は、まず電圧を下げ、次に画像が適切になるまで電流を下げます。Binningは、解像度を犠牲にして画像の明るさを上げるためにも使用できます。Binning値を2に設定すると、解像度は半分になりますが、画像は約4倍明るくなります。最適な明るさを設定した後、妥当な実験時間内で得られる最高のコントラストとの妥協点を見極め、カメラの露光時間を最適化してください。特に吸収率の高い試料の場合、フィルターを用いて低エネルギー光子のフラックスを低減させることで、画像のコントラストを改善できます。次に、作動倍率を 0.5 x から 40 x の間で選択し、解像度を最大にしつつ、試料全体が含まれるように視野を調整します。解像度を高めるには、X線源を試料に近づけてください。視野を広げるには、検出器をサンプルに近づけて配置します。3Dイメージングの場合、サンプルがいかなる回転角度においても視野内に収まる必要があるため、回転軸を中央に合わせなければなりません。まず、サンプルをマイナス20度に回転させることから始めてください。目的の領域が横方向にずれている場合は、回転軸を再調整してください。さらに回転させて画像撮影を行い、サンプルが-90度から+90度まで完全に視認できるまで補正を繰り返した後、-90度から90度のすべての角度で測定を行います。イメージングプログラムの実行には時間がかかる場合があるため、余裕を持って計画してください。例えば、大腿骨を4倍の倍率、8 µmの分解能で撮像する場合、1,000枚の投影画像が必要となります。これにはわずか3時間しかかかりません。しかし、ラットの肺を0.5倍の倍率、16 µmの分解能で視覚化するために必要な2,500枚の投影画像を収集するには、10時間かかります。将来的な画像比較を行うためには、骨および水に近いX線吸収特性を持つ人工材料で製作された標準ファントムを、同一の実験条件下で撮影し、画像を校正する必要があります。サンプルについては、すべての投影画像を記録した後、全ボリュームを再構成します。再構成された画像をファントムの値に校正するには、ハウンズフィールド単位（CT値スケール）を使用してください。例えば、Forex倍率では、ファントム内の水のような値は0に設定され、骨のような値はこの範囲から3000に設定されます。それ以外のすべての値は、補間または外挿されます。これにより、フリーウェアのImageJやFijiなど、20ギガバイトのファイルをサポートできる任意のソフトウェアパッケージを使用して画像を解析することが可能になります。このボリュームレンダリングは、骨の石灰化開始から4日後のマウスの大腿骨を示しています。石灰化分率は18%と算出され、骨密度を他の発達段階の骨と比較することが可能です。12週齢の雌ヌードラットの肺のこの断層撮影ボリュームレンダリングは、16 µmの分解能で描写されています。肺の染色により、直径20 µmの血管が可視化されています。同一の肺を用いたこの連続切片解析では、腫瘍細胞の移植から4週間以内に、複数の癌結節が灰色の塊として観察されます。これらの肺において、結節は肺体積の17%を占めるまで成長しました。肺の染色は、主に腫瘍の周辺領域で認められました。また、結節内部には血管が存在し、その体積の約3%を占めています。適切に実施し習得すれば、サンプルのポジショニングは15〜20分で完了させることができます。自動ボリューム再構成を含むイメージング時間は、通常オペレーターの立ち会いを必要としませんが、サンプルによって異なり、最大で50時間かかる場合があります。固定剤や染色剤の取り扱いは非常に危険であることに留意してください。常にラボ用手袋を着用し、サンプルからの蒸気を吸い込まないようにしてください。

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