外傷性脳損傷の研究のための神経細胞のインパルス加

本手順の全体的な目的は、外傷性脳損傷の研究に向けて、培養脳細胞に衝撃的な加圧を加え、その経過を観察することである。まず、レチノイン酸を用いて培養細胞の神経分化を誘導する。次に、神経細胞をksky barベースの細胞加圧装置に配置し、爆風による外傷性脳損傷に関連する強度および持続時間の衝撃圧に曝露させる。

最後に、細胞損傷および外傷性脳損傷の起こりうるメカニズムを評価するため、分子生物学的アッセイを行います。顕微鏡観察の結果、2 MPaの強度で0.7 msの間、衝撃的な加圧を行った際に、神経細胞の死滅と神経突起の軸索構造の喪失が認められました。流体パーカッション法などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、負圧セクションが存在せず、持続時間が厳密に制御されている点にあります。

この手法は、衝撃圧の大きさ、持続時間、および負荷形状の関数としての神経細胞死または損傷の閾値など、外傷性脳損傷（TBI）分野における重要な疑問への回答に役立ちます。これまで当グループではこの手法を爆風誘発性TBIの研究に使用してきましたが、衝撃誘発性TBIなど、他の種類の外傷性脳損傷にも適用可能です。本手順は、Chen Fang教授の研究室の大学院生であるMatthewと、私の研究室の技術者であるli haによって実演されます。

本実験では、細胞加圧装置としてセットアップされたKskyバーを使用します。この装置は、整列した真鍮製ベアリングによって吊り下げられた2本の6メートルアルミニウム合金バーと、in vitro細胞加圧チャンバーで構成されています。バーの間に挟まれた細胞加圧チャンバーは、ピストンシリンダーで構成されています。

シリンダーのキャビティ底部には小さな穴が開けられており、細胞サンプルの設置時に空気や過剰な液体を排出します。ピストンはバーと同じチューブで作られており、テフロンテープを2〜3層巻き付けています。エンドキャップは、2本の小さなステンレス製ネジでガラスカバースリップを固定します。

本デモンストレーションでは、ヒト神経芽細胞腫細胞株 SH-SY5Y を使用しています。ただし、本プロトコールは多くの細胞培養モデルに適用可能です。細胞は、直径 18 mm のガラスカバースリップ上に 3000 cells/cm² の密度で播種しています。

サプリメント添加済みDMEMで細胞をインキュベートしている間に、10 micromolarのレチノイン酸を培地に追加し、2日ごとに培地を交換しながら7日間かけて細胞の分化を誘導します。7日目になると、細胞に十分に発達した神経突起の軸索構造が見られ、加圧の準備が整います。加圧チャンバーのすべての部品をオートクレーブで滅菌し、チャンバーを組み立てる際はUVライトの下で保管してください。

培養フード内で、チャンバーのベントねじが空気孔に軽くかかっていることを確認します。キャビティの底部に、調製したばかりの温かい増殖培地をチャンバーに満たします。次に、細胞を外側に向けて、細胞培養済みのガラススライドをピストンのキャップにねじ付けし、ピストンを慎重にチャンバーのキャビティに装着します。

ベントスクリューを取り外し、ベントを上方に傾けて、ピストンをあらかじめ決定した基準線までチャンバー内に押し込みます。これにより、セル加圧チャンバー内に約6mmの液深が保持されます。気泡が混入しないように注意し、ベントスクリューを洗浄してから再度取り付け、チャンバーを水密状態にします。

チャンバーは静荷重下で漏れがない状態でなければなりません。Kskyバーシステムをリセットします。重錘を元の位置に戻し、ロックボルトを再度取り付けます。

ロッキングボルトは、ピンが破断するまで入射棒の移動を防ぐクランプ力を維持します。油圧ジャックを使用して、新しいロッキングボルトを約200 PSIまで締め付けます。シザージャックを用いて入射棒の予荷重セクションを目的の値よりわずかに高い圧力まで圧縮し、その後、JAKネジの全摩擦を効かせるために少し緩めます。加圧時間は約1ミリ秒であるため、ここでデータ収集設定を行います。

ホイートストンブリッジ回路に2000 Ωのひずみゲージを使用し、サンプリング周波数を1 MHzに設定します。送信棒側の電圧を45 Vに設定してください。ピストンが送信棒側を向くようにセルチャンバーを取り付けます。

セルチャンバーを、小型のラボ用シザージャッキで支持されたVブロックに配置し、2本のバーと合わせます。各接合面に薄くグリースを塗り、接合面を軽く擦り合わせて、表面間の空気を完全に取り除きます。これでシステムの準備が完了しました。

データ収集を開始し、油圧クランプドライバーを素早くポンプ操作して試験を実施します。これによりロッキングボルトが強制的に破断し、クランプが分離して圧力波が細胞に伝達されます。試験後、クリーンベンチ内でチャンバーからスライドを取り出し、細胞の挙動の評価に進みます。

習熟すれば、この装置を用いて1時間あたり約9枚の細胞培養スライドを加圧することができます。読み取り値を分析する際、透過バー信号の開始時に気泡によるエラーが見られる場合がありますが、本デモンストレーションでは発生していません。

透過バーが十分に長い場合、最も重要なデータは最初の乱れから始まり、測定値が負圧を示すところで終了します。この電圧読み取り値は、ひずみゲージ解析を通じて細胞が受けるストレスに比例します。透過パルスの持続時間は、入射パルスよりも短くなる場合があります。細胞加圧チャンバー内の流体に小さな気泡が混入している場合、透過パルスの大きさは入射パルスの大きさを超えない可能性がありますが、除荷前に十分な長さのプラトーを持つ必要があります。

そうでない場合は、密閉されたチャンバー内に大きな気泡が閉じ込められているか、アセンブリとバーの配置がずれています。加圧後、細胞を直ちに観察するか、後で検討するためにさらにインキュベートします。加圧した細胞を、同様に処理したが加圧は行わなかったチャンバー対照細胞と比較し、インキュベート後のさまざまな時間において、光学顕微鏡を用いて神経突起の長さの変化を評価します。

アクチン免疫蛍光染色は、細胞骨格の変化を評価するために使用できます。また、微小管結合タンパク質2（MAP2）抗体を用いて、主要な神経細胞マーカーの一つにおける変化を可視化することが可能です。

インパルス加圧がニューロンおよびアポトーシス関連遺伝子の発現に及ぼす影響を評価する場合、必要に応じてR-T-P-C-Rなどの標準的な分子生物学的手法を用いてください。イムノブロッティングに十分な量の細胞溶解物は、同一条件で加圧した複数の細胞サンプルから回収することが可能です。本例の加圧プロファイルでは、ksky bar装置を用いて、光学顕微鏡画像に示されるように、培養ニューロン細胞に対して持続時間約0.7 millisecondの2 megapascalレベルの単一パルス型インパルス圧を正常に印加しました。2 megapascalのインパルス圧を負荷したSHSY five Yヒトニューロン細胞では、非加圧のコントロール細胞と比較して、明らかな神経突起および軸索の崩壊が認められます。

この手順を行う際は、流体加圧チャンバーを常にこのように保持してください。別の方法で保持すると、作製後に細胞が負圧にさらされることになります。この手法により、神経科学分野の研究者が、制御された加圧条件下で外傷性脳損傷の細胞メカニズムを探索することが可能となりました。Army UNL Center for Trauma Mechanicsからの資金援助に感謝いたします。