三次元光学分解能光音響顕微鏡
2011年5月3日
光学分解能光音響顕微鏡（OR - PAM）は、撮像光学吸収が可能な新たな技術は対照的です。 in vivoで携帯電話の解像度と感度を持つ。ここで、我々は典型的なシステム構成、システムの配置、を含むOR - PAMの実験プロトコル、上に可視化命令を提供する in vivoで実験手順、および機能イメージングの手法。
この手順の全体的な目標は、in vivo 光学分解能の光音響顕微鏡法、または非侵襲的でラベルフリーの微小循環の Pam を実証することです。これは、最初に実験動物に麻酔をかけることによって達成されます。手順の2番目のステップは、光学分解能のイメージングヘッドを平行移動することにより、関心領域を配置することです。次に、光音響顕微鏡のスキャンパラメータが設定され、画像取得が開始されます。
最終的に、ヘモグロビンの全酸素濃度と酸素飽和度の分布は、多波長実験データの計算によって得られます。光学分解能の光音響顕微鏡は、レーザー励起と超音波検出に基づいています。短いポストレーザービームが生体組織に集束されます。
光を吸収すると、過渡的な加熱とそれに続く超音波放射が発生し、それが受け取られて画像が形成されます。ユニークな利点、またはPamは、それが光吸収に対するグランドフリー検出と絶妙な感度です。対照的に、既存の反射ではなく、光学顕微鏡技術は、主に光散乱または蛍光に敏感です 光吸収またはRPMのvavoラベルフリーの高解像度イメージングを提供する能力は、神経学、眼科、血管生物学、および皮膚科において広範な生物医学的応用を発見しました。
光学分解能の光音響顕微鏡法、またはPAMMは、光学部品と超音波部品の両方で構成されています。光照射源は、固体パルスレーザーで励起した色素レーザーです。出力レーザービームは、NDフィルターによって減衰され、光伝送のためにシングルモード光ファイバーに結合され、生体ではなく顕微鏡イメージングヘッドの機械的スキャンが可能になり、マルチモードレーザービームをシングルモード光ファイバーに効果的に結合できます。
まず、直径50マイクロメートルのピンホールでろ過します。ピンホールは、集光器レンズの焦点からわずかに離れた位置に配置され、その直径を基本モードビーム径に合わせます。回折限界に近い光学焦点を作成するために、シングルモードファイバーの出力が照合され、顕微鏡の後部開口部を埋めます。目的。
超音波検出には、超音波トランスデューサーに接続された自家製の音響光ビームコンバイナーが含まれます。コンバイナーは、光照射と音響検出を同軸に整列させます。球状のキャビティをコンバイナーの底部に研磨して、水中で開口数が0.5の音響レンズを生成し、50メガヘルツの中心周波数で43マイクロメートルの音響焦点径を提供します。
最初のアライメントでは、パルスエコー超音波を使用して音響焦点面の位置を決定すると役立ちます。イメージングヘッドは、最大パルスエコー超音波信号が観察されるまで垂直に調整されます。検出感度を最大化するために、光学焦点と音響焦点が整列しています。共 焦点。
黒い電気テープなどの光学吸収ターゲットが音響焦点面に配置されます。次に、光音響信号を最大化するために、光学焦点位置を調整します。またはPAMシステムには、電子増幅器とアナログデジタルコンバーター、機械式スキャナー、スキャナーコントローラーも含まれています。
デジタル化された信号は、画像形成のためにコンピュータに転送されます。このソフトウェアは、生データを一連の断面bcan画像に変換します。顕微鏡ヘッドラスターが対象物をスキャンすると、記録された画像は、個々の断面画像、2D最大振幅投影画像、または3Dレンダリングとして表示できます。
顕微鏡イメージングヘッドを収納するために水タンクが使用されます。イメージングウィンドウをシャーレに切断し、超音波および光学的に透明なポリエチレン膜で密封します。物体から生成された光弾性波は、最初に物体とポリエチレン膜との間の超音波ゲルによって超音波検出器に音響結合され、次にペトリ皿内の脱イオン水によって結合されます。
利用可能な光学レーザーおよび超音波トランスデューサのこれらの発明および応用は、またはPAMシステムを構成する。次のセグメントでは、このシステムを使用して生きているマウスの微小血管系を画像化します。画像化されている動物がヌードマウスでない場合は、実験の24時間前に、実験を行うのが理想的です。
そのため、皮膚の血管系への刺激が回復します。医療グレードの酸素で気化させた3%ISOフッ素でマウスに麻酔をかけました。一般的な流量は1分あたり1〜1.5リットルです。
動物の体重によります。1%ISOフッ素で麻酔を維持する 実験中は、マウスが完全に麻酔されていることを確認するために、つま先をつまむようにしてください。マウスを温熱パッド付きの定位位ステージに移し、体温を摂氏37度に保ちます。
次に、プラスチックプレートの上で耳を平らにします。次に、耳の上に超音波ジェルの層を塗ります。ゲル内に気泡を閉じ込めないでください。
また、乾燥や偶発的なレーザー損傷を防ぐために、眼科用軟膏を目に塗布します。アプリケーターで直接目に触れないでください。次に、耳をイメージングウィンドウの下に置き、超音波ゲルが膜の底に接触するまで動物ステージをゆっくりと上げます。
耳をメンブレンに押し付けると耳の血流に影響を与える可能性があるため、ソフトコンタクトが必要です。次に、動物にいくつかの予防策を講じて、その生理学的状態を監視します。パルスオキシメータをマウス、脚、または尾に固定します。
次に、音響レンズが脱イオン水に浸されるまでイメージングヘッドを下げ、音響レンズの下に閉じ込められた気泡を取り除きます。レーザーを外部トリガーモードに設定し、トライアルスキャンを開始します。光学と音響のデュアルフォーカスが耳の中央に装着されるまで、イメージングヘッドのZ位置を調整します。
次に、スキャンパラメータを設定し、正式な画像取得を開始します。総ヘモグロビン濃度を測定するため。波長を、オキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンのモル吸光係数が等しいISO痙攣点に設定します。
ヘモグロビンの酸素飽和度を測定するには、オキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンのモル吸光係数が顕著な違いを持つ場所に2番目の波長を設定します。終了したら、マウスの耳を掃除し、マウスをインキュベーターに入れます。環境温度を37°Cに設定した状態で、目を覚ましたら自然とマウスを動物施設に戻します。
この最大振幅投影画像は、570ナノメートルのPamを使用して画像化された生きたヌードマウスの耳の血管の解剖学的構造を示しています。この投影画像は、同じ耳のヘモグロビン酸素飽和度を示しています。これは、570ナノメートルのISO痙攣波長と561ナノメートルのデオキシヘモグロビン吸収主波長で取得した画像から計算されます。
ボックス化された領域を詳しく見ると、oramm の解像度が表示されます。密集した毛細血管床が鮮明に解像されています。このビデオでは、システム構成、システムアライメントin vivo実験手順、機能イメージングスキームなど、OROMの典型的な実験プロトコルを実演しました。
機器の設計と操作における最も重要な側面の一つは、イメージング感度、光学分解能光音響顕微鏡と組み合わせた光学分解能光音響顕微鏡法と光音響コンピュータ断層撮影の約束生体内、機能的および分子イメージングと複数のエンドスケール、臓器の爪、細胞、組織、 そして臓器まで同じコントラストで画像化できます。イメージングのスケーラビリティなどの起源は、マルチスケールシステム、生物学、翻訳の研究に革命を起こす可能性を秘めています。顕微鏡によるラボでの発見から、マクロな臨床診療まで。
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概要
この記事では、生体内で細胞分解能を提供する非侵襲的イメージング技術である光学分解能フォトアコースティック顕微鏡法（OR-PAM）の詳細なプロトコルを紹介します。この手順には、動物の麻酔、イメージングヘッドの位置決め、そして微小循環を分析するための画像の取得が含まれます。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- イメージング技術
- フォトアコースティック顕微鏡法
背景
- OR-PAMは新しいイメージング技術です。
- 光吸収コントラストのイメージングを可能にします。
- この技術はラベル不要で非侵襲的です。
- 組織内の微小循環と酸素レベルへの洞察を提供します。
研究の目的
- 生体内でのOR-PAMの使用を示す。
- 実験プロトコルの視覚化された指示を提供する。
- 微小循環力学の理解を深める。
使用した方法
- 実験動物の麻酔。
- イメージングの対象領域の位置決め。
- 画像取得のためのスキャンパラメータの設定。
- 多波長データからの総酸素濃度と飽和度の計算。
主な結果
- 生体内での微小循環の成功したイメージング。
- 組織内の酸素濃度と飽和度のデータ取得。
- 技術の非侵襲性の実証。
- 機能的イメージングのツールとしてのOR-PAMの検証。
結論
- OR-PAMは微小循環のイメージングに効果的です。
- この技術は組織の酸素化に関する貴重な情報を提供します。
- 様々な生物医学研究分野での応用可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Three-dimensional optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) enables non-invasive, label-free, high-resolution imaging of tissue optical absorption, providing functional and physiological insights at the microvascular level. This capability addresses a critical gap in discovery-stage imaging by quantifying oxygenation and hemoglobin dynamics in vivo, supporting mechanistic de-risking and translational continuity. OR-PAM's integration of optical and acoustic detection offers unique value for target validation and predictive confidence in preclinical research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of tissue oxygenation and hemoglobin saturation for functional target interrogation.
- Supports biological de-risking by quantifying physiological responses in intact microvasculature.
- Facilitates predictive confidence in target engagement through quantitative, label-free imaging outputs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated in vivo models for downstream compound screening and mechanistic studies.
- Delivers reproducible, quantitative measurements of microvascular function and oxygenation.
- Enables assay standardization and platform scalability for high-content imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant physiological biomarkers such as oxygen saturation.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting multi-scale, functional imaging.
- De-risks advancement decisions by enabling direct measurement of tissue-level pharmacodynamics.
Pipeline & Workflow Integration
OR-PAM fits within the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies and translational biomarker validation through quantitative, in vivo imaging.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring real-time physiological changes in microcirculation.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible imaging of vascular and oxygenation parameters for compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative readouts of hemoglobin concentration and oxygen saturation for robust statistical comparison.
- Translational Research: Connects functional imaging data to preclinical biomarker strategies when aligned with disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for multi-scale, multi-organ functional studies across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable imaging workflows for in vivo studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing actionable physiological data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on functional imaging evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical and acoustic system alignment and in vivo imaging protocols.
- Demands access to specialized laser, ultrasound, and data acquisition instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data analysis workflows.
- May require adaptation for different tissue types or animal models based on optical properties.
- Imaging sensitivity and resolution depend on precise optical-acoustic confocal alignment.
