の高分解能3次元イメージング生体外生物試料

非破壊ボリュームの可視化は、最も効率的ではX線マイクロコンピュータ断層撮影（CT）となっている断層の技術によって達成することができます。

この手順の全体的な目標は、石灰化組織と非石灰化組織の3D X線マイクロトモグラフィーを実行することです。これは、最初に検査するサンプルを抽出し、次にサンプルをマイクロCT装置に固定して配置することによって達成されます。手順の3番目のステップは、各サンプルの取得パラメータを設定し、画像を収集することです。

最終的には、X線CTにより、サンプルの3D画像を高解像度で取得します。MRI、超音波、電子顕微鏡などの既存の方法論のこの技術の主な利点は、1ミクロンの解像度でダニの量に関する情報を提供することです。また、エレクトロニクス、材料科学、考古学にも使用できます。

調製は、石灰化組織と非石灰化組織で異なります。鉱化組織は、サンプルの位置が変わらないように、しっかりとフィットする容器に密封する必要があります。高解像度の測定が行われますが、容器の形状は組織の形態によって異なります。

例えば、18.5Dの古い胚から抽出したマウスの大腿骨は、ピペットの先端に収まります。まず、ポリスチレン製のピペットチップの狭い方の端をエポキシ樹脂のような接着剤で密封します。次に、先端に作業バッファーを入れます。

この場合、PBSは、大腿骨が露出した脚を先端にしっかりとフィットさせ、ピペットの先端を適切なホルダーに入れ、もう一方の端をパラフィルムシートの犠牲で密封し、添付の原稿に概説されているように動物を灌流します。次に、染色された肺と心臓を取り出し、準備した50ミリリットルの試験管に移します。臓器を乾いた紙の上に置きます。

試験管の底にある最終測定試験管にサンプルを入れ、エタノール湿布です。エタノール飽和環境を作り出すには、サンプルがチューブ内にしっかりと収まる必要があります。サンプルが緩んでいる場合は、ワイヤーで締め、チューブの底部、布のすぐ上に

次に、チューブを機器のホルダーに接着またはねじ込み、画像の設定に進みます。取得パラメータ。まず、サンプルホルダーを装置の回転ステージに置きます。

次に、電圧と電流の任意の値を使用して、X線画像を撮ります。画像が暗すぎる場合。まず、フォトンの数を徐々に増やして変更を加えます。

これは、電流を徐々に増加させることによって行われます。電流を200マイクロアンペアに増やしても画像が明るくならない場合は、電圧を上げてX線光子のエネルギーを少しずつ増やします。画像が明るすぎる場合は、まず電圧を下げ、次に画像が満足のいくものになるまで電流を減らします。

ベニングは、解像度を犠牲にして画像の明るさを上げるためにも使用できます。イニング値を 2 にすると、解像度が半分の画像で約 4 倍明るくなります。最適な明るさを設定した後、カメラの露光時間を最適化して、得られる最高のコントラストと妥当な実験時間の間で妥協します。

画像のコントラストは、特に吸収率の高いサンプルの場合、フィルターを使用して低エネルギーの光子束を減らすことで改善できます。次に、0.5倍から40倍までの作業倍率を選択し、解像度を最大化しながらサンプル全体を包み込むように視野を合わせます。解像度を上げるには、X線源をサンプルの近くに置きます。

視野を広げるには、検出器をサンプルの近くに配置します。3Dイメージングの場合、サンプルは任意の回転角度で視野内に収まる必要があるため、回転軸を中央に配置する必要があります。まず、サンプルをマイナス20度に回転させます。

目的のボリュームが横方向にシフトした場合は、回転軸を再配置します。さらに回転させて画像の撮影を進め、サンプルが負の90度から正の90度まで完全に見えるまで補正を続け、その後、負の90度から90度までのすべての角度で測定を進めます。イメージングプログラムの実行には時間がかかる場合があるため、それに応じて計画を立ててください。

たとえば、8ミクロンの解像度で外国為替倍率で最も多くの大腿骨を画像化するには、1000枚の投影画像が必要です。これが完了するまでに3時間しかかかりません。しかし、0.5倍の拡大率と16ミクロンの解像度でラットの肺を視覚化するために必要な2, 500の投影画像を収集するには10時間かかります。

将来の画像比較のためには、骨様X線吸収と水様X線吸収を持つ人工材料で作られた標準的なファントムを同じ実験条件下で撮影し、画像をキャリブレーションする必要があります。サンプルは、すべての投影画像を記録した後、フルボリュームを再構築します。再構築された画像をファントムの値にキャリブレーションするには、ハウンドフィールドまたはCTスケールを使用します。

たとえば、外国為替倍率では、ファントムの水のような値はゼロに設定され、骨のような値はこの範囲から3000に設定されます。他のすべての値は補間または外挿されます。イメージは、フリーウェアのイメージJやフィジーなど、20ギガバイトのファイルをサポートできる任意のソフトウェアパッケージを使用して分析できるようになりました。

このボリュームレンダリングは、骨の石灰化が開始された4日後のマウスの大腿骨を示しており、18%で計算された石灰化画分と骨ミネラル密度は、他の発達段階の骨と比較できます。この断層撮影による 12 週齢の雌のヌードラットの肺のボリュームレンダリングは、16 ミクロンに分解されます。肺染色は、直径20ミクロンの血管を明らかにするために使用されます。

このシリアルセクションでは、同じ肺の分析を行います。複数のがん結節は、腫瘍細胞を移植してから4週間以内に灰色の固体形状として見られることがあります。これらの肺では、結節が肺の体積の17%を占めるまでに成長しました。

肺染色の大部分は腫瘍の末梢領域に認められた。結節の内部には血管も存在し、結節の体積の約3%を覆っています。一度習得すると、適切に実行されれば、サンプルの位置決めは15〜20分で行うことができます。

自動ボリューム再構成を含むイメージング時間は、通常、手術者の立ち会いを必要とせず、サンプルによって異なり、50時間ほどかかる場合があります。固定剤や染色剤の取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。常に実験用手袋を着用し、サンプルからの蒸気を吸い込まないようにしてください。