イモリのレンズ再生を研究するために培養虹彩色素上皮細胞のためのシステム

この手順の全体的な目的は、イモリにおける水晶体再生を研究するために、虹彩色素上皮細胞を培養することです。まず、イモリを睡眠溶液で麻酔し、眼球を摘出することでこれを達成します。

本手順の第2段階は、まず網膜組織を除去し、次いで角膜虹彩断片を背側と腹側の半分に切断することで、眼組織から虹彩色素上皮細胞を単離することです。その後、虹彩細胞を基質から分離し、in vitroで2週間培養します。2週間の培養後、IPE細胞を凝集させ、あらかじめ最適化されたレシピエントへと移植します。

1か月の治癒期間後、組織学的に背側および腹側IPE細胞の水晶体再生能が明らかになります。この手法の視覚的な提示は、微小解剖および手術における熟練した技術が多数必要とされるため、習得が困難な細胞培養および移植のステップにおいて極めて重要です。まず、少なくとも7匹のヌードマウスを0.1%エチル-3-アミノベンゾエートメタンスルホン酸で麻酔します。ピンセットと手術用ハサミを用いて、眼瞼と結膜を合わせて切除し、眼球を外科的に摘出します。その後、視神経を切断します。

次に、摘出した眼を速やかにフードへ移動させ、ルゴのエタノールで3秒間滅菌します。その後、カルシウムおよびマグネシウム不含のハンクス溶液で眼を2回洗浄します。新鮮なハンクス溶液に移し、解剖を続けます。

メスを用いて眼球に切れ込みを入れます。次に、はさみで角膜縁に沿って切開します。水晶体を取り除き、残った網膜組織を強膜とともに切り離します。

15番のメスを用いて、虹彩角膜複合体を新鮮なHanks溶液が入ったディッシュに移します。複合体を背側半分と腹側半分に分離します。背側虹彩は強膜上の黒い斑点があることで、腹側虹彩はV字型の切り込みがあることで識別されます。

腹側虹彩と背側虹彩を分離します。1 mLのL 15溶液が入った35 mmディッシュに虹彩断片を回収します。背側と腹側の半分は、別々のディッシュに分けて保持してください。

次に、150 µLのdispa溶液をディッシュに加え、27 °Cで2時間インキュベートします。ストロマからIPE細胞を回収します。ピンセットを用いて、回収したすべての組織断片からIPE細胞をそっと剥離させます。

次に、IPE細胞を1.5 mLチューブに移し、室温で1000 RPMで2分間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを1 mLのHanks溶液で再懸濁し、細胞を分離するために遠心分離を繰り返します。Hanks溶液を捨て、ペレットを再懸濁します。

1/250に希釈したトリプシン溶液1 mL中で、27 °Cで2時間インキュベートします。細胞を洗浄するため、遠心分離してトリプシンを除去します。L 15溶液1 mLを加え、再度遠心分離します。この洗浄操作をもう一度繰り返し、新鮮なL 15溶液800 µLに置換し、細胞を溶液中に緩やかにピペッティングして懸濁させます。その後、コラーゲンでコーティングした24ウェルプレートに細胞を播種します。

通常、7個のNから得られる収量は、背側細胞4ウェルおよび腹側細胞4ウェルです。2週間後、ディッシュを27°Cでさらに2週間インキュベートします。ここで示しているように、IPEは遺伝子を導入することで、水晶体再生におけるその機能を解析することが可能です。

2週間培養した腹側IPE細胞は、背側細胞と同様の形態を示しています。背側および腹側の両方の虹彩細胞において、この段階まで色素沈着が持続することに注目してください。IPE細胞を移植する前に、20 µLのdyseを400 µLの新鮮な培養培地とともに細胞に加え、プレートを緩やかに回して混ぜた後、27 °Cのインキュベーター内で一晩静置して細胞を凝集させる必要があります。

翌日、緩やかなピペッティングで細胞を剥離させ、1.5 mLチューブに移します。次に、チューブを遠心分離し、上清を1 mLのL 15に置き換えることで細胞を洗浄します。この操作を2回繰り返します。細胞懸濁液 10 µLを用いて、標準的な方法で細胞数を算出します。

算出後、凝集塊1つあたり3,000から5,000個の細胞を200 µLのL 15で調製します。次に細胞を遠心分離し、48時間インキュベートします。27 °Cで、細胞をレシピエント動物に移植することができます。

まず、成体のマウスを睡眠溶液で、動きが止まるまで麻酔します。次に、メスを用いて眼の角膜に切開を加えます。その後、ピンセットを使用して水晶体を取り出します。

水晶体を除去した後、IPE細胞凝集体を眼の腹側にある角膜組織の直下に配置します。その後、イモリを別の容器に戻し、治癒させます。この期間は、治癒中の組織を傷つけないよう、イモリを慎重に扱ってください。

移植された細胞が新しい水晶体に再生されるまでには1か月かかります。1か月後、凝集細胞を移植した新しい眼を取り出し、組織を固定します。標準的な脱水プロトコルを用いて、固定した組織を包埋剤に包埋し、15 µmの厚さで切片を作成して適切に染色します。

凝集塊を眼のレンズ部位に移植した後、背側IPE細胞由来の凝集塊は新たなレンズ形成を誘導します。腹側を移植した眼においても、背側虹彩からのホストレンズ誘導が観察されます。腹側IPE細胞から調製した凝集塊ではレンズ誘導は観察されませんが、six3遺伝子を過剰発現させ、レチノイン酸を共存させると、腹側凝集塊からのレンズ誘導が観察されます。

また、眼の背側虹彩からの宿主水晶体誘導が、その発達後に観察されます。この手法により、水晶体再生分野の研究者が、さまざまな遺伝子の役割を新たな視点から探求する道が開かれました。