ライブラット皮質ニューロンのミトコンドリア膜電位と活性酸素種の定量

この手順の目的は、蛍光プローブであるTMRMおよびH 2D CFDをそれぞれ用い、一次皮質ニューロンにおけるミトコンドリア膜電位と活性酸素種（ROS）のレベルを測定することです。まず、TMRMおよびH 2D CFDAのストック溶液と作動濃度溶液を調製します。次に、皮質ニューロンをTMRMおよびH 2D CFDAと共に、Thai roadsバッファー中で室温で45分間インキュベートします。

第3ステップでは、励起波長515 nm・蛍光波長517 nmおよび励起波長488 nm・蛍光波長515 nmを用いて、生存した皮質ニューロンにおけるTMRMおよびDCFの蛍光強度をイメージングします。ミトコンドリア脱共役剤であるFCCP存在下でTMRM蛍光の変化をモニタリングし、過酸化水素存在下でDCF蛍光の変化をモニタリングします。この手順の最終ステップは、データの収集、標準化、および解析です。

最終的に、FCCP処理および過酸化水素処理の前後のTMRMおよびDCFの蛍光強度の相対的なレベルを示すグラフをプロットすることで、結果を得ます。こんにちは、Joanna Koskaです。ロヨラ大学シカゴ校の私の研究室へようこそ。

本日は、ラット皮質ニューロンにおけるミトコンドリア膜電位および活性酸素種の測定方法をご紹介します。手順のデモンストレーションは、Denise Jossiが行います。こんにちは、Denise Jossiです。

本手順を用いることで、単一ミトコンドリアラベルでのミトコンドリア膜電位および単一細胞ラベルでの活性酸素種の測定が可能です。それでは、手順を開始しましょう。5 mgのTMRMを1 mLの無水ジメチルスルホキシドに溶解し、1分間ボルテックスして、10 mMのTMRMストック溶液を調製します。

次に分注し、分注したものを-20°Cで保存します。遮光し、1ヶ月以内に使用してください。続いて、4.87 mgのH 2D CFDAを1 mLの無水ジメチルスルホキシドに溶解し、10 mMのH 2D CFDAストック溶液を調製します。

同様に、1分間ボルテックスした後、分注して-20°Cで保存します。遮光し、1週間以内にラット皮質ニューロンにTMRMをロードするために使用してください。培養ニューロンをTyrode緩衝液で3回洗浄します。

次に、10 mMのTMRMストック溶液をtbで1000倍に希釈し、20 nMのTMRMを調製します。その後、tb 1 mLあたり2 µLの希釈TMRMを添加します。ニューロンをTMRMとともに、室温・暗所で45分間インキュベートします。

45分後、培養皿を顕微鏡のステージに載せ、ラット皮質ニューロンにH 2D CFDAをロードするためのイメージングを開始し、培養ニューロンをtbで3回洗浄します。次に、10 millimolarのH 2D CFDAストック溶液をtbで10倍に希釈し、2 micromolarのH 2D CFDAを調製します。その後、tb 1 milliliterあたり2 microlitersの希釈したH 2D CFDAを添加します。

その後、45分経過したところで、ニューロンをH 2D CFDAとともに室温・暗所で45分間インキュベートします。過剰な蛍光指示薬を除去するため、ニューロンをTBで4時間洗浄し、その後、ライブタイムシリーズプログラムを用いた共焦点レーザー走査顕微鏡により、TMRMでインキュベートしたニューロンのライブイメージングを行います。画像取得に要する時間を最小限に抑え、光退色を避けるため、低解像度および減衰させたレーザーパワーを適用してください。

次に、反射光を用いて、TMRMを導入した固定ニューロンのフォーカスを調整します。540 nmで励起し、570 nmで検出することでTMRMの蛍光を観察します。解像度、レーザー出力、カメラのゲイン、タイムラプス撮影の間隔など、すべてのパラメータを設定した後、カメラの検出ゲインを飽和レベルの直下に設定します。

実験間でこれらの設定を変更しないでください。次に、視野を移動します。1 µMのFCCPや2 µg/mLのオリゴマイシンなどの刺激を用いてΔΨMの変化をテストするための画像収集を開始します。これにより、ミトコンドリア膜電位がそれぞれ顕著に脱分極または過分極します。

これらの変化は、FCCPを用いた場合にはベースラインの蛍光強度と比較してTMRM蛍光強度の低下として、あるいはTMRM蛍光強度の増加として反映されます。H 2D CFDAでインキュベートしたニューロンのライブイメージングを行う場合は、まず培養皿を顕微鏡のステージに載せ、反射光を用いて細胞のピントを調整します。4 88 nanometersの励起波長およびfive 15 nanometersの蛍光波長でDCF蛍光を観察してください。

次に、レーザー出力を5～7%に調整し、ゲインを検出し、解像度を256×256に設定します。これらの設定は実験間で変更しないでください。その後、ライブ画像を取得するための周波数を設定します。

タイムシリーズプログラムを使用して、新しい視野を選択し、ROSレベルの変化を検出するための画像取得を開始します。細胞を100～200 µMの過酸化水素で処理します。これにより、ベースラインレベルと比較してDCFの蛍光強度が増加します。

LSMプログラムの関心領域（ROI）ツールを使用して、領域を選択します。次に、画像内の細胞において、ミトコンドリア領域のROIまたは細胞体全体のROIを選択します。これにより、それぞれTMRMまたはROSの蛍光強度を測定します。

細胞に隣接する領域を選択します。バックグラウンドの蛍光強度を算出するために、数回測定を行います。Microsoft Excelを用いて、各タイムポイントにおける各細胞の関心領域の平均蛍光強度から、平均バックグラウンド蛍光強度を差し引き、平均バックグラウンド強度を算出します。バックグラウンド強度を差し引いた後、TMRMまたはDCFの蛍光強度をベースライン蛍光で正規化します。

この数式を用いて、Sigma plotプログラムで蛍光強度の経時変化を示すプロットを作成します。以下は、TMRMでインキュベートしたラット皮質ニューロンの蛍光画像の例です。ミトコンドリア脱共役剤であるF-C-C-P-Aを添加すると、ミトコンドリアの脱分極が起こり、TMRMの蛍光強度が低下します。

FCCPを添加する前は、TMRMの基線蛍光レベルは安定しています。TMRM蛍光の時間的変化を定量的に分析すると、FCCP添加後にTMRM蛍光が有意に減少することがわかります。以下は、DCFをロードしたラット皮質ニューロンの蛍光画像の例です。

過酸化水素を添加する前の最初の120秒間、DCF蛍光のベースラインレベルは不変のままです。過酸化水素を添加すると、細胞体においてDCF蛍光強度の増加が見られます。DCF蛍光のタイムラプス測定では、過酸化水素処理後に上昇した定常的なレベルが示されています。

この手順では、光退色や光毒性によるアーティファクトを避けるため、低いレーザー出力と速い走査速度を使用することが重要です。実験の成功を願っております。