Name: 3D楕円体の生成のための簡単なハンギングドロップ細胞培養プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 学ぶハンギングドロップ法による3D組織様スフェロイドの迅速な生成技術。細胞間相互作用の評価に適用でき、細胞生物学および組織工学の研究効率を向上させる有用な方法です。

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著者は、技術支援のために博士は東軒家に感謝したいと思います。この記事に表示される画像の一部は、博士マルコムS.スタインバーグ、分子生物学科、プリンストン大学と共同でいました。著者はまた、彼らの寛大な支援のために国防前立腺癌研究プログラム（助成金のPC - 030482およびPC - 991552）とNCI / NIH（助成R01CA118755）の部門に感謝の意を表します。

1。単一の細胞懸濁液の調製<ol><li>接着細胞の培養は90％のコンフルエンスまで増殖されるべきである、whereupon単層をPBSで2回リンスする必要があります。よく排水後、0.05％トリプシン- 1mMのEDTAの2 MLSを（100 mmプレートの場合）追加し、37℃での細胞がデタッチされるまで。完全培地の2 MLSを追加することにより、トリプシン処理を停止し、静かに、細胞が懸濁液になるまで混合物を砕いて粉にするために5 mlのピ​​ペットを使用してください。 15 mlコニカルチューブに細胞を移す。 </li><li>室温で5分間に10 mg / mlのDNase株式とインキュベートの40μlを添加する。 5分間200 xgで軽くボルテックスして、遠心。 </li><li>上清を捨て、1mlの完全な組織培養の培地でペレットを洗浄。繰り返しますが、その後、完全な組織培養培地の2 MLSで細胞を懸濁します。 </li><li>血球計算盤、または自動細胞計数装置を用いて細胞をカウントし、2.5 × 10 6細胞/ mlに濃度を調整する。このデモではBioRad社TC10自動細胞計数装置を用いた。 </li></ol> 2。ハンギングドロップの形成。 <ol><li> 60 mmの組織培養皿と皿の底の場所のPBS 5mlのをから蓋を外します。これは、水和室として機能します。 </li><li>蓋を逆さにして蓋の底部上に10μlの滴を堆積させるために20μlのピペッターを使用してください。触れないでするように十分離れてドロップが配置されていることを確認してください。皿ごとに少なくとも20滴を配置することが可能です。 </li><li> 37 PBS -満ちボトムチャンバーとインキュベート℃/ 5％CO 2 /湿度95％の上にふたを反転させる、毎日の低下を監視し、細胞シートまたは凝集体のいずれかが形成するまでインキュベートする。ステレオ顕微鏡は、凝集体形成を評価するために使用することができます。 </li><li>一度シートの形、それらが回転楕円体の形になるまで℃、5％CO 2を完全培地の3のMLSを含む丸底ガラスシェーカーフラスコに移し、37で振とう水浴中でインキュベートすることができます。 </li></ol> 3。ノート<ol><li>セルのサイズに応じて、濃度が上下調整する必要があります。 </li><li>細胞は、膜はハンギングドロップ形成する前に蛍光色素を吸蔵で染色することができます。 </li><li>二つの異なる細胞型を差動でぶら下がっ滴の形成前に1:1（またはその他）の割合で染色し、混在させることができます。これらは遺伝的に特定の接着剤の署名を持つように設計癌と間質細胞、胚組織、または細胞であり得る。 </li><li>細胞は、カドヘリンの機能を維持するために0.05％トリプシン/ 2 mMのカルシウムを使用して組織培養皿から剥離することができます。 </li><li>実験によっては、用紙サイズはいずれかで測定することができる、または集計は機械的な試験や生化学的または分子解析のために使用することができます。 </li></ol> 4。代表的な結果： シートまたは回転楕円体の形成は、通常24時間以内に起こるが、細胞の種類に応じて時間がかかることがあります。図1は、未治療前立腺癌MAT - LyLu（MLL）ドロップ文化を吊り下げ中の細胞（図1A）または25μmのMEK阻害剤PD98059で処理した細胞のインキュベーションの18時間後に撮影した画像を表します。細胞シートの著しい圧縮におけるそのMEKiの治療の結果に注意してください。圧縮は10-20のサイズ（またはそれ以上）滴を吊り下げ、治療群間の平均サイズを比較して測定することによって定量することができます。我々はピクセル単位で画像全体の面積を明らかにするために、粒子の分析を適用するとすぐに我々は一般的に、バイナリモードに画像を、各画像を閾値変換することにより、ImageJのソフトウェアを使用して画像を分析する。これは、その後、簡単に平方ミクロンに変換することができます。図2は、未処理とMEKi処理MLL細胞のサイズの比較を表しています。スチューデントt -検定（P &lt;0.0001）で比較して、前述したように、MEKiの治療は大幅にシートサイズを減らします。この比較のために、未処理及び処理した細胞の各10凝集体を測定した。図3は、ドロップの文化をぶら下げで24時間とシェーカーバスで2日後に形成されたニワトリ胚肝臓の回転楕円体を表しています。 ハンギングドロップアッセイはまた、採択された空間的位置を明らかにするために複数の細胞型を含むように変更することができます。例えば、ニワトリ胚の肝細胞は、蛍光膜 - インターカレート色素で染色し、別の蛍光マーカーで染色されているニワトリ胚心臓の細胞と混合した、単離することができる。混在したままになることではなく、図4Aに示すように、肝臓や心臓の細胞は一から別の"アウト並べ替え"と心臓の細胞が肝細胞に包まれている球の内、球の構成を採用する傾向がある。この設定は、肝臓と心臓の細胞間の細胞間接着の違いによって説明できる。この概念は、膵島細胞の組織5用とi同一の2つの細胞集団の間で細胞選別のため、両生類の3と硬骨魚類4胚の胚性生殖層の組織との間の細胞ソートの動作を説明するために使用されている差動接着仮説に成文化されNカドヘリン（6および図4B）の同じ種類の発現レベル以外のすべての点。この結果は、細胞集団の間の接着の単純な違いをエンジニアリング方法を実演するために特に重要なのは、例えば、臓器の構造の発生につながる可能性、膵島5。 <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1のどちらかが存在しない（A）または存在下で18時間点滴培養をぶら下げでインキュベートした細胞の画像（B）のMEK阻害剤PD98059の25μmの。画像は、ニコンのEclipse TE 300落射蛍光顕微鏡とPhotometrics CoolSnap ESデジタルカメラを使用して捕獲された。 <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。ラット前立腺癌MLL細胞のMEKi誘発性圧縮の定量。上記のような凝集体サイズを決定したとすぐに未処理とMEKi処理MLL細胞のハンギングドロップ培養を18時間インキュベートした。凝集体サイズの統計的分析はスチューデントt検定によって行った。アスタリスクは、未処理とMEKi処理細胞間の集約サイズで統計学的有意差（P &lt;0.0001）を表し、その有意に小さく、よりコンパクトな集合体でMEKi処理の結果を示唆している。 <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。インキュベーターにして18時間点滴培養を吊り下げ/ 48時間風呂を振りにニワトリ胚肝細胞をインキュベートすることによって形成された回転楕円体。この画像は、Nikon SMZ800ステレオ顕微鏡とソニーブラックCCDカメラを用いて捕獲された。 <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。ドロップの文化を吊るすには、異なる種類の細胞の間にソートアウト挙動を明らかにする。パネルでは、ニワトリ胚の肝細胞がPKH - 2膜インターカレート色素で染色し、PKH - 26ステンドニワトリ胚心臓の細胞と同じ割合で混合。パネルBでは、二つのN -カドヘリン-トランスフェクトL細胞クローン（LN4とLN2a）、2.4:1の比率で、その表面でのN - CADを表現するには、また、蛍光膜インターカレート色素PKH - 2、PKH - 26で染色した、（Sigma - Aldrich）を、等しい割合で混合し、滴7を吊り下げて培養した。文化の中で18時間後、細胞シートは、振盪フラスコに移し、さらに48時間インキュベートした。集計がに2％パラホルムアルデヒドで固定したリン酸緩衝生理食塩水とニコンオプチフォト- 2顕微鏡に接続されているバイオラッドMRC600走査型レーザー共焦点顕微鏡システムで表示。緑と赤の両方のチャンネルからの光学切片を採取したとVital Imagesはボクセルビューウルトラのイメージングソフトウェアを搭載したシリコングラフィックスクリムゾンVGXのワークステーションは、両方のチャンネルに偽色を割り当てることや画像をマージするために、生成された解剖学的構成を明らかに使用されていました。（）擬似カラー青の肝細胞（8から）で心臓の細胞（ここで疑似カラーの黄色の）の包囲を示す集約を通じて、共焦点光学セクション。 N -カドヘリン（赤）（6）の低レベルを発現することにより、高N -カドヘリンを発現する細胞（緑色）の集合体を実証包囲から（B）共焦点光学部。

<ol><li>Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+with+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell interactions with three-dimensional matrices.</a> Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).</li>
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<li>Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+tumor+spheroid+in+a+microgravity+environment+as+a+3D+model+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 523-534 (2009).</li>
<li>Napolitano, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+three-dimensional+cell+culture+utilizing+micromolded+nonadhesive+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Biotechniques. 43, 494-496 (2007).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103, 655-663 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

研究では、三次元コンテキスト（3D）での培養細胞が異なる細胞の形態とリジッド2次元（2D）文化系9と比較してシグナル伝達をもたらすことが示されている。例えば、線維芽細胞に移入コラーゲンゲルは、3Dでの線維芽細胞の形態は、2D 10,11で観察されたものとはかなり異なっていることを示しています。同様に、三次元培養では、乳腺上皮細胞の組織特異的分化を誘導することができる。 3D培養システムは、正常および悪性の細胞を区別するために使用されており、適切な刺激12,13与え、正常な表現型に形質転換された細胞の復帰を支援することが示されている。正しい組織構造も長距離にとって不可欠であることが示されている恒常性、アポトーシスの抑制、およびCID - 9乳腺上皮細胞の分化した表現型14のメンテナンス。細胞は、従来の単層培養15の3 - D構成としないで栽培された場合にのみ、マウスの多薬剤耐性は、EMT - 6乳癌細胞は 、in vitro で明らかにされることが示されている。これらおよび他の...

<ul><li>自動セルカウンター（バイオラッドTC10） </li><li> CO 2切妻のカバーモデル3540（ラボライン）で水浴を揺るがす</li></ul>

3d楕円体の生成のための簡単​​なハンギングドロップ細胞培養プロトコル

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

細胞間の凝集と細胞 - 基質接着の研究は歴史的に硬質基材への付着性単層培養で行われている。組織内の細胞は、しかし、一般的に細胞は多くの近い隣人とし、細胞外マトリックス成分との親密な接続を確立した最密充填組織塊内に収められています。したがって、化学的環境と3次元組織内の細胞が経験する物理的な力は、単層培養で増殖させた細胞で経験したものよりも根本的に異なっています。これは、著しく細胞形態及びシグナル伝達に影響を与えることが示されている。いくつかのメソッドは、コラーゲンゲル1または生体材料足場2のセルのカプセル化を含む3次元細胞培養を生成するために考案されている。このような方法は、便利な一方、正常組織に見られる親密な直接細胞間接着のアーキテクチャを要約することはありません。単一の細胞が疎なECM製品の3次元網目構造内に分散されているのではなく、彼らがより密接に近似する培養システム。ここで、我々は、彼らは、細胞同士や細胞外マトリックス成分と直接接触している真の3D回転楕円体を形成するまで細胞がドロップ文化をハング内に配置し、生理的条件下でインキュベートされる、単純な方法を説明します。メソッドは特殊な装置を必要とせず、細胞間または細胞- ECM相互作用への影響を解明することに関心があると思われる非常に少量の任意の生物学的因子の付加を含むように適合させることができます。メソッドは、セル間の空間関係を指定するには、細胞間や細胞 - ECM間の相互作用の役割を解明するために共培養つ（以上）の異なる細胞集団にも使用できます。細胞間の凝集と細胞- ECMの接着は胚発生の研究の基礎、悪性浸潤における腫瘍間質細胞の相互作用、創傷治癒、及び組織工学への応用のためです。この簡単な方法は、生体力学的特性の測定のためのまたは生理学的に関連するモデルの分子的および生化学的解析のための細胞凝集のような組織を生成する手段を提供します。

我々は、細胞 - 細胞相互作用の違いを定量化するために三次元組織のような回転楕円体とそれらの潜在的なアプリケーションを生成する単純な、急速な方法を説明します。

3D楕円体の生成のための簡単​​なハンギングドロップ細胞培養プロトコル

細胞間凝集および細胞-基質間接着の研究は、歴史的に、硬い基質に接着した単層培養を用いて行われてきました。細胞は…

本実験の目的は、3D組織のようなステロイド様構造を生成することです。まず、培養細胞を回収し、単一細胞懸濁液を調製します。次に、細胞懸濁液を組織培養皿の反転させた蓋の裏面に滴下して配置します。次に、蓋を反転させて加湿チャンバーに被せます。最後のステップとして、凝集塊を形成させるために、吊り滴法で24～48時間インキュベートします。その後、これらを振盪水槽に移し、さらに最大5日間インキュベートすることができます。最終的に、凝集アッセイ、組織表面の対称性の評価、またはエピ蛍光顕微鏡観察を通じて、凝集体の凝集力や細胞分別の違いを示す結果を得ることができます。例えば、従来の2D組織培養などの既存の手法と比較したこの手法の主な利点は、3Dで育成された細胞が、組織環境内の細胞が経験する細胞間相互作用をより忠実に模倣していることです。本手法が、PI（研究責任者）でさえ実行できるほど簡単であることを、実演して説明します。本実験を開始するために、コンフルエンシー90%で接着細胞を回収します。まず、培地を吸引し、細胞シートをPBSで2回洗浄します。次に、PBSを吸引し、0.05% Trypsin-EDTA溶液 2 mLを単層細胞の上にピペットで添加します。プレートを37 °Cの組織培養インキュベーターに入れ、細胞が剥離するまでインキュベートします。次に、プレートをインキュベーターから取り出し、完全培地2 mLを加えて処理を停止させます。5 mLピペットを用いて、細胞が完全に懸濁するまで混合液をピペッティングします。次に、細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移します。10 mg/mLのDNA溶液を40 µL、細胞懸濁液にピペットで加え、室温で5分間インキュベートします。細胞懸濁液を短時間ボルテックスした後、200 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、上清を吸引して廃棄し、ペレットを1 mLの完全培地で再懸濁して洗浄します。再度遠心分離を行い、ペレットを1 mLの完全培地で再懸濁します。次に、自動細胞カウンターまたは血球計数器を用いて細胞数を測定します。培地を用いて細胞懸濁液を調整し、最終濃度を2.5 × 10⁶ cells/mLにします。その後、吊り滴法の作製に進みます。60 mm 組織培養皿の蓋を取り外し、皿の底に 5 mL の PBS をピペッティングして加湿チャンバーを準備します。プレートの蓋を裏返し、細胞懸濁液を 20〜10 µL のドロップとして蓋の裏側にピペッティングします。ドロップ同士が接触しないよう、十分に間隔を空けて配置してください。ドロップ培養液を含む蓋を、PBSが入ったディッシュの底にそっと戻します。培養プレートを組織培養インキュベーターに入れます。37 °C、5% carbon dioxide、95% humidityに設定し、一晩インキュベートします。ドロップを毎日観察し、細胞シートまたは凝集塊が形成されるまでインキュベーションを継続します。細胞シートまたは凝集塊が形成されたら、それらを3 mLの完全培地を含む丸底ガラスシェーカーフラスコに移します。細胞シートまたは凝集塊が入ったフラスコを、振盪水槽でインキュベートします。ステロイドの形成が解剖顕微鏡下で観察できるようになるまで、37 °C、5% 二酸化炭素条件下で約24時間維持します。ステロイドが形成された後、実験的操作がステロイド形成に及ぼす影響を、書面によるプロトコルに記載された手順に従って定量化できます。また、あらかじめ添加した蛍光染料の膜へのインターカレーションを、蛍光顕微鏡を用いて観察することが可能です。この明視野顕微鏡画像は、吊り滴法を用いて18時間培養した後のラット前立腺がんMLL細胞の凝集を示しています。この画像は、吊り滴法による18時間の培養後に形成されたMLL細胞の2つ目の凝集塊を示しています。これらの細胞は25 micromolarのMEK阻害剤PD 9 8 0 5 9存在下で培養されており、その結果、細胞凝集塊は大幅に緻密になっています。ここでは、MEK阻害剤で処理したMLL吊り滴培養の凝集塊サイズと、未処理のコントロールの凝集塊サイズの差を示します。アスタリスクは、P値が0.0001未満の統計的に有意な差を表しています。これは、未処理の凝集塊とMEK阻害剤処理した凝集塊の間でt検定を行った結果であり、MEK阻害剤処理によって凝集塊が有意に小さく、よりコンパクトになることを示唆しています。この画像はNikon Smz 800実体顕微鏡を用いて撮影されたもので、鶏胚肝細胞をハンギングドロップ法で18時間培養し、その後37 °Cの振盪水槽で48時間培養して形成されたステロイド様構造を示しています。この共焦点顕微鏡画像は、ハンギングドロップ法を用いて特定の細胞集団を共培養した際に起こるソーティングアウト挙動を示しています。ハンギングドロップ培養に移行する前に、鶏胚肝細胞は膜間染色剤であるpkh twoで染色されました。心細胞をPKH 26で染色した。その後、細胞懸濁液を混合し、ハンギングドロップ法に供した。18時間培養し、続いて37 °Cの振盪水槽内で48時間インキュベートした。光学切片から、黄色に染色された心細胞が肝細胞に包まれていることがわかります。ここでは青色に擬似着色されており、表面にNCAを発現させた2つのnardiおよびトランスフェクトされたL細胞クローンです。2.4対1の比率で、等量混合した蛍光膜挿入色素PKH 2およびPKH 26で染色し、前述と同様に吊り滴法で培養しました。この例では、緑色に擬似着色された高発現のcadian発現細胞が、赤色に擬似着色された低発現のen cadian発現細胞に囲まれています。この手法を習得し、適切に実施すれば、30分以内で完了させることができます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

スフェロイドは、2D細胞培養単層モデルと比較して、細胞の環境をより正確に表現するために使用される3D細胞培養モデルの一種です。このプロトコル例では、科学者が結腸直腸がん細胞株からスフェロイドを作製し、生細胞イメージングを適用してスフェロイドの成長を追跡します。...

細胞株からのスフェロイド作製:三次元(3D)細胞培養法

この動画では、メラノーマ細胞を用いたハンギングドロップ法により3次元スフェロイドを生成する技術について説明しています。生成されたin vitro 3次元(3D)器官型黒色腫スフェロイドモデルは、悪性黒色腫のin vivo構造を描写でき、腫瘍内相互作用に関する洞察を与える可能性があります。...

ハンギングドロップ法:3次元黒色腫スフェロイドを生成する技術

この方法は、スフェロイドから周囲の3Dマトリックスへの癌細胞の浸潤を評価します。 スフェロイドはハンギングドロップ培養法で作製し、基底膜材料とI型コラーゲンからなるマトリックスに包埋します。 その後、スフェロイドからの侵入が監視されます。...

3Dの設定で侵略を評価するために、癌細胞スフェロイドアッセイ

ここでは、細胞凝集を通じて3D細胞スフェロイドを形成するための迅速で柔軟なプロトコルについて説明します。これは、複数の細胞タイプに容易に適応でき、細胞遊走、浸潤、アノイキスアッセイなどのさまざまなアプリケーションでの使用や、細胞-マトリックス相互作用のイメージングと定量化に適しています。...

3Dスフェロイド生産のための効率的で柔軟な細胞凝集法

このプロトコルは、患者由来のスフェロイドの生成、および増殖の定量化、細胞傷害性試験、フローサイトメトリー、免疫蛍光染色および共焦点イメージングを含む下流分析を記述し、薬物を評価するために抗腫瘍治療薬としての候補者の可能性このプロトコルは、各患者および疾患の段階のための特定の薬物の同定と精密医学をサポートする。...

がん幹細胞を標的とする抗腫瘍性薬物スクリーニングのための生理学的患者由来3Dスフェロイド

ここでは、生体内腫瘍の物理化学勾配を2D培養よりもはるかに優れた3D癌細胞スフェロイドで生存率と死亡を評価するためのいくつかの簡単な方法を紹介する。したがって、スフェロイドモデルは、生体内条件への翻訳を改善した癌薬効の評価を可能にする。...

癌細胞の3Dスフェロイド培養における細胞生存率と死の評価

細胞回転楕円体を培養できるモータ駆動遠心マイクロ流体装置を紹介する。この装置を使用して、単一または複数の細胞タイプの回転楕円体は、高い重力条件下で容易に共培養することができる。...

多細胞三次元回転楕円体を生成するためのラボオンCDプラットフォーム

本プロトコルは、3Dプリントされたスタンプ様デバイスを使用して、大規模かつ費用対効果の高い方法で組織スフェロイドを作製する技術を記載している。...

3Dプリントされたスタンプ状デバイス による 組織スフェロイドの生成

再現性の高いスフェロイドを増殖させるためのプロトコルと、画像キャプチャとプロテオミクスを用いた表現型特性評価について紹介します。...

機能的3Dスフェロイド細胞培養の半自動表現型解析(英語)

この研究では、アガロース型にマイクロウェルを作製するためのスタンプベースのシステムを使用して、3D細胞構造を生成するための費用対効果が高く効率的な方法論を提示します。このシステムは、均一なスフェロイド/オルガノイドの形成を促進し、細胞相互作用を改善します。このアプローチは、実験のばらつきを減らし、薬物試験や組織工学への応用をサポートします。...

新規スタンプデバイスを用いた二次元細胞培養からの三次元スフェロイド/オルガノイドの作製

学ぶハンギングドロップ法による3D組織様スフェロイドの迅速な生成技術。細胞間相互作用の評価に適用でき、細胞生物学および組織工学の研究効率を向上させる有用な方法です。

3D楕円体の生成のための簡単​​なハンギングドロップ細胞培養プロトコル

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3D楕円体の生成のための簡単なハンギングドロップ細胞培養プロトコル