の蛍光タンパク質の偏転アフリカツメガエルWntシグナルへの対応に>外胚葉
2011年5月26日
アフリカツメガエル胚の外胚葉は、細胞極性の研究のための魅力的なモデルとなっている。アッセイは、蛍光タンパク質の細胞内分布は、外胚葉の細胞で評価されている、説明しています。このプロトコルは、シグナリングの空間的な制御に関連したアドレスの質問に役立ちます。
この手順の全般的な目的は、成長因子シグナルの伝達に伴うタンパク質の細胞内局在の変化を調べることです。これはまず、アフリカツメガエル（xenopus）初期胚の動物極に、RFP融合タンパク質およびシグナル受容体であるFRIZZLED 8をコードするRNAを注入することで達成されます。次に、電気穿孔法による導入または胚の凍結切片を調製し、免疫染色を行います。
最後に、免疫染色した細胞を蛍光顕微鏡で撮影します。これにより、最終的に、特定のタンパク質の細胞内局在が胚のシグナル伝達経路にどのように依存しているかを示す結果を得ることができます。例として、diverseがFRIZZLED 8受容体によって中心体から細胞膜へリクルートされることを実証します。
この手法を用いることで、研究者はゼノプスの胚を用いて、生体内でシグナル伝達タンパク質の細胞内局在を可視化することができます。これにより、シグナルの空間的調節や細胞優先性のメカニズムの研究など、発生生物学および細胞生物学における根本的な疑問の解決に寄与します。体外受精の手順を開始するには、ヒト絨毛性ゴナドトロピンを注射した雌ガエルから卵を採取してください。
実験の12時間前に、1 X Marx modified ringer solutionを0.5〜1 mL卵に添加し、解剖した精巣の小片を用いてin vitroで受精させます。2〜3分後、0.1 XMMRを用いて塩濃度を下げ、精子の運動性を活性化させます。20分間インキュベートします。
受精後、卵は動物極を上にして配向します。MMR溶液を3%システイン水溶液に交換して5分間置き、卵のジェリーコートを除去します。その後、卵を0.1 XMMRで3回洗浄します。
2〜4細胞期になるまで13 °Cでインキュベートします。その後、胚をマイクロインジェクション用の0.5 XMMRを含む3% fiに移します。
M message M machine kitを用いて線状化DNAテンプレートからRNAを合成し、RNAs free waterで0.1〜1 µg/µLの濃度に希釈します。diverse in RFP、膜マーカーGFP CX、およびFRIZZLED 8のRNAは、1回の注入あたり0.1〜1 ngの量で使用します。注入前に、ニードルプラーとニードルグラインダーを用いてキャピラリーチューブから注入用ニードルを作成します。
注入に備え、各ニードルを水で校正し、1回の注入につき10 litersの液体が排出されるように調整します。胚をプラスチックディッシュの上に置き、3%fial 0.5 XMMRの大きな液滴の中に配置します。narrow shigeマイクロインジェクターを用いて、1 µLのRNA溶液を注入ニードルに吸い上げます。
2細胞期の胚の動物極に、RNAを10 nanolitersずつ注入します。注入した胚を12ウェルプレートのウェルに移し、初期原腸胚期に達するまで13 °Cでインキュベートします。
胃腸形成期の胚を、1% aerosでコーティングした6 cmプラスチックディッシュ内の0.6 XMMR溶液に移します。ピンセットを用いて卵膜を手動で除去します。次に、ツインニードルとヘアループを使用して、胚から外胚葉外植片を切り出します。
PBSに溶解した3.7%ホルムアルデヒドで30分間固定します。X explanをPBSで10分間ずつ3回洗浄します。核を染色するため、3回目の洗浄時にdaviを添加します。
次に、X explanを2本のスコッチテープの間に挟み、X explanの非色素側の内面を対物レンズに向けてガラススライドに固定します。封入剤を20 µLずつ2〜3滴滴下してください。その上にカバーグラスを被せます。
注入した胚を凍結切片化することで、細胞内における蛍光タンパク質の分布を可視化し、特異的抗体を用いて共染色を行うことができます。ステージ10において、4 mLのガラスバイアル内で固定液を用い、室温で1〜2時間胚を固定します。次に、PBSで洗浄した後、同じバイアル内で15%魚ゼラチンおよび15%スクロース溶液を用いて胚を包埋します。
翌日、包埋した胚をプラスチック製モールドに移します。ドライアイスを用いて、包埋した胚を急速凍結させます。その後、クリオスタットを用いて凍結切片を作製します。
外胚葉移植の説明と同様の方法を用いて、切片の免疫蛍光染色、スライドの封入、および横断面胚のイメージングを行います。適切なフィルターを備えたZeiss Axio plan蛍光顕微鏡を使用して画像を収集し、X平面内の特定のZ平面を特定して撮影します。この図では、ersinは外胚葉細胞の中心体に局在していますが、transは細胞膜に局在しています。
Frizzled 8に反応して、cex GFPが細胞膜を緑色に標識しています。ここでは、Diverse in RFPが赤色で、DPIで標識された核が青色で示されています。胚の凍結切片において、Diverse in RFPはFrizzled 8によって細胞膜にリクルートされています。
γ-tubulinは中心体マーカーです。このビデオを視聴することで、タンパク質ドッキングの承認およびシグナル伝達プロセスのサブ細胞解像度での研究における、XUS胚および胚性細胞の有用性について十分に理解できるはずです。
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概要
本研究では、蛍光タンパク質の細胞内分布の評価を通じて細胞極性を調査するため、アフリカツメガエル（Xenopus）胚の外胚葉をモデルとして利用します。本プロトコルの目的は、外胚葉細胞におけるシグナル伝達の空間的制御を解明することです。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- 発生生物学
- 信号伝達
背景
- Xenopus胚は、細胞プロセスを研究するための貴重なモデルです。
- 細胞極性を理解することは、発生生物学への洞察を得るために不可欠です。
- 蛍光タンパク質を用いることで、タンパク質の局在を可視化できます。
- 成長因子のシグナル伝達は、細胞内のタンパク質の局在に影響を与えます。
研究目的
- シグナル伝達経路に応答したタンパク質局在の変化を調べる。
- 特定の細胞部位へのタンパク質のリクルートを実証する。
- 外胚葉細胞の極性を研究するためのプロトコルを提供する。
使用された手法
- RFPおよびFRIZZLED 8をコードするRNAのXenopus初期胚への注入。
- 電極皮膚インプラントおよび胚の凍結切片の作製。
- タンパク質の局在を可視化するための細胞の免疫染色。
- 蛍光顕微鏡を用いた染色細胞のイメージング。
主な結果
- 増殖因子のシグナル伝達に伴い、特定のタンパク質の局在が変化することが結果から示されました。
- 多様なタンパク質が中心体から細胞膜へとリクルートされます。
- 局在におけるFRIZZLED 8受容体の役割を実証しました。
- 外胚葉細胞におけるシグナル伝達の空間制御に関する知見を提供しました。
結論
- 本研究は、細胞シグナル伝達におけるタンパク質の局在の重要性を強調しています。
- Xenopus 胚外胚葉は、このような研究のための効果的なモデルとなります。
- 本プロトコルは、細胞極性とシグナル伝達経路に関するさらなる研究に役立ちます。
よくある質問
産業界への実用的な意義
Wntシグナリングに応答したタンパク質局在の空間的制御は、初期創薬におけるターゲット検証およびメカニズムのリスク低減における重要な転換点となります。アフリカツメガエル（Xenopus）の外胚葉と蛍光タンパク質の移行を利用することで、経路特異的なタンパク質のダイナミクスを直接可視化することができ、経路調節における予測の信頼性を高めることが可能です。このアプローチは、疾患に関連する発生学的コンテキストにおいて、候補ターゲットへの結合がもたらす機能的影響を明確にすることで、ポートフォリオ決定の根拠を強化します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 細胞内でのタンパク質局在を通じて、Wntパスウェイ活性を直接的に解析することが可能になります。
- 受容体の活性化とタンパク質の空間的な再分布を関連付けることで、メカニズム的なリスク低減をサポートします。
- 生理学的に適切な胚システムにおいて、機能的なターゲット検証を容易にします。
- パスウェイ調節戦略に対する予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- タンパク質転位イベントを定量化するための、検証済みex vivoシステムを構築します。
- 後続のアッセイ開発に向けて、再現性のある定量的なイメージング出力を提供します。
- 化合物または遺伝的摂動スクリーニングにおけるリードアウトの標準化を可能にします。
- 関連するシグナル伝達経路の研究に向けた、拡張性とプラットフォームの再利用を支援します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 発達障害や腫瘍学に関与する疾患関連のシグナル伝達メカニズムと一致しています。
- パスウェイ標的の発見から前臨床検証までのトランスレーショナルな連続性を維持します。
- 未処理組織における空間的なシグナル出力を明確にすることで、リスク調整された進展を可能にします。
- タンパク質局在の変化を可視化することにより、バイオマーカーの整合性をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本プロトコルは、初期探索とリード化合物同定のインターフェースを統合するものであり、メカニズム的な仮説検証から定量的アッセイの開発への架け橋となります。
- 発見生物学： パスウェイ依存的なタンパク質の局在を可視化し、ターゲットへの結合および生物学的メカニズムを明らかにします。
- スクリーニング： アッセイの標準化およびスクリーニングワークフローに適した、定量的な再現性のあるイメージング出力を提供します。
- 分析： 実験条件や摂動によるタンパク質局在の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 空間的なシグナリングの読み出しを、疾患に関連する発生プロセスへと結びつけます。
- エンタープライズ再利用： 多様なシグナリングタンパク質やパスウェイモジュレーターを評価するための、再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：パスウェイを標的としたプログラムにおいて、予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用的価値：タンパク質局在のイメージングと定量を標準化し、再現性と拡張性を確保します。
- 戦略的価値：パスウェイの活性化と機能的なタンパク質の再分布を関連付けることで、Go/No-go決定に根拠を与えます。
- ポートフォリオへの影響：パスウェイ標的および候補分子のリスク調整済み優先順位付けを支援します。
実施上の考慮事項
- 胚へのマイクロインジェクション、蛍光イメージング、および定量分析の専門知識が必要です。
- 高品質な蛍光顕微鏡および画像解析インフラストラクチャへのアクセスが不可欠です。
- イメージングプロトコルとデータ解釈について、チーム間での標準化が必要です。
- 他のモデルシステムに適応させる場合、組織のコンテキストに応じてプロトコルの最適化が必要になる場合があります。
- 実用上の制限として、スループットの制約や、専門的な発生学的なスキルの必要性が挙げられます。
