Name: イモリのレンズ再生を研究するために培養虹彩色素上皮細胞のためのシステム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 学ぶイモリの虹彩色素上皮細胞培養法によるレンズ再生の研究。組織分離、2週間の培養、細胞移植、組織学的解析の手法を解説。再生医療への応用可能性を示す実験手順です。

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1。アイリスの細胞培養<ol><li> 7イモリ（PBSで製造した3 - アミノ安息香酸、メタンスルホン酸エチル0.1％麻酔）とカルシウムマグネシウムフリーハンクス溶液（CMF）の位置から眼球を収集する。 </li><li>手袋を変更し、組織培養フードで働いています。 </li><li> 3秒間Lugol's - EtOH中で目のボールを滅菌する。 </li><li> CMFで2回洗浄する。 </li><li>ハンクスに目を移し、解剖を始める。 </li><li>アイリス - 角膜の複合体を摘出し、神経網膜を削除します。 </li><li>ハンクスの新しい皿に複合体を移す。 </li><li>背側と腹側半分に＃15メス、別々の複合体を使用する。 </li><li>アイリスの断片を（最初の腹側）を取り外し、1 mlのL - 15を含む皿の場所。 </li><li> 15％（150 UL）ディスパーゼの量を（7.5単位/ mlの濃度）を追加します。 </li><li> 27 2時間° C（パラフィルムでラップ皿）でインキュベートする。 </li><li>ストロマ（27において配置トリプシン溶液° C）からIPE細胞を分離する。 </li><li> 1.5 mlチューブにIPE細胞を回収。 </li><li> 2分間RT（室温）で1000回転で遠心分離、上清を取り除く。 </li><li> 1ミリリットルハンクスと2分間、室温で1000rpmで遠心機で洗って、上清を取り除く。 </li><li> 1ミリリットルトリプシン溶液を追加し、27℃で2時間インキュベート℃に</li><li> 2分間、室温で1000rpmで遠心分離は、トリプシンを削除します。 </li><li> 2分間1000rpmで遠心分離、洗浄するために1 mlのL - 15を追加。 </li><li>ゆっくりと上下に800 ulのL - 15、ピペット〜10回（12倍以上の付着を減少させる）を追加します。 </li><li>プレート27で24ウェルコラーゲンコーティングプレートとインキュベート上IPE細胞℃で2週間（通常は、4背、4腹の井戸は7イモリから得られる）のため。 </li><li>この段階で細胞が遺伝子のトランスフェクションまたは誘引し、又はレンズの再生を妨げることでその役割を決定する要因との治療に適している。 </li></ol> 2。アイリスの細胞の凝集<ol><li>虹彩の細胞を含むプレートに400μlの培地、優しくスワールにディスパーゼ溶液を20μlの追加。 </li><li> 27℃で一晩培養する。 </li><li>上下に優しくピペット細胞を取り除くために、 </li><li>エッペンドルフチュー​​ブ、室温で1000rpmで2分間スピンに場所細胞。 </li><li> 1ミリリットルの完全なL - 15室温で1000rpmで、スピン2分を追加することによって培地と洗浄液を除去、培地を取り除く。 </li><li>集約あたりの2000-7000の細胞を使用してください。各チューブに集約あたり200μlのL - 15を追加。 </li><li>新しいエッペンドルフチュー​​ブに分割細胞（200μl）を。 </li><li>室温で2分間、1000rpmでスピン。 </li><li> 27で48時間インキュベート℃に</li></ol> 3。まとめたところ細胞の移植<ol><li>イモリの目の角膜のスリットを作り、レンズを取り外します。 </li><li>レンズを除去した後、ちょうど目の腹側の角膜組織の下にIPE細胞の集合体を配置。 </li><li>イモリは、それらがレンズを再生成できるようにするか月間保持されます。 </li></ol> 4。イモリの目の埋め込み<ol><li>アグリゲートを移植したイモリの目を削除し、リン酸塩に置くには、緩衝食塩水（PBS）。 </li><li>少なくとも4時間または一晩4℃で4％パラホルムアルデヒドで固定してください。 </li><li> 30分間、PBS、4℃で洗浄する。 </li><li> 4℃、30分：0.85％生理食塩水でそれを扱う。 </li><li> 15分間RT：生理食塩水/エタノール（1:1）で洗浄する。 </li><li> 70％エタノールで洗う：RT、15分。一度それを繰り返します。 </li><li> 85％エタノールで洗浄し、室温にて95％エタノール、30分ごとに</li><li> 100％エタノールで洗う：RT、30分。一度それを繰り返します。 </li><li> 4℃または継続。 </li><li> 100％キシレンで洗浄する：RT、30分。一度それを繰り返します。 </li><li> 60 ° C、45分：キシレン/パラフィン（1:1）で扱います。 </li><li> 60 ° C、20分：100％パラフィンで処理。それをあと2回繰り返します。 </li><li>金型を埋め込むに埋め込む。 </li></ol> 5。セクショニング<ol><li>ミクロトームを使用して埋め込まれた目の15μmの切片を作製します。 </li><li>ゼラチンコートしたスライド上に目のセクションを配置し、暖かくスライド上に置いたまま。 </li></ol> 6。染色<ol><li> 10分間、キシレンでスライドを置きます。もう一度それを繰り返します。 </li><li>の水和物：100％、95％、80％、70％、1分ごとに30％エタノール</li><li>分間超純水ですすいでください。 </li><li> 15分間PBSで洗浄する。 </li><li> 15分間PBST（0.2％PBSでトリトン- X 100）で洗浄する。 </li><li> 15分間PBSで洗浄する。 </li><li>時間溶液（1​​0％ヤギ二次抗体）をブロッキングの場所。 </li><li>一晩一次抗体の場所。 </li><li> 15分間PBSで一次抗体を洗浄してください。 </li><li> 15分間PBSTで洗浄する。 </li><li> 15分間PBSで洗浄する。 </li><li>暗所で2時間二次抗体の代わりに（PBSで1:100希釈）。 </li><li> 15分ごとにしてからマウントするためにPBS、PBST、そしてPBSで洗浄する。 </li><li>蛍光顕微鏡下でスライドを観察。 </li></ol> 7。代表的な結果： 培養イモリIRのこの手順細胞は背側と腹側IPE細胞の再生の可能性を研究するために利用されているです。また、イモリの眼のレンズの再生メカニズムに向けて貢献する特定の遺伝子を研究することも可能です。細胞を2週間培養されているとき（ 図1）これらはレンズの再生でその機能を調べるために遺伝子によってトランスフェクトすることができます。特に興味深いのは、腹側の絞りを誘発するかもしれない遺伝子があります。腹側アイリスの細胞がレンズ（ 図2）候補遺伝子の誘導機能に分化形質転換することができないので研究することができる。過去には、このテクニックを使用して我々は6 - 3はオーバーレチノイン酸のレンズの誘導の存在下で発現されたときに腹側絞り6から観察されたことが示されている。 図3に我々は腹側アイリスの集合体は背側アイリス（矢印）からホストのレンズよりも差が十分に成長し、分化したレンズ（矢印）、を生じさせたことがわかります。 <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 ）背虹彩色素上皮細胞は2週間の期間のためにin vitroで培養した。 b）の腹側の虹彩色素上皮細胞は2週間の期間のためにin vitroで培養した。色素沈着は、背側と腹側の両方虹彩の細胞でこの段階に続くことに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。培養IPE細胞の再生能力。背IPE細胞の集合体（矢頭）からA）レンズの誘導。背アイリス（矢印）、ディからレンズの誘導ホスト：背アイリス、viの：腹側アイリス、ル：レンズ上皮、LF：レンズ繊維。腹IPE細胞の集合体（矢頭）からレンズの誘導のb）の欠如。背アイリス（矢印）からホストのレンズの誘導。 <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。腹骨材からのレンズの誘導は、6 - 3をトランスフェクトし、レチノイン酸で処理した。背アイリス（矢印）からホストのレンズの誘導。腹骨材（矢頭）からレンズの誘導。

<ol><li>Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regeneration in vertebrates.</a> Dev Biol. 221, 273-284 (2000).</li>
<li>Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+newt%27s+eye+view+of+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A newt's eye view of lens regeneration.</a> Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).</li>
<li>Del Rio-Tsonis, K., Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+regeneration+at+the+molecular+age%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Eye regeneration at the molecular age.</a> Dev. Dyn. , 226-2211 (2003).</li>
<li>Okamoto, M., Ito, M., Owaribe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+between+dorsal+and+ventral+iris+in+lens+producing+potency+in+normal+lens+regeneration+is+maintained+after+dissociation+and+reaggregation+of+cells+from+the+adult+newt%2C+Cynops+pyrrhogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Difference between dorsal and ventral iris in lens producing potency in normal lens regeneration is maintained after dissociation and reaggregation of cells from the adult newt, Cynops pyrrhogaster.</a> Develop Growth Differ. 40, 11-18 (1998).</li>
<li>Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+system+for+functional+gene+analysis+in+adult+amphibian+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection system for functional gene analysis in adult amphibian lens regeneration.</a> Develop Growth Differ. 43, 361-370 (2001).</li>
<li>Grogg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+inhibition-driven+regulation+of+six-3+underlies+induction+of+newt+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BMP inhibition-driven regulation of six-3 underlies induction of newt lens regeneration.</a> Nature. 438, 858-862 (2005).</li>
<li>Nakamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+in+Newt+Lens+Regeneration%3A+Specific+Control+of+Proliferation+and+Evidence+for+miRNA+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">miRNAs in Newt Lens Regeneration: Specific Control of Proliferation and Evidence for miRNA Networking.</a> PLoS One. 5, e12058-e12058 (2010).</li>
<li>Madhavan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax-6+in+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The role of Pax-6 in lens regeneration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14848-14853 (2006).</li>
<li>Maki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-type+linker+histone+B4+is+required+for+transdifferentiation+of+somatic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Oocyte-type linker histone B4 is required for transdifferentiation of somatic cells in vivo.</a> FASEB J. 24, 3462-3467 (2010).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このプロトコルは、イモリのレンズ再生のメカニズムを研究するためのin vitroの系を確立しています。凝集するので（どちらか背側または腹側は誠実には再生、この手法の間に生体内での行動でイモリの遺伝子導入に必要と関数のゲインだけでなく、機能の実験7,8,9の損失のために使用することができる途方もない労力を軽減することができる従ってください。また、 、全体としての集合体または虹彩は容易に増殖因子で処理し、このプロトコルで説明されているようにその効果を調べることができます。例えば、BMP経路の役割はこのテクニック6を使用して検討されている。

<table><tbody><tr><td>ルゴール液&amp;rsquo;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6146</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>3-アミノ安息香酸エチル メタンスルホン酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-10521</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン 1:250</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>L-15 ( Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4386</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>硫酸カナマイシン</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>100x, 15160</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone (アンフォテリシンB溶液)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル コラーゲンコートプレート</td><td>BD Biosciences</td><td>354408</td><td></td></tr></tbody></table>

イモリのレンズ再生を研究するために培養虹彩色素上皮細胞のためのシステム

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

イモリやアホロートルのようなサンショウウオは、四肢、脊髄、眼、脳、心臓、顎1と尾など、その失われた身体の部分の多くを再生成する能力を有する。具体的には、イモリは、そのレンズの再生能力のための固有のものです。レンズの取り外し時には、背側の虹彩のIPE細胞は水晶体細胞への分化形質転換すると最終的に約月に2,3の新しいレンズを形成する。再生のこのプロパティは、腹側の虹彩細胞で展示されることはありません。虹彩の細胞の再生の可能性は 、in vitro培養IPE細胞での移植を行うことによって調べることができます。培養には、背側と腹側の虹彩細胞が最初に目から絶縁されており、2週間の期間（ 図1）に別々に培養した。これらの培養細胞はreaggregatedとイモリの目に戻って注入される。過去の研究では、腹骨材は4,5（ 図2）このように生体内でのプロセスにおいて 、recapitulating、レンズを形成しないのに対し、背側再集合させるが、そのレンズ形成能力を維持することが示されている。背側と腹側の虹彩細胞の再生の可能性を決定するこのシステムは、レンズの再生に関与する遺伝子やタンパク質の役割を研究するに非常に便利です。

イモリでは、レンズの絞り色素上皮細胞（IPEs）の分化転換によって背側の虹彩から常に再生成されます。ここでは、イモリの眼への文化背側と腹イモリIPE細胞とその移植する手順を説明します。移植細胞は、組織切片と免疫組織化学によって研究されています。

イモリやアホロートルなどのサンショウウオは、四肢、脊髄を含む尾、眼、脳など、失われた多くの身体部位を再生させる能力を有している。

この手順の全体的な目的は、イモリにおける水晶体再生を研究するために、虹彩色素上皮細胞を培養することです。まず、イモリを睡眠溶液で麻酔し、眼球を摘出することでこれを達成します。本手順の第2段階は、まず網膜組織を除去し、次いで角膜虹彩断片を背側と腹側の半分に切断することで、眼組織から虹彩色素上皮細胞を単離することです。その後、虹彩細胞を基質から分離し、in vitroで2週間培養します。2週間の培養後、IPE細胞を凝集させ、あらかじめ最適化されたレシピエントへと移植します。1か月の治癒期間後、組織学的に背側および腹側IPE細胞の水晶体再生能が明らかになります。この手法の視覚的な提示は、微小解剖および手術における熟練した技術が多数必要とされるため、習得が困難な細胞培養および移植のステップにおいて極めて重要です。まず、少なくとも7匹のヌードマウスを0.1%エチル-3-アミノベンゾエートメタンスルホン酸で麻酔します。ピンセットと手術用ハサミを用いて、眼瞼と結膜を合わせて切除し、眼球を外科的に摘出します。その後、視神経を切断します。次に、摘出した眼を速やかにフードへ移動させ、ルゴのエタノールで3秒間滅菌します。その後、カルシウムおよびマグネシウム不含のハンクス溶液で眼を2回洗浄します。新鮮なハンクス溶液に移し、解剖を続けます。メスを用いて眼球に切れ込みを入れます。次に、はさみで角膜縁に沿って切開します。水晶体を取り除き、残った網膜組織を強膜とともに切り離します。15番のメスを用いて、虹彩角膜複合体を新鮮なHanks溶液が入ったディッシュに移します。複合体を背側半分と腹側半分に分離します。背側虹彩は強膜上の黒い斑点があることで、腹側虹彩はV字型の切り込みがあることで識別されます。腹側虹彩と背側虹彩を分離します。1 mLのL 15溶液が入った35 mmディッシュに虹彩断片を回収します。背側と腹側の半分は、別々のディッシュに分けて保持してください。次に、150 µLのdispa溶液をディッシュに加え、27 °Cで2時間インキュベートします。ストロマからIPE細胞を回収します。ピンセットを用いて、回収したすべての組織断片からIPE細胞をそっと剥離させます。次に、IPE細胞を1.5 mLチューブに移し、室温で1000 RPMで2分間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを1 mLのHanks溶液で再懸濁し、細胞を分離するために遠心分離を繰り返します。Hanks溶液を捨て、ペレットを再懸濁します。1/250に希釈したトリプシン溶液1 mL中で、27 °Cで2時間インキュベートします。細胞を洗浄するため、遠心分離してトリプシンを除去します。L 15溶液1 mLを加え、再度遠心分離します。この洗浄操作をもう一度繰り返し、新鮮なL 15溶液800 µLに置換し、細胞を溶液中に緩やかにピペッティングして懸濁させます。その後、コラーゲンでコーティングした24ウェルプレートに細胞を播種します。通常、7個のNから得られる収量は、背側細胞4ウェルおよび腹側細胞4ウェルです。2週間後、ディッシュを27°Cでさらに2週間インキュベートします。ここで示しているように、IPEは遺伝子を導入することで、水晶体再生におけるその機能を解析することが可能です。2週間培養した腹側IPE細胞は、背側細胞と同様の形態を示しています。背側および腹側の両方の虹彩細胞において、この段階まで色素沈着が持続することに注目してください。IPE細胞を移植する前に、20 µLのdyseを400 µLの新鮮な培養培地とともに細胞に加え、プレートを緩やかに回して混ぜた後、27 °Cのインキュベーター内で一晩静置して細胞を凝集させる必要があります。翌日、緩やかなピペッティングで細胞を剥離させ、1.5 mLチューブに移します。次に、チューブを遠心分離し、上清を1 mLのL 15に置き換えることで細胞を洗浄します。この操作を2回繰り返します。細胞懸濁液 10 µLを用いて、標準的な方法で細胞数を算出します。算出後、凝集塊1つあたり3,000から5,000個の細胞を200 µLのL 15で調製します。次に細胞を遠心分離し、48時間インキュベートします。27 °Cで、細胞をレシピエント動物に移植することができます。まず、成体のマウスを睡眠溶液で、動きが止まるまで麻酔します。次に、メスを用いて眼の角膜に切開を加えます。その後、ピンセットを使用して水晶体を取り出します。水晶体を除去した後、IPE細胞凝集体を眼の腹側にある角膜組織の直下に配置します。その後、イモリを別の容器に戻し、治癒させます。この期間は、治癒中の組織を傷つけないよう、イモリを慎重に扱ってください。移植された細胞が新しい水晶体に再生されるまでには1か月かかります。1か月後、凝集細胞を移植した新しい眼を取り出し、組織を固定します。標準的な脱水プロトコルを用いて、固定した組織を包埋剤に包埋し、15 µmの厚さで切片を作成して適切に染色します。凝集塊を眼のレンズ部位に移植した後、背側IPE細胞由来の凝集塊は新たなレンズ形成を誘導します。腹側を移植した眼においても、背側虹彩からのホストレンズ誘導が観察されます。腹側IPE細胞から調製した凝集塊ではレンズ誘導は観察されませんが、six3遺伝子を過剰発現させ、レチノイン酸を共存させると、腹側凝集塊からのレンズ誘導が観察されます。また、眼の背側虹彩からの宿主水晶体誘導が、その発達後に観察されます。この手法により、水晶体再生分野の研究者が、さまざまな遺伝子の役割を新たな視点から探求する道が開かれました。

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