3D楕円体の生成のための簡単​​なハンギングドロップ細胞培養プロトコル

この実験の目的は、3D組織様のステロイドを生成することです。まず、培養細胞を回収し、単一細胞懸濁液を作成します。次に、細胞懸濁液の液滴を、組織培養皿の反転させた蓋の裏側に滴下します。

次に、蓋を反転させて保湿チャンバーに被せます。最後のステップとして、凝集塊を形成させるために、吊り滴を24から48時間インキュベートします。その後、これらを振盪水槽に移し、さらに最大5日間インキュベートすることができます。

最終的に、凝集アッセイ、組織表面の対称性、またはエピ蛍光顕微鏡観察を通じて、凝集体の凝集力や細胞分別の違いを示す結果を得ることができます。例えば、従来の2D組織培養などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、3Dで培養された細胞の方が、組織環境内の細胞が経験する細胞間相互作用をより密接に模倣できることです。ここでは、PI（研究主宰者）であっても実行できるほど簡単であることを示すため、この手法を実演します。

本実験を開始するために、コンフルエンシーが90%に達した接着細胞を回収します。まず、培地を吸引し、セルシートをPBSで2回洗浄します。次に、PBSを吸引し、0.05%トリプシン-EDTA溶液2 mLを単層細胞の上にピペッティングします。

プレートを37 °Cの組織培養インキュベーターに入れ、細胞が剥離するまでインキュベートします。次に、プレートをインキュベーターから取り出し、完全培地2 mLを加えて処理を停止させます。

5 mLピペットを使用して、細胞が完全に懸濁するまで混合液をピペッティングします。次に、細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移します。10 mg/mLのDNA溶液を40 µL、細胞懸濁液にピペッティングし、室温で5分間インキュベートします。

細胞懸濁液を短時間ボルテックスし、200 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、上清を吸引して廃棄し、ペレットを1 mLの完全培地で再懸濁して洗浄します。遠心分離を繰り返し、ペレットを1 mLの完全培地で再懸濁します。

次に、自動細胞計数器または血球計数器を用いて細胞数を数えます。培地を用いて、細胞懸濁液の最終濃度を2.5 × 10⁶ cells/mLに調整します。その後、吊り滴法の作製へと進みます。

60 mmの組織培養ディッシュから蓋を取り外し、ディッシュの底に5 mLのPBSをピペッティングして、加湿チャンバーを準備します。プレートの蓋を逆さまにし、蓋の裏側に細胞懸濁液を20~10 µLのドロップとしてピペッティングします。この際、ドロップ同士が接触しないよう、十分な間隔を空けて配置してください。

ドロップ培養液を含む蓋を、PBSが入ったディッシュの底にそっと戻します。培養プレートを組織培養インキュベーターに入れます。37 °C、5% carbon dioxide、95% humidityに設定し、一晩インキュベートします。

液滴を毎日観察し、細胞シートまたは凝集塊が形成されるまで培養を継続します。細胞シートまたは凝集塊が形成されたら、3 mLの完全培地を含むラウンドボトムガラスシェーカーフラスコに転移させます。細胞シートまたは凝集塊を含むフラスコを、振盪恒温槽で培養します。

37 °C、5% 二酸化炭素条件下で約 24 時間維持し、解剖顕微鏡下でステロイドの形成が確認できるまで待ちます。ステロイドが形成された後、実験的操作がステロイド形成に及ぼす影響を、記載されたプロトコルの手順に従って定量化できます。また、あらかじめ添加しておいた蛍光色素の膜へのインターカレーションを、蛍光顕微鏡を用いて観察することが可能です。

この明視野顕微鏡画像は、吊り滴法を用いて18時間培養した後のラット前立腺癌MLL細胞の凝集を示しています。この画像は、吊り滴法を用いて18時間培養した後に形成された2つ目のMLL細胞凝集塊を示しています。これらの細胞は25 µMのMEK阻害剤PD 9 8 0 5 9の存在下で培養されており、その結果、細胞凝集塊は大幅に凝縮されています。

ここでは、MEK阻害剤で処理したMLL懸垂滴培養における凝集体のサイズと、未処理のコントロール凝集体のサイズの差を示します。アスタリスクは、P値が0.0001未満の統計的に有意な差を表しています。未処理の凝集体とMEK阻害剤処理した凝集体との間で学生t検定を行った結果、MEK阻害剤処理によって凝集体が有意に小さく、より緻密になることが示唆されました。

この画像はNikon Smz 800実体顕微鏡を用いて撮影されたもので、ニワトリ胚肝細胞を吊り滴培養で18時間、その後37 °Cの振盪恒温水槽で48時間培養して形成されたステロイド様構造を示しています。この共焦点顕微鏡画像は、吊り滴法を用いて特定の細胞集団を共培養した際に起こるソーティングアウト挙動を実証しています。吊り滴培養に移行する前に、ニワトリ胚肝細胞をPKH2膜間コーティング色素で染色しました。

心細胞をPKH 26で染色しました。次いで、細胞懸濁液を混合し、ハンギングドロップ法に供しました。18時間の培養後、37 °Cの振盪水槽内で48時間インキュベートしました。

光学切片から、黄色に染色された心細胞が肝細胞に包まれていることがわかります。ここでは青色に擬似着色されており、表面にNCAを発現する2つのnardiおよび形質転換L細胞クローンが、2.4対1の比率で、等量混合した蛍光膜標識色素のPKH2およびPKH26で染色され、前述と同様に吊下滴法で培養されました。

この例では、緑色に擬似着色された高発現のcadian発現細胞が、赤色に擬似着色された低発現のen cadian発現細胞に包まれています。この手法を習得し、適切に行えば、30分以内で完了させることができます。