Name: の蛍光タンパク質の偏転アフリカツメガエルWntシグナルへの対応に 外胚葉 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 学ぶXenopus胚外胚葉を用いた蛍光タンパク質の細胞内局在変化の可視化法。Wntシグナル応答におけるタンパク質の膜移動を解析し、細胞極性とシグナル伝達の空間制御を解明する。

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ソコル実験室での研究は米国立衛生Instituesが主催しています。

（1） アフリカツメガエルの卵の体外受精 <ol><li>実験の前にヒト絨毛性ゴナドトロピン（400単位/カエル）12時間で注射した女性のカエルの卵を入手。 </li><li>場所の卵卵〜1 ×マークの変更リンゲル液を少量（0.5-1 ml）を（MMR）10へと解剖精巣の小片で、in vitroで 、それらを受精さ。 2〜3分後、卵の表面全体をカバーするために、0.1 × MMRを追加。 HCL（水酸化ナトリウムでpHを8に調整） - 20分で、卵ゼリーコートは3％システインによって除去される。卵は0.1 × MMRで3回洗浄し、注射用コールドインキュベーター（13℃）に残されます。 </li><li>受精卵2〜4細胞期に開発するために許可されています。注射のために、胚は3％フィコール、0.5 × MMRを含む溶液に転送されます。 </li></ol> 2。 RNAのマイクロインジェクション<ol><li> RNAはmMessage mMachineキット（Ambion社）を用いて線状化DNAテンプレートから合成し、0.1〜1μg/μLののストック濃度でRNaseフリー水で希釈されています。注射のためのRNAの最適な用量は、予備実験で決定されます。 Diversin - RFP、膜マーカーGFP - CAAXとフリッツルド8のRNAを注入あたり0.1〜1 ngのに使用されています。 </li><li>注射針は、針のグラインダーとキャピラリーしてから針の引き手で用意されています。注射の前に、各針は注射当たりの液体の10 NLを取り出すには水で較正されています。 </li><li>注射のために、胚は3％フィコール、0.5 × MMRの大きな液滴にプラスチック製の皿に置かれます。 RNA溶液のいずれかのマイクロリットルはナリシゲマイクロインジェクターと注射針に吸い込まれる。 RNAの10 ​​NLは、8細胞期胚2〜3倍の動物割球に注入される。注入された胚は、12ウェルプレートのウェルに転送されます。 </li></ol> 3。外胚葉外植片の準備<ol><li>注入された胚は、初期原腸胚の段階に到達すると、それらを1％アガロースでコーティングした3センチメートルプラスチックシャーレに0.6 × MMR溶液中に転送されます。卵黄膜は、ピンセットを使って手動で削除されます。外胚葉外植片は、タングステン針とhairloopを使用して胚から摘出されています。 </li><li>外胚葉外植片は、ガラスバイアルに移し、リン酸塩の3.7％ホルムアルデヒドで固定している30分間（PBS）緩衝生理食塩水。固定片はPBSで3回（10分ごと）で洗浄されています。 DAPIは核を染色するために、サードウォッシュに含まれています。 </li><li>外植片をスライドガラス上にマウントされています。スコッチテープの2つのストリップはスライドに添付されており、外植片は、2つのストリップの間に配置されています。外植片の外面は、着色なので、外植片の内側には、顕微鏡対物レンズを向くようにします。マウントソリューション（70％25 mg / mlのDABCO、抗退色試薬を含むPBSでグリセロール）11の二から三20μlの滴を加えます。上にカバースリップを置く。 </li></ol> 4。蛍光顕微鏡下で植のイメージング<ol><li>サンプルは、適切なフィルターを使用したツァイスAxioplan蛍光顕微鏡で観察されています。 </li><li>画像は、いくつかの独立した外植片からの特定の面を視覚化するために線分の添付ファイルで撮影されています。 </li></ol> 5。 Cryosectioning Cryosectioningは、細胞と免疫染色のためのより多くの適用の蛍光タンパク質の分布を可視化するための代替方法です。段階10で、胚は、デントの固定液（20％DMSO、80％メタノール）で1〜2時間は固定されているPBSで洗浄し、そして15％の魚gelatin/15％ショ糖溶液11に埋め込 ​​まれた。埋め込まれた胚は、すぐにドライアイスで凍結されており、凍結切片は、ライカクリオスタット上で生成されます。クロスセクションでは、注入されたRNAおよびその翻訳された蛋白質の製品を継承する外胚葉の細胞が含まれます。のセクションでは、蛍光を保持し、特異的な抗体で免疫染色し、蛍光で標識二次抗体で標識することができます。核はDAPIで染色されています。マウントメディアは、上記と同様である。上記のようなイメージングを行うことができます。 6。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2700/2700fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。フリッツルド受容体は細胞膜にDiversinを募集しています。フリッツルド8（Xfz8）と本部- RFPのRNAを発現している外胚葉細胞の代わりに、細胞膜での事業部- RFPを明らかに中心体（のようなG -チューブリンの共染色によって明らかにされた）。実験のスキームは、上に反映するものではありません。典型的な断面が示されています。

<ol><li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+induction+---+molecular+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic induction --- molecular aspects.</a> Development. 99, 285-306 (1987).</li>
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<li>Moeller, H., Jenny, A., Schaeffer, H. J., Schwarz-Romond, T., Mlodzik, M., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversin+regulates+heart+formation+and+gastrulation+movements+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 15900-15905 (2006).</li>
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<li>Itoh, K., Jacob, J., Sokol, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Xenopus+Frizzled+8+in+dorsal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for Xenopus Frizzled 8 in dorsal development.</a> Mech Dev. 74, 145-157 (1998).</li>
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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々はDiversinの細胞内局在性を特徴づけるために、上記のプロトコルを使用している。動物極の外植片、Diversin - RFPで、核に隣接し、凍結切片（図1）におけるG -チューブリン、中心体マーカーとの共局在が検出されました。タンパク質の細胞内局在が識別されると、削除の構造は、蛋白質のドメインが必要と細胞内局在のために十分であるか確立するために生成することができます。このアプローチを使用して、Diversinの中心体局在性ドメインは、真ん中にマッピングされており、タンパク質のカルボキシ末端ドメインでは、コイルドコイルモチーフ8を含む両方。 同プロトコルは、タンパク質の局在がシグナルに応答して変更されている、研究に使用することができます。我々はそのWntシグナルの分泌タンパク質は細胞膜のパッチ（図1）にFZ8新兵部- RFPのに対し、細胞膜に隣接する点状の構造に本部- RFPを再配置するように働く発見。我々は、さらにカルボキシ末端ドメインが細胞膜採用自体に必須でないことがわかりましたが、偏光膜の採用が必要。 <p class="jove_cont...

の蛍光タンパク質の偏転アフリカツメガエルwntシグナルへの対応に>外胚葉

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

細胞極性は、動的に胚発生1、2の間の内部外部の両方の要因によって調節されている真核細胞の基本的なプロパティです。この調節に関与するシグナル伝達経路の一つは、胚発生やヒト疾患3、4、5の重要な中に何度も使用されているWnt経路、である。この経路の複数の分子成分が協調的空間的に制限された方法で、シグナル伝達調節し、しかし根本的なメカニズムは完全には解明されていません。 ツメガエル胚上皮細胞は、様々なシグナル伝達タンパク質の細胞内局在を研究する優れたシステムです。蛍光融合タンパク質がRNAのマイクロインジェクションによるアフリカツメガエルの胚で発現され、外胚葉外植片を調製し、タンパク質の局在は、落射蛍光で評価されます。この実験的なプロトコルでは、Diversin、シグナリングと細胞極性の決定6、7に関与している細胞質タンパク質の細胞内局在がWntシグナル伝達8を研究するためにアフリカツメガエルの外胚葉細胞の視覚化方法について説明します。 Wntリガンドまたはフリッツルド受容体の共発現は、赤色蛍光タンパク質、RFPとの融合Diversinの分布を変化させる、と偏ファッション8,9の細胞膜に募集しています。この生体外でのプロトコルは、シグナリングの空間的な制御が無傷組織のものと異なっているとはるかに難しい分析することになっている哺乳動物培養細胞、のin vitro試験に役立つだけでなくでなければなりません。

アフリカツメガエル胚の外胚葉は、細胞極性の研究のための魅力的なモデルとなっている。アッセイは、蛍光タンパク質の細胞内分布は、外胚葉の細胞で評価されている、説明しています。このプロトコルは、シグナリングの空間的な制御に関連したアドレスの質問に役立ちます。

の蛍光タンパク質の偏転アフリカツメガエルWntシグナルへの対応に>外胚葉

細胞極性は真核細胞の根本的な特性であり、胚発生の過程において内因性および外因性の両方の要因によってダイナミックに制御されています。

この手順の全般的な目的は、成長因子シグナルの伝達に伴うタンパク質の細胞内局在の変化を調べることです。これはまず、アフリカツメガエル（xenopus）初期胚の動物極に、RFP融合タンパク質およびシグナル受容体であるFRIZZLED 8をコードするRNAを注入することで達成されます。次に、電気穿孔法による導入または胚の凍結切片を調製し、免疫染色を行います。最後に、免疫染色した細胞を蛍光顕微鏡で撮影します。これにより、最終的に、特定のタンパク質の細胞内局在が胚のシグナル伝達経路にどのように依存しているかを示す結果を得ることができます。例として、diverseがFRIZZLED 8受容体によって中心体から細胞膜へリクルートされることを実証します。この手法を用いることで、研究者はゼノプスの胚を用いて、生体内でシグナル伝達タンパク質の細胞内局在を可視化することができます。これにより、シグナルの空間的調節や細胞優先性のメカニズムの研究など、発生生物学および細胞生物学における根本的な疑問の解決に寄与します。体外受精の手順を開始するには、ヒト絨毛性ゴナドトロピンを注射した雌ガエルから卵を採取してください。実験の12時間前に、1 X Marx modified ringer solutionを0.5〜1 mL卵に添加し、解剖した精巣の小片を用いてin vitroで受精させます。2〜3分後、0.1 XMMRを用いて塩濃度を下げ、精子の運動性を活性化させます。20分間インキュベートします。受精後、卵は動物極を上にして配向します。MMR溶液を3%システイン水溶液に交換して5分間置き、卵のジェリーコートを除去します。その後、卵を0.1 XMMRで3回洗浄します。2〜4細胞期になるまで13 °Cでインキュベートします。その後、胚をマイクロインジェクション用の0.5 XMMRを含む3% fiに移します。M message M machine kitを用いて線状化DNAテンプレートからRNAを合成し、RNAs free waterで0.1〜1 µg/µLの濃度に希釈します。diverse in RFP、膜マーカーGFP CX、およびFRIZZLED 8のRNAは、1回の注入あたり0.1〜1 ngの量で使用します。注入前に、ニードルプラーとニードルグラインダーを用いてキャピラリーチューブから注入用ニードルを作成します。注入に備え、各ニードルを水で校正し、1回の注入につき10 litersの液体が排出されるように調整します。胚をプラスチックディッシュの上に置き、3%fial 0.5 XMMRの大きな液滴の中に配置します。narrow shigeマイクロインジェクターを用いて、1 µLのRNA溶液を注入ニードルに吸い上げます。2細胞期の胚の動物極に、RNAを10 nanolitersずつ注入します。注入した胚を12ウェルプレートのウェルに移し、初期原腸胚期に達するまで13 °Cでインキュベートします。胃腸形成期の胚を、1% aerosでコーティングした6 cmプラスチックディッシュ内の0.6 XMMR溶液に移します。ピンセットを用いて卵膜を手動で除去します。次に、ツインニードルとヘアループを使用して、胚から外胚葉外植片を切り出します。PBSに溶解した3.7%ホルムアルデヒドで30分間固定します。X explanをPBSで10分間ずつ3回洗浄します。核を染色するため、3回目の洗浄時にdaviを添加します。次に、X explanを2本のスコッチテープの間に挟み、X explanの非色素側の内面を対物レンズに向けてガラススライドに固定します。封入剤を20 µLずつ2〜3滴滴下してください。その上にカバーグラスを被せます。注入した胚を凍結切片化することで、細胞内における蛍光タンパク質の分布を可視化し、特異的抗体を用いて共染色を行うことができます。ステージ10において、4 mLのガラスバイアル内で固定液を用い、室温で1〜2時間胚を固定します。次に、PBSで洗浄した後、同じバイアル内で15%魚ゼラチンおよび15%スクロース溶液を用いて胚を包埋します。翌日、包埋した胚をプラスチック製モールドに移します。ドライアイスを用いて、包埋した胚を急速凍結させます。その後、クリオスタットを用いて凍結切片を作製します。外胚葉移植の説明と同様の方法を用いて、切片の免疫蛍光染色、スライドの封入、および横断面胚のイメージングを行います。適切なフィルターを備えたZeiss Axio plan蛍光顕微鏡を使用して画像を収集し、X平面内の特定のZ平面を特定して撮影します。この図では、ersinは外胚葉細胞の中心体に局在していますが、transは細胞膜に局在しています。Frizzled 8に反応して、cex GFPが細胞膜を緑色に標識しています。ここでは、Diverse in RFPが赤色で、DPIで標識された核が青色で示されています。胚の凍結切片において、Diverse in RFPはFrizzled 8によって細胞膜にリクルートされています。γ-tubulinは中心体マーカーです。このビデオを視聴することで、タンパク質ドッキングの承認およびシグナル伝達プロセスのサブ細胞解像度での研究における、XUS胚および胚性細胞の有用性について十分に理解できるはずです。

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