ライブラット皮質ニューロンのミトコンドリア膜電位と活性酸素種の定量

この手順の目標は、蛍光プローブ、TMRM、およびH 2D CFDをそれぞれ使用して、一次皮質ニューロンのミトコンドリア膜電位と活性酸素種のレベルを決定することです。これは、最初にTMRMおよびH 2D CFDAのストックと作業濃度を準備することによって達成されます。第2ステップは、皮質ニューロンをTMRMおよびH 2D CFDAと室温で45分間タイのロードバッファーでインキュベートすることです。

3番目のステップは、5 15 5 17ナノメートルと4 88 5 15ナノメートルの励起発光をそれぞれ使用して、生きた皮質ニューロンのTMRMとDCFの蛍光強度を画像化することです。蛍光の TMR の変化は、ミトコンドリア unco FCCP の存在下で監視されますが、DCF 蛍光の変化は過酸化水素の存在下で監視されます。この手順の最後のステップは、データの収集、正規化、および分析です。

最終的には、FCCP処理と過酸化水素処理の前後のTMRMとDCFの蛍光強度の相対レベルを示すグラフをプロットすることで結果が得られます。こんにちは、ジョアンナ・コスカです。シカゴのロヨラ大学の私の研究室へようこそ。

本日は、ラット皮質ニューロンのミトコンドリア膜電位と活性酸素種の測定方法をご紹介します。この手順はdhiによって示されます。こんにちは、デニス・ジョッシです。

この手順により、ミトコンドリア膜電位を単一ミトコンドリア標識で測定し、活性酸素種を単一細胞標識で測定することができます。それでは始めましょう。5ミリグラムのTMRMを1ミリリットルの無水ジメチルスルフオキシドボルテックスに1分間溶解することにより、10ミリモルのTMRMストックを準備します。

次に、アリコートを作成し、アリコートを摂氏マイナス20度で保存します。光から保護し、1か月以内に使用してください。次に、4.87ミリグラムのH 2D CFDAを1ミリリットルの無水ジメチルスルフ酸化物に溶解することにより、10ミリモルのH 2D CFDAストックを調製します。

同様に、1分間渦巻き、次にアリコートを作り、摂氏マイナス20度で保存します。光から保護し、1週間以内に最初にラット皮質ニューロンにTMRMをロードするために使用してください。培養したニューロンをチロバッファーで3回洗浄します。

次に、10ミリモルTMRMストックをtbで1000倍に希釈することにより、20ナノモルTMRMを調製します。次に、TB1ミリリットルあたり2マイクロリットルの希釈TMRMを追加します。TMRMとニューロンを室温の暗所で45分間インキュベー

45分後、培養皿を顕微鏡のステージに取り付け、イメージングを開始してラット皮質ニューロンにH 2D CFDAをロードし、培養ニューロンをTBで3回洗浄します。次に、10ミリモルのH 2D CFDAストックをtbで10倍に希釈して、H 2D CFDAの2マイクロモルを調製します。次に、TB1ミリリットルあたり2マイクロリットルの希釈H 2D CFDAを追加します。

次に、ニューロンをH 2D CFDAと45分間、暗所、室温で45分間インキュベートします。TMRM共焦点レーザー走査型顕微鏡でインキュベートされたニューロンのライブイメージングを行うための画像を取得する前に、ニューロンをTBで4回洗浄して余分な蛍光インジケーターを除去します。低解像度で減衰したレーザー出力を適用して、画像の取得に必要な時間を最小限に抑え、写真の退色を防ぎます。

次に、TMRMをロードした搭載されたニューロンのピントを反射光で調整します。TMRMの蛍光を、14ナノメートルの5つの照明と70ナノメートルの5つの検出により調べます。解像度、レーザーパワー検出、カメラのゲイン、画像を取得するためのタイムラプス間隔を含むすべてのパラメーターを設定したら、カメラの検出ゲインを飽和レベルのすぐ下に設定します。

これらの設定は、実験間で変更しないでください。次に、フィールドを変更します。1マイクロモルのFCCPや1ミリリットルあたり2マイクログラムのオリゴマイシンなど、Delta PSY M刺激の変化をテストするための画像の収集を開始し、ミトコンドリア膜電位をそれぞれ大幅に脱分極または過分極させることができます。

これらの変化は、FCCP の場合のベースライン蛍光強度と比較した TMRM 蛍光強度の減少、または TMRM 蛍光強度の増加によって反映されます。LIGA myin sinの場合、H 2D CFDAでインキュベートしたニューロンのライブイメージングを行うには、まず培養皿を顕微鏡のステージに載せ、反射光を用いて細胞の焦点を調整します。DCF蛍光を4 88ナノメートルで励起し、15ナノメートルを5個で発光して調べます。

次に、レーザー出力を5〜7%に調整し、ゲインと分解能が2 56 x 2 56であることを検出します。これらの設定は、実験間で変更しないでください。次に、ライブ画像を取得する頻度を設定します。

時系列プログラムを使用して、新しいフィールドを選択し、画像の取得を開始して、OSレベルの変化を検出します。細胞を100〜200マイクロモルの過酸化水素で処理します。これは、ベースラインレベルと比較した DCF 蛍光強度の増加に反映されます。

LSM プログラムの関心領域ツールを使用して、領域を選択します。次に、ミトコンドリア領域からのROIまたは画像細胞内の細胞体全体からのROIを選択します。TMRMまたはROSの蛍光強度をそれぞれ測定します。

セルの横にある領域を選択します。バックグラウンド蛍光強度を計算するには、いくつかの測定を行い、平均バックグラウンド強度を計算するには、Microsoft Excelを使用して、各時点の各セルの関心領域の平均蛍光強度から平均バックグラウンド蛍光強度を差し引きます。バックグラウンド強度を差し引いた後、TMRMまたはDCFの蛍光強度をベースライン蛍光に正規化します。

この式を使用して、シグマプロットプログラムを使用して、時間の経過に伴う蛍光強度の変化を示すプロットを生成します。これは、TMRMとインキュベートされたラット皮質ニューロンの蛍光画像の例です。F-C-C-P-Aミトコンドリアuncoの添加は、ミトコンドリアの脱分極とTMRM蛍光強度の喪失につながります。

ベースラインのTMRM蛍光レベルは、FCCPを添加する前は安定しています。TMRM蛍光の経時変化を定量的に分析すると、FCCPの添加後にTMRM蛍光が有意に減少することが示されています。これは、DCFをロードしたラット皮質ニューロンの蛍光画像の例です。

ベースラインのDCF蛍光レベルは、過酸化水素の適用前の最初の120秒間は変化しません。過酸化水素を添加すると、細胞体内のDCF蛍光強度が増加します。DCF蛍光のタイムラプス測定では、過酸化水素処理後に増加した安定したレベルが示されています。

この手順では、光の漂白や光毒性によるアーティファクトを避けるために、低レーザー出力と高速スキャン速度を使用することを覚えておくことが重要です。あなたの実験で幸運を祈ります。