マイクロボリュームバイオスペックナノ分光光度計を用いて核酸およびタンパク質の濃度測定
2011年2月17日
この通信は、dsDNAとタンパク質定量用BioSpec -ナノUV - VIS分光光度計の精度と再現性に関するデータを提示。自動拭き取り機能は、より正確な結果を得るために最小のキャリーオーバーのスループットと結果を改善しながらであっても、超小型のボリューム（1〜2リットル）で、再現性は、優れています。
この手順の目的は、マイクロボリューム分光光度計を用いて、核酸およびタンパク質の濃度を正確かつ再現性高く測定することです。まず、測定する試料に適した光路長を選択します。次に、ブランク測定を行います。
次に、DNAまたはタンパク質サンプルを測定します。手順の最終ステップは、データをPDFまたはCSV形式で保存することです。これにより、最終的にDNAおよびタンパク質の再現性の高い結果が得られます。
本手法により、迅速かつ正確に定量を行うことができます。この技術の主な利点は、迅速で精密であり、再現性が高いことです。DNA定量の操作を開始するには、BIOS spec nano分光光度計の電源を入れてください。
PCのデスクトップからBIOS spec nanoソフトウェアを開きます。「simple nucleic acid D-S-D-N-A」タブをクリックしてください。ソフトウェアが装置との通信を確立し、初期化シーケンスを実行します。
これにより、装置が仕様通りに動作していることが確認されます。次に、光路長を選択します。光路長のスライダーを使用してください。
マイクロリットル容量のサンプルには3つのオプションが用意されています。0.2 mmまたは0.7 mmが使用可能です。また、希釈サンプルには、光路長5 mmのキュベットを使用するオプションがあります。
このデモンストレーションでは、2 µLのサンプルを測定するために0.7 mmを選択します。すべての計算は、選択した光路長に基づいています。次に、ソフトウェアのセットアップタブをクリックし、オートワイピング設定を選択します。
1回拭き取り用に1枚選択します。サンプル測定前、または新しい光路長を選択するたびに、ブランク測定が必要です。0.7 millimeterの光路長の場合、2 µLの水またはバッファーをペデスタル上に分注します。[blank]をクリックしてブランク測定を行います。
上部ウィンドウが移動してサンプル液滴に接触し、キセノンランプのフラッシュが確認されます。測定が完了すると、ワイパーが自動的にサンプルを拭き取ります。これでサンプルの測定が可能です。
粒子状の未溶解物が存在すると再現性のないデータが得られるため、均質なサンプル溶液を使用することが重要です。気泡の混入を防ぐため、サンプルの2 µLを慎重に吸引し、ピペットチップからペデスタル上に均一に分注してください。
装置のスタートボタンを押します。先ほどと同様に、上部ウィンドウが移動してサンプル液滴に接触します。キセノンフラッシュが観察されることで、再現性が確認されます。同一サンプルを3回繰り返し測定し、記録されたすべてのデータは自動的にBUDファイルとして保存されます。PDFまたはCSVファイルとして保存するには、[save P-D-F-C-S-V]をクリックしてください。
保存タブで適切な項目を選択することで、結果をCSVファイルとして保存することも可能です。タンパク質定量は、吸光度280nm法を用いて行うことができます。タンパク質定量を行うには、タンパク質定量タブを選択してください。
消衰係数 ε₂₈₀ が既知の場合は入力してください。ε₂₈₀ が不明な場合は、「Epsilon two 80 calc」を使用して算出します。パス長スライダーで 0.2 mm を選択し、3 µL のサンプルを測定します。次に、ソフトウェアの「setup」タブをクリックし、「auto wiping setup」を選択します。サンプルのキャリーオーバーを防ぎ、正確な測定値を確保するため、「2」を選択して2回のワイプ操作を行います。
ピペットのブランク測定を行うには、3 µLの水または緩衝液を台座に分注し、ブランク測定用の「blank」をクリックします。次に、3 µLのタンパク質サンプルを注意深く台座に分注します。気泡が入らないように注意しながら、ソフトウェアの「start」をクリックするか、装置のスタートボタンを押してサンプルの測定を開始します。
再現性を確認するため、同一サンプルの測定を3回繰り返します。以下は、典型的な2本鎖DNAサンプルの測定データです。DNA濃度を算出するために使用される計算式は、「サンプル濃度 ＝ DF × (OD 260 − OD 320) × NACF」であり、ここでDFはサンプル希釈倍率、NACFは核酸濃度係数を指します。
核酸濃度係数は、選択した分析物に応じて設定されます。算出された核酸濃度および OD 260/280 比が表示されます。この表には、DNA定量に関する再現性試験の結果が含まれています。
これらのデータは合わせて、相対標準偏差が0.26%と低いことから、結果の再現性が非常に高いことを示しています。ここでは、BSAのタンパク質濃度分析の代表的な結果を示します。1mLあたりのマイクログラム単位のタンパク質濃度は、Epsilon 280値に基づいています。最後に、この表はタンパク質定量化の再現性分析を示しています。
0.51%という相対標準偏差は、BIOS spec nanoがDNAだけでなくタンパク質に対しても正確にOD値を測定できることを示しています。習熟すれば、1分間で複数のサンプルを分析することが可能です。
概要
本研究では、dsDNAおよびタンパク質の定量におけるBioSpec-nano UV-VIS分光光度計の正確性と再現性を評価します。この手法は、極微量のサンプル量であっても優れた再現性を示し、キャリーオーバーを最小限に抑えながらスループットを向上させます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 生物化学
- 分析化学
- バイオテクノロジー
背景
- 核酸およびタンパク質の正確な定量は、生物学的研究において極めて重要です。
- マイクロボリューム分光光度法により、最小限のサンプル量での分析が可能になります。
- 自動化機能により、測定の効率性と精度を向上させることができます。
- 信頼性の高い実験結果を得るためには、再現性が不可欠です。
研究目的
- 核酸およびタンパク質の定量におけるBioSpec-nano分光光度計の性能を評価すること。
- 少量のサンプル量を用いて正確な測定を行うためのプロトコルを確立すること。
- 繰り返し測定を通じて、結果の信頼性を実証すること。
使用した手法
- 試料測定に適した光路長の選択。
- 試料分析前のブランク測定。
- 試料間のキャリーオーバーを防ぐための自動ワイピング。
- 後続の解析のためのPDFまたはCSV形式でのデータ保存。
主な結果
- 相対標準偏差0.26%という、DNA定量における極めて高い再現性を得た。
- タンパク質定量においても、相対標準偏差0.51%という高い精度を示した。
- BioSpec-nanoを用いることで、迅速かつ精密な測定が可能である。
- 多数のサンプルを迅速に分析でき、スループットを向上させることができる。
結論
- BioSpec-nano分光光度計は、dsDNAおよびタンパク質の両方に対して信頼性の高い定量分析を可能にします。
- 自動化機能により、測定効率が大幅に向上します。
- 本手法は、生物学的研究におけるハイスループットなアプリケーションに適しています。
よくある質問
産業界における重要性
核酸およびタンパク質の正確で再現性のある定量は、初期創薬におけるターゲットバリデーションおよびアッセイ開発において不可欠です。BioSpec-nano微量分光光度計は、自動サンプルハンドリングによるハイスループットかつ低サンプル消費量の測定を可能にし、リード化合物同定ワークフローにおけるばらつきを抑え、データの信頼性を向上させます。その迅速な測定サイクルと低い相対標準偏差は、後続のスクリーニングおよびトランスレーショナル研究への応用における予測の信頼性を支えます。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 核酸およびタンパク質サンプルの精密な定量化を可能にし、標的発現解析およびパスウェイ解析を支援する。
- 運用の価値： サンプルの消費量と手作業の工程を削減し、探索生物学における仮説検証のスループットを向上させる。
- 予測的価値： 低い相対標準偏差（DNAで0.26%、タンパク質で0.51%）により、意思決定（go/no-go decision）に用いられる定量データの信頼性が高まる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： アッセイの標準化および試薬の品質評価に適した、再現性の高い吸光度測定（DNAについてはOD260-OD320、タンパク質についてはOD280）を提供します。
- 運用の価値： 自動ワイピングおよびブランキングにより、キャリーオーバーを最小限に抑え、プレート間またはバッチ間での測定の一貫性を確保します。
- 拡張性： 測定時間が3秒であるため、サンプルライブラリや分画出力の迅速なスクリーニングが可能です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな一貫性： 低容量で高精度な検出が必要なバイオマーカー定量および薬物動態サンプル分析をサポートします。
- メカニズム的なリスク低減： (Trp、Tyr、Cys-S-S残基からのε280計算による) 正確なタンパク質濃度データにより、機能アッセイにおける適切な投与量を設定できます。
- ワークフローへの統合： PDF/CSV形式での出力により、データ追跡および探索チームと前臨床チーム間の部門横断的な共有が容易になります。
パイプラインおよびワークフローの統合
BioSpec-nanoは、初期のターゲットバリデーションからアッセイ開発、そして前臨床サンプルの解析に至るまでの探索的プロセスの全工程に適合し、特にサンプルの保存と測定の再現性が極めて重要となる場面で威力を発揮します。
- ディスカバリーバイオロジー：標的バリデーションに向けた、核酸（例：遺伝子発現構築物）およびタンパク質（例：精製標的物、抗体）の仮説駆動型の定量化をサポートします。
- スクリーニング：最小限の必要量で、生化学的アッセイまたは細胞ベースのアッセイにおけるサンプル入力および反応出力のQCを可能にします。
- アナリティクス：自動パスレングス補正およびタンパク質の消衰係数計算を備えた、定量的なODベースのリードアウトを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：正確な濃度標準化が必要な、少量の前臨床サンプル（例：血漿、組織ライセート）に対応しています。
- エンタープライズでの再利用：複数のプロジェクトやモダリティにわたる標準化された定量化を行うための、共有コアラボリソースとして機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：核酸およびタンパク質の定量におけるデータの品質と再現性を向上させ、初期スクリーニングにおける偽陰性および偽陽性を減少させる。
- 運用上の価値：サンプルの接触、測定、および洗浄の自動化により、ユーザー間のばらつきを抑え、ラボの効率を向上させる。
- 戦略的価値：構造活性相関（SAR）研究のための信頼性の高い定量分析を提供することで、リード最適化における反復サイクルの高速化を可能にする。
- ポートフォリオへの影響：ターゲットの優先順位付けに信頼できる定量データを提供することで、リスク調整後のリソース配分を支援する。
実施上の考慮事項
- 分光光度計の原理およびサンプル濃度に基づいた光路長の選択について熟知している必要があります。
- BioSpec-nanoソフトウェアを搭載したPCへのアクセスと、光学面の定期的なメンテナンスが必要です。
- ユーザー間の整合性を確保するため、ブランク処理、拭き取り、およびサンプル塗布に関する標準作業手順書（SOP）の活用が推奨されます。
- ソフトウェアの設定および光路長の調整により、さまざまなサンプルタイプ（DNA、タンパク質、その他の分析物）に適応可能です。
- 吸光度に基づく定量に限定されており、追加の装置なしでは蛍光または発光アッセイには適していません。
