Name: ライブラット皮質ニューロンのミトコンドリア膜電位と活性酸素種の定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 学ぶライブイメージング法でラット皮質ニューロンのミトコンドリア膜電位と活性酸素種を定量する方法。TMRMとH2D CFDA蛍光プローブを用いて、FCCPや過酸化水素処理による動的変化をリアルタイムで解析する技術です。

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この作品は、国立衛生研究所（JCBへK22NS050137）によってサポートされていました。

1。細胞の培養<ol><li>皮質ニューロンを単離し、前述の技法を用いて成長とポリ- D -リジンとラミニン1でコートしたガラスボトム（マテック（株）、アッシュランド、マサチューセッツ州）で培養皿に播種されています。 </li></ol> 2。蛍光プローブTMRMとH 2 DCF - DA用のストック溶液を準備する<ol><li>無水ジメチルスルホキシド1mlにTMRM 5.0 mgを溶解してTMRMの10 mMのストック溶液を調製。 1分間ボルテックスして。その後、アリコートを行い、-20℃に保存する、光から保護し、一ヶ月以内に使用してください。 </li><li>次に、無水DMSO 1ml中にH 2 DCF - DAの4.87 mgを溶解することによってH 2 DCF - DA 10 - mMのストック溶液を調製。同様に、1分間攪拌のためのそれ。その後、アリコートを行い、-20℃に保存する、光から保護し、一週間以内に使用してください。 </li></ol> 3。 TMRMとH 2 DCF - DAでのロードラット皮質ニューロン TMRMは、ミトコンドリアの高度に負に帯電内部に蓄積される電位差、細胞透過性蛍光指示薬です。ミトコンドリアTMRMの自動消光を避けるためにTMRMの低濃度（10〜50 nMの範囲）を使用することが重要です。その後、TMRMの蛍光シグナルはミトコンドリア内膜を通過するΔΨmに直接協力関係することができます。 ΔΨmの消失は、蛍光強度が失われるおそれがミトコンドリアからリークするTMRMなります。 H 2 DCF - DAは細胞透過性の細胞内エステラーゼによってDCF - DAに変換プローブ、および蛍光DCFでの酸化の結果です。高負荷の濃度もH 2の不在O 2におけるDCF蛍光の飽和を引き起こす可能性があるので、DCF - DA 2〜10μMとそれの間の範囲H 2の最終濃度は、異なる脳領域から派生した神経細胞で実験的にテストする必要があります。いかなる内因性または外因性の酸化剤（例えば、一酸化窒素、過酸化水素）の存在は、DFC蛍光強度が増加します。以下、我々はTMRMとH 2 DCF - DAでラット皮質ニューロンをロードするためのプロトコルを提供しています。 <ol><li> TB：：145 mMのNaCl、5mMのKCl、10mMのグルコース、1.5mMのCaCl 2を 、1mMのMgCl 2、および10 TMRMとラット皮質ニューロンをロードするには、まず、タイロードバッファ（テキストオーバーレイで培養神経細胞を3回洗浄mMのHEPES、NaOHで7.4にpHを調整）。その後、結核で1 / 1000倍の10mM TMRMの株式を希釈することによりTMRMの20 nMのを準備して、TBの1mlあたり希薄化後TMRMの2μlを加える。室温、暗所で45分間TMRMと神経細胞をインキュベートします。 45分後、顕微鏡のステージ上に培養皿をマウントし、イメージングを起動します。 </li><li> H 2 DCF - DAとラット皮質ニューロンをロードするには、結核と培養神経細胞を3回洗浄。次に、TBで10mMのH 2 DCF - DA株式1 / 10倍に希釈してH 2 DCF - DAの2μMを準備して、TBの1mlあたり希薄化後のH 2 DCF - DAの2μlを加える。その後、室温で暗所で45分間H 2 DCF - DAを持つニューロンをインキュベートする。 45分後、画像を取得する前に、余分な蛍光指示薬を削除するには、結核と神経細胞を4回洗浄する。 </li></ol> 4。 ΔΨmを決定するためにTMRMとともにインキュベートした神経細胞のイメージングを生きる<ol><li> TMRMとともにインキュベートした神経細胞のライブイメージング、共焦点レーザー走査顕微鏡（テキストオーバーレイ：LSM 510、カールツァイス社）を実行するために、ライブの時系列のプログラムのアプリケーションとを、使用されています。画像を取得し、退色を避けるために必要な時間を最小限に抑えるために：、低解像度と減衰レーザーパワー（1％：低解像度レーザパワー256 × 256テキストオーバーレイ）を適用します。 </li><li> 。次に、反射光を使用してTMRMでロードされたマウントされているニューロンのフォーカスを調整します。 514 nmで照射し、570nmで検出によるTMRM蛍光を調べます。ちょうど飽和レベル以下のカメラの検出のゲインを設定します。 </li><li>一度画像を得るために解像度、レーザーパワー、カメラの検出のゲイン、およびタイムラプス間隔を含むすべてのパラメータが設定されています。実験間でこれらの設定を変更しないでください。次に、フィールドを変更します。画像の収集を開始。 </li><li> ΔΨmの変更をテストするには、そのようなFCCPまたは2μgの/オリゴmlの、1μMのような刺激が著しく、それぞれ、ミトコンドリア膜電位を脱分極や過分極となる、適用することができます。これらの変更は、FCCPの場合にはベースライン蛍光強度と比較してTMRM蛍光強度の減少、またはオリゴマイシンの場合にTMRM蛍光強度の増加が反映されます。 </li></ol> 5。 ROSを決定するためにH 2 DCF - DAとインキュベートした神経細胞のライブイメージング<ol><li> H 2 DCF - DA、最初にインキュベートニューロンのライブイメージングを実行するには、顕微鏡のステージ上に培養皿をマウント。私たちの細胞のフォーカスを調整しますINGは、反射光を。 488 nmで励起と515 nmの放射によるDCFの蛍光を調べる。 </li><li>次に、5-7％、検出器のゲイン、および256 × 256の解像度にレーザーパワーを調整する。実験間でこれらの設定を変更しないでください。その後、時系列のプログラムを使用してライブ映像を得るために周波数を設定します。 </li><li>新しいフィールドを選択して、画像を取得開始します。 ROSレベルの変化を検出するには、H 2 O 2の100から200μMで細胞を扱う。これは、ベースラインレベルと比較してDCF蛍光強度の増加が反映されます。 </li></ol> 6。データの分析<ol><li>エリアを選択するLSMのプログラムからツール：関心領域を（ROIテキストオーバーレイ）を使用してください。その後、TMRMまたはROS蛍光強度を測定する。それぞれ、TMRMまたはROSの蛍光強度を測定するために撮像された細胞の全体の細胞体からミトコンドリアの地域またはROIのからROIを選択してください。 </li><li> TMRM用または各時間ポイントのROSのすべての画像形成されたセルのための全体の細胞体からの各セルのすべてのROIの平均蛍光強度を計算する。バックグラウンドの蛍光強度を計算するセルの隣の領域を選択します。いくつかの測定を行い、平均バックグラウンド強度を計算する。 </li><li> Microsoft Excelを使用して、各時間ポイントの各セル内のROIの平均蛍光強度から平均的なバックグラウンドの蛍光強度を引きます。バックグラウンド強度を差し引いた、この式を用いてベースラインの蛍光（：=ベースライン蛍光の任意の時点でFが=蛍光強度、ΔF= FF O / F O × 100、テキストオーバーレイ）にTMRMまたはDCF蛍光強度を正規化する。その後、時間の経過とともに蛍光強度の変化を示すグラフを生成するシグマプロットプログラムを使用します。 </li></ol> 7。代表的な結果図1Aは、TMRMとインキュベートラット皮質ニューロンの蛍光画像を示しています。 FCCP、ミトコンドリア脱共役剤、の添加は、ミトコンドリアの脱分極とTMRM蛍光強度（図1B）の損失につながる。ベースラインTMRMの蛍光レベルは、FCCPの添加（。;図1C第一350秒）の前に安定している。時間をかけてTMRM蛍光変化の定量分析は、FCCP（図1C）の添加後TMRMの蛍光の有意な減少を示しています。 図1Dは、DCFを搭載したラット皮質ニューロンの蛍光画像を示しています。細胞体の増加DCF蛍光強度（図1E）のH 2 O 2の添加により。ベースラインDCF蛍光レベルは、H 2 O 2のアプリケーションの前に（最初の120秒）変更されていません。 DCF蛍光の経時的測定は、着実なレベルを示し、H 2 O 2処理（図1F）の後にどの増加。 <img src="/files/ftp_upload/2704/2704fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。ミトコンドリア膜電位とライブラット皮質ニューロンのROSレベルの評価。 TMRMを搭載した皮質ニューロンの（A）代表蛍光画像。ベースラインTMRM蛍光をスキャンした後、神経細胞はprotonophore FCCP（1μM）で処理した。右側にはそれぞれ、明るい黄色と表す黒の最大値と最小輝度とTMRM蛍光の疑似強度バーです。ミトコンドリアの領域からTMRMの蛍光の消失は、FCCP治療（パネルB）に応じてΔΨmの崩壊を示している。異なる時点でTMRM蛍光強度の変化の定量的表現は、FCCPの治療の前と後のパネルC.（D）でH2DCF - DAを搭載したラット皮質ニューロンの蛍光画像を示しています。ベースラインDCF蛍光を決定した後、細胞を200μMのH 2 O 2で処理し、及びDCF蛍光の変化を評価した。 DCF蛍光の増加は、H 2 O 2処理（E）に応じてROSレベルの増加を反映している。 DCF蛍光の変化の定量分析、H 2 O 2処理の前後には、パネルF.スケールバーに=10μmを示しています Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi 40倍対物レンズを用いてFCCPを添加する前と後の皮質ニューロンにおけるTMRMの細胞イメージングを生きる。擬似カラーの強度は、FCCPの添加後（赤色、FCCPの添加後の）最大値（FCCPの添加前に、明るい黄色、）と減少TMRM蛍光強度を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video1.avi">ビデオを表示するにはここをクリック</a> ビデオ。 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi 40倍対物レンズを用いてH 2 O 2を添加する前と後の皮質ニューロンにおけるDCFの細胞イメージングを生きる。ベースラインDCF蛍光は、細胞体にライトグリーン色をしているとH2O2添加は、DCを増加させる鮮やかな緑色にF蛍光強度は。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video2.avi">ビデオを表示するにはここをクリック</a>

<ol><li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys. J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Ward, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+%28AICD%29+disrupts+actin+dynamics+and+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics.</a> J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).</li>
<li>Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+activation+produces+concurrent+generation+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species%3A+implication+for+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death.</a> J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

私たちは、それぞれ蛍光指示薬TMRMとH 2 DCF - DAを使用して、ラット皮質ニューロンでΔΨmとROSを決定する方法を説明するステップバイステップの手順を提示している。他の細胞型の場合は、経験的にTMRMまたはH 2 DCF - DAの最終濃度とローディング時間を決定することが重要です。一般的に、TMRM 20から200 nMから濃度範囲、およびTMRMと細胞のインキュベーション時間は20〜60分ごとに異なります。 H 2の最終濃度は、DCF - DAは、2〜10μMの範囲であり、そしてこの指標を含むローディング溶液中の細胞のインキュベーションは、30〜45分ごとに異なります。 どんな刺激がないのに細胞と蛍光強度の変化（TMRM蛍光のちらつきなど）の両方の光毒性を避けるために写真を撮るのレーザーパワーと走査速度を最適化することが重要です。最適化された光の設定は、刺激のない状態で（閾値）飽和上または下にない蛍光シグナルになるはずです。ライブイメージングの10〜15分の任意の刺激の非存在下でのプローブの蛍光強度には変化がないときに、特定のレーザーパワーおよび走査速度で選択したフィールドから画像を収集するために最適な条件が達成されています。 ΔΨmを決定するために他の蛍光プローブはローダミン123およびテトラメチルローダミンエチルエステル（TMRE）が含まれています。しかし、それらは単離されたミトコンドリア2の呼吸のプロセスを阻害することが見出された。重要なのは、TMRMは、低濃度でミトコンドリア呼吸に影響を与えません2と低光毒性と他のプローブに比べて3退色しています。 H 2 DCF - DAは、それがよく細胞内に保持されるROSのための良い指標であり、そのような過酸化物、超酸化物、および一酸化窒素4のようないくつかの酸化剤の種を、認識する。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>グラスの底の培養皿</td><td>マテック株式会社</td><td> P35G - 1.5 - 14 - C </td></tr><tr><td> NbActive4 </td><td> BrainBits </td><td> NbActive4 </td></tr><tr><td> TMRM </td><td>インビトロジェン</td><td> T668 </td></tr><tr><td> H 2 DCF - DA </td><td>インビトロジェン</td><td> C400 </td></tr><tr><td> NaClの</td><td>シグマ</td><td> S6191 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>シグマ</td><td> P3911 </td></tr><tr><td>のCaCl 2•2H 2 O </td><td>シグマ</td><td> C3306 </td></tr><tr><td>のMgCl 2•6H 2 O </td><td>シグマ</td><td> M2670 </td></tr><tr><td> D -グルコース</td><td>シグマ</td><td> G6152 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>インビトロジェン</td><td> 15630 </td></tr></tbody></table>

ライブラット皮質ニューロンのミトコンドリア膜電位と活性酸素種の定量

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

ミトコンドリア膜電位（ΔΨm）は、ATPを生成するための呼吸鎖の生理的機能を維持するために不可欠です。 ΔΨmの大幅な損失は、その後の死でエネルギーが枯渇セルをレンダリングします。活性酸素種（ROS）が重要なシグナル伝達分子であるが、病的状態におけるそれらの蓄積は、酸化ストレスにつながる。細胞内ROSの二つの主要な源は、環境の毒素と酸化的リン酸化のプロセスです。ミトコンドリア機能障害と酸化ストレスは多くの疾患の病態生理に関与しているので、ΔΨmとROSを判断する能力は、細胞とミトコンドリアの機能の生理学的状態に関する重要な手がかりを提供することができます。 いくつかの蛍光プローブ（ローダミン123、TMRM、TMRE、JC - 1）種々の細胞型でΔψmを決定するために使用することができる、と多くの蛍光指標（Dihydroethidium、Dihydrorhodamine 123、H 2 DCF - DA）はROSを決定するために使用することができます。ほぼすべてのΔΨmまたはROSを評価するために使用可能な蛍光プローブのは、単一波長の指標であり、ΔΨmまたはROSのレベルを増加または減少させる刺激に比例した蛍光強度を増加または減少される。従って、それはベースラインレベルと特定の刺激を加えた後にこれらのプローブの蛍光強度を測定することが不可欠です。これは、1つはベースラインレベルと刺激間の蛍光強度の変化の割合を決定することができます。蛍光強度の変化はΔΨmまたはROSの相対的なレベルの変化を反映している。このビデオでは、我々はベースラインレベルとの間およびFCCP、ミトコンドリアの脱共役剤を適用した後TMRM蛍光強度の変化率を決定するためにラット皮質ニューロンの蛍光指示薬、TMRMを、適用する方法を示しています。 FCCPの治療に起因するTMRM蛍光の低いレベルは、ミトコンドリア膜電位の脱分極を反映している。我々はまた、H 2 O 2の適用後、ベースラインの最初の皮質ニューロンにおけるROSのレベルを、評価し、蛍光プローブH 2 DCF - DAを適用する方法を示しています。このプロトコルは、（若干変更して）また、異なる細胞型で、他の脳領域から分離されたニューロンのΔΨmとROSの変化を決定するために使用することができます。

我々は、特定の刺激の適用前と適用後のTMRM蛍光強度の相対的変化を決定するために皮質ニューロンで、蛍光指示薬、TMRMのアプリケーションを実証する。我々はまた、蛍光プローブHのアプリケーションを表示<sub&gt; 2</sub&gt; DCF - DA皮質ニューロンにおける活性酸素種の相対的レベルを評価する。

ミトコンドリア膜電位（&Delta;&Psi;m）は、ATPを生成するための呼吸鎖の生理的機能を維持する上で極めて重要です。A ...

この手順の目的は、蛍光プローブであるTMRMおよびH 2D CFDAを用いて、初代皮質ニューロンにおけるミトコンドリア膜電位および活性酸素種レベルをそれぞれ測定することです。まず、TMRMとH 2D CFDAのストック溶液および作業濃度溶液を調製します。次に、皮質ニューロンをTMRMおよびH 2D CFDAとともに、Thai roads bufferを用いて室温で45分間インキュベートします。3番目のステップは、生きた皮質ニューロンにおいて、TMRMおよびDCFの蛍光強度を、それぞれ515/517 nmおよび488/515 nmの励起・蛍光波長を用いてイメージングすることです。ミトコンドリア脱共役剤であるFCCP存在下でのTMRM蛍光の変化をモニタリングし、一方で過酸化水素存在下でのDCF蛍光の変化をモニタリングします。この手順の最終ステップは、データの収集、正規化、および解析です。最終的に、FCCP処理および過酸化水素処理の前後におけるTMRMおよびDCFの蛍光強度の相対値をそれぞれグラフにプロットすることで、結果を得ます。こんにちは、Joanna Koskaです。ロヨラ大学シカゴ校の私の研究室へようこそ。本日は、ラット皮質ニューロンにおけるミトコンドリア膜電位および活性酸素種の測定方法について解説します。手順のデモンストレーションはdhiが行います。こんにちは、Denise Jossiです。この手順を用いることで、単一ミトコンドリアラベルでのミトコンドリア膜電位の測定、および単一細胞ラベルでの活性酸素種の測定が可能です。それでは、開始しましょう。5 mgのTMRMを1 mLの無水ジメチルスルホキシドに溶解し、1分間ボルテックスして、10 mMのTMRMストック溶液を調製します。次に、分注して-20°Cで保存します。遮光し、1ヶ月以内に使用してください。続いて、4.87 mgのH 2D CFDAを1 mLの無水ジメチルスルホキシドに溶解し、10 mMのH 2D CFDAストック溶液を調製します。同様に、1分間ボルテックスした後、分注して-20°Cで保存します。遮光し、1週間以内に使用して、まずラット皮質ニューロンにTMRMをロードします。培養ニューロンをTyrode緩衝液で3回洗浄します。次に、10 millimolarのTMRMストック溶液をtbで1000倍に希釈し、20 nano molarのTMRMを調製します。その後、tb 1 milliliterあたり2 microlitersの希釈TMRMを加えます。ニューロンをTMRMとともに、室温・暗所にて45分間インキュベートします。45分後、培養皿を顕微鏡のステージに載せ、ラット皮質ニューロンにH 2D CFDAをロードするためのイメージングを開始し、培養ニューロンをtbで3回洗浄します。次に、10 millimolarのH 2D CFDAストック溶液をtbで10倍に希釈し、2 micromolarのH 2D CFDAを調製します。その後、tb 1 milliliterあたり2 microlitersの希釈済みH 2D CFDAを添加します。その後、ニューロンをH 2D CFDAとともに、室温・暗所にて45分間インキュベートします。過剰な蛍光指示薬を除去するため、ニューロンをTBで4 times洗浄し、ライブタイムシリーズプログラムを用いて、TMRMでインキュベートしたニューロンのライブイメージングを共焦点レーザー走査顕微鏡により行います。画像取得時間を短縮し、光退色を避けるため、低解像度および減衰させたレーザー出力を適用してください。次に、反射光を用いて、TMRMで負荷した固定ニューロンのフォーカスを調整します。540 nmで励起し、570 nmで検出することで、TMRMの蛍光を観察します。解像度、レーザー出力、カメラのゲイン、画像取得の時間経過インターバルを含むすべてのパラメータを設定した後、カメラの検出ゲインを飽和レベルの直下に設定します。実験間でこれらの設定を変更しないでください。次に、視野を移動します。ΔΨM刺激による変化をテストするための画像収集を開始します。例えば、1 µMのFCCPまたは2 µg/mLのoligomycinを添加することで、ミトコンドリア膜電位をそれぞれ著しく脱分極または過分極させることができます。これらの変化は、FCCPの場合にはベースラインの蛍光強度と比較してTMRM蛍光強度の低下として、あるいはTMRM蛍光強度の増加として反映されます。H 2D CFDAでインキュベートしたニューロンのライブイメージングを行う場合は、まず培養皿を顕微鏡のステージに載せ、反射光を用いて細胞の焦点調整を行います。励起波長 4 88 nanometers、蛍光波長 five 15 nanometersでDCF蛍光を観察してください。次に、レーザー出力を5～7%に調整し、ゲインを検出して解像度を256×256に設定します。これらの設定は、実験間で変更しないでください。その後、ライブイメージを取得するための周波数を設定します。タイムシリーズプログラムを使用して、新しい視野を選択し、R osレベルの変化を検出するための画像取得を開始します。細胞に100から200 µMの過酸化水素を添加します。これにより、ベースラインレベルと比較してDCFの蛍光強度の増加が認められます。LSMプログラムの関心領域（ROI）ツールを使用して、領域を選択します。次に、TMRMまたはROSの蛍光強度をそれぞれ測定するため、画像内のミトコンドリア領域のROI、または細胞体全体のROIを選択します。細胞に隣接する領域を選択します。背景蛍光強度を算出するために、数箇所で測定を行います。各タイムポイントにおける各細胞の関心領域（ROI）の平均蛍光強度から、Microsoft Excelを用いて平均背景蛍光強度を差し引き、平均背景強度を算出します。背景強度を差し引いた後、TMRMまたはDCFの蛍光強度をベースライン蛍光で正規化します。この計算式を用いて、Sigma Plotプログラムで蛍光強度の時間的変化を示すプロットを作成します。こちらは、TMRMでインキュベートしたラット皮質ニューロンの蛍光画像の例です。F-C-C-P-Aミトコンドリア脱共役剤を添加すると、ミトコンドリアの脱分極が起こり、TMRMの蛍光強度が低下します。FCCP添加前は、TMRMのベースライン蛍光レベルが安定して推移します。TMRM蛍光の時間的変化を定量分析すると、FCCP添加後にTMRM蛍光が有意に減少することがわかります。ここでは、DCFをロードしたラット皮質ニューロンの蛍光画像の例を示します。過酸化水素を添加する前の最初の120秒間、DCF蛍光のベースラインレベルは不変のままです。過酸化水素を添加すると、細胞体においてDCF蛍光強度の増加が認められます。DCF蛍光のタイムラプス測定では、過酸化水素処理後に上昇し、その後安定したレベルにあることが示されています。この手順では、光退色や光毒性によるアーティファクトを避けるため、低レーザー出力と高速スキャン速度を使用することが重要です。実験の成功をお祈りいたします。

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神経科学

出典: Katsalifis, A., et al.レシオメトリック指標を用いた初代ニューロンにおけるミトコンドリアグルタチオン酸化還元状態のライブイメージングJ. Vis.

レシオメトリックインジケーターを使用した初代ニューロンのミトコンドリア酸化還元状態のイメージング

サンプル間のミトコンドリア膜電位の比較は、細胞の状態に関する貴重な情報をもたらします。ミトコンドリアを単離し、蛍光を使用して阻害剤およびアンカプラーに対する反応を評価するための詳細な手順について説明します。このプロトコルの方法と有用性は、細胞培養と細胞ストレスの動物モデルの使用によって説明されています。...

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本稿では、ミトタイマーバイオセンサーを搭載したアストロサイト培養物のミトコンドリアタイムラプスイメージング法と、ミトコンドリアダイナミクス、移動性、形態、生物形成、酸化還元状態、およびターンオーバーのマルチパラメトリック解析について説明する。...

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本稿では、共焦点ライブ顕微鏡を用いた一次海馬および皮質ニューロンにおける急性摂動に対する基底レドックス状態と酸化還元反応の違いを判断するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、他の細胞タイプや顕微鏡に最小限の変更で適用できます。...

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ヒト人工多能性幹細胞における複数のミトコンドリアパラメータとその神経およびグリア誘導体のフローサイトメトリー解析

蛍光センサーと組み合わせた高解像度の呼吸法は、ミトコンドリアの酸素消費量と活性酸素種(ROS)の生成を決定します。本プロトコールは、透過処理された坐骨神経におけるミトコンドリア呼吸数およびROS産生を評価する技術を記載する。...

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HeLa細胞におけるライブイメージングを用いたミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルの蛍光ベースの定量

ミトコンドリアネットワークは非常に複雑で、解析が非常に困難です。新しいMATLABツールは、タイムラプス画像でライブ共焦点画像化されたミトコンドリアを解析しますが、出力量が大きく、個別の手動操作が必要です。この問題に対処するために、ルーチン最適化が開発され、迅速なファイル分析が可能になりました。...

アイソフォーム特異的レチノイン酸受容体による生きた神経細胞ミトコンドリアの恒常性調節の最適化された自動解析(英語)

このプロトコルは刺激された放出枯渇(STED)の顕微鏡検査を使用してミトコンドリアの微細構造の視覚化および分析のための培養されたSH-SY5Yのセルそして第一次ラットの海馬ニューロンの伝播、微分および汚損のためのワークフローを示す。...

生細胞STEDイメージングを用いた神経細胞モデルにおけるミトコンドリア内膜の微細構造の可視化

この研究では、ステップバイステップのプロトコルを説明し、サンプル調製、画像取得、データ解析など、生細胞のミトコンドリアの形態学的特性を決定するための重要な詳細を強調します。この方法は、さまざまな条件を研究するためにミトコンドリアの形態を調べるために一般的に使用されます。...

共焦点顕微鏡法を用いた生細胞のミトコンドリア形態の決定

私たちは共鳴ラマン分光法(RRS)を用いてミトコンドリアの健康状態を監視するための非侵襲的かつリアルタイムな方法を提案します。RRSを用いてミトコンドリアの酸化還元状態を定量化し、ミトコンドリア健康の指標であるレゾナンス・ラマン低調ミトコンドリア比(3RMR)を開発しました。これは従来の血液ガス分析物よりも酸素化の変化に対する反応が速いことを示しています。...

共鳴ラマン分光法を用いたミトコンドリア機能のリアルタイム・非侵襲的評価

学ぶライブイメージング法でラット皮質ニューロンのミトコンドリア膜電位と活性酸素種を定量する方法。TMRMとH2D CFDA蛍光プローブを用いて、FCCPや過酸化水素処理による動的変化をリアルタイムで解析する技術です。

ライブラット皮質ニューロンのミトコンドリア膜電位と活性酸素種の定量

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