Name: 三次元光学分解能光音響顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 学ぶ光学分解能光音響顕微鏡を用いたマイクロ循環の非侵襲的イメージング手法。ラベルフリーで組織の酸素濃度と飽和度を計測し、神経科学や血管生物学の研究に応用可能です。

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著者は、原稿の博士Lynneaブラムボーの緊密な読書に感謝。この作品は、健康補助R01 EB000712、R01 EB008085、R01 CA134539、U54 CA136398、と5P60 DK02057933の国民の協会が後援した。教授李紅V.王はしかし、この作業をサポートしていませんでしたMicrophotoacoustics、（株）とEndra、株式会社、の経済的利害関係を持っています。

1。システムの構成<ol><li>光照射<ol><li>光照射源：固体パルスレーザー（INNOSLAB、Edgewave）と色素レーザー（CBR - D、Sirahを）ダイオード励起。 </li><li>出力レーザービームは、（パルス幅：7nsの）（P50C、Thorlabs）50μmのピンホールを通過して集光レンズ（LA1131、Thorlabs）で焦点を当てています。 </li><li>ピンホールは、効果的な空間フィルタリングのための基本モードビーム径のピンホールの直径に合わせて、集光レンズの焦点から少し離れて配置されている。 </li><li>フィルタ処理されたビームは、シングルモード光ファイバ（P1 - 460A - FC - 2、Thorlabs）に結合して中性の高密度フィルター（NDC - 50C - 2M、Thorlabs）と減衰されます。 </li><li>ファイバー出力は570nmの波長で〜2.6μmの回折限界の光学フォーカスを達成するために顕微鏡対物の背面開口部（RMS4X、Thorlabs）を埋めます。 </li></ol></li><li>超音波検出<ol><li>超音波トランスデューサー：50 MHzの中​​心周波数（V214 - BB - RM、オリンパスNDT）。 </li><li>超音波トランスデューサは、回折限界の光照射と同軸に整列される超音波検出、ために自家製音響光学ビームコンバイナ11に接続されている。 </li><li>球形空洞は音響レンズを生産するコンバイナの底から粉砕される。この音響レンズは水中で0.5の開口数を有し、50 MHzの中​​心周波数は43μmの音響焦点直径を与えます。 </li><li>光学および音響病巣は、検出感度を最大にするconfocally整列されます。 </li></ol></li><li>音響結合<ol><li>乾燥した超音波カップリングは、初期の光音響イメージングシステム12で使用された水、実験動物を水没を避けるために採用されている。 </li><li>イメージングウィンドウをシャーレ（直径9cm）の底部で開かれており、超音波および光学的に透明なポリエチレン膜で封止されている。 </li><li>ポリエチレン膜と画像化されたカップルの水没OR - PAMイメージングヘッドにシャーレ内のシャーレへのオブジェクトから生成された光音響波、および脱イオン水をさらに夫婦波になるオブジェクトの間に超音波ジェル（クリア画像、SonoTech） 。 </li></ol></li><li>エレクトロニクス<ol><li>超音波トランスデューサで検出された音響信号は、2つのカスケード接続アンプ（ZFL 500LN、Mini - Circuits社）によって増幅される</li><li>増幅された信号は、200 MS /秒のサンプリングレートで14ビットのデータ集録（DAQ）ボード（CompuScope 14200、ゲージ応用科学）によってデジタル化される</li></ol></li><li>スキャン方式<ol><li>ラスターは水平（XY）平面に沿って、または- PAMイメージングヘッドのスキャンを2次元（2 - D）は、DAQボードとポンプレーザの両方をトリガするパーソナルコンピュータによって制御されます。トリガ信号は、DAQボードからクロックアウト信号に同期しています。 </li><li> 2次元スキャナの高速軸は断面走査（Bスキャ​​ン）の方向として定義されています。 </li><li> B -スキャン画像のシーケンスは、直接3次元レンダリングでまたは2 - Dの最大振幅の投影（MAP）の画像のどちらか見ることができる体積のイメージを形成し、遅相軸に沿ってイメージングヘッドを翻訳することで取得することができます。 </li></ol></li></ol> 2。システムの配置<ol><li>音響焦点面の位置を（すなわち、最大パルスエコー超音波信号にトリガ信号からの遅延時間）を決定するためにパルス - エコーの超音波と超音波反射板を使用してください。このステップは、OR - PAMシステムを構築する際に一度だけ実行する必要がある。 </li><li>シングルモードファイバの結合効率を最大化します。 </li><li>光学的に吸収するオブジェクト（例えば、黒のテープの部分）の上に超音波ゲルを適用し、静かに脱イオン水で満たされたペトリ皿の中でイメージングウィンドウの下に取り付けます。 </li><li>水にイメージングヘッドを下ろし、そして音響レンズの下に閉じ込められた空気の泡を取り除く。 </li><li>吸収物体の光音響信号は、音響遅延から判断することができる音響焦点面、からになるまで、イメージングヘッドを調整します。 </li><li>平らなオブジェクトから生成された光音響信号の振幅を最大にするために顕微鏡対物レンズの垂直位置（すなわち、zの位置）を調整します。最大化した信号の振幅は、光焦点が垂直方向に音響を中心に揃っていることを示唆している。 </li><li>ターゲットから発生する光音響信号が対称的なパターンが表示されるまで顕微鏡対物の水平位置（すなわち、xとyの位置を）調整する。対称性は、光学フォーカスが水平方向に音響を中心に揃っていることを示唆している。 </li><li>光音響信号が対称と振幅の両方に最適化されるまでのステップ2.6と2.7を繰り返します。 </li></ol> 3。 SA<html> mple実験手続きのin vivo OR - PAMマウス耳管構造の<ol><li> このステップは、ヌードマウスは不要です 。カクテルの腹腔内注射[：;：0.1 ml/10グラム投与量1ミリリットルケタミン（100 mg / ml）を、0.1ミリリットルキシラジン（100 mg / ml）を、8.9 mlの生理食塩水レシピ]で動物を麻酔。耳の毛を剃って、さらにSurgiクリーム（カテゴリ＃：82565、アメリカンインターナショナルインダストリーズ）との残差の毛を脱毛する脱イオン水でクリーニングする前に。そのような脱毛が若干皮膚血管を刺激するかもしれないので、最善の計画的な実験の24時間前に行われることに注意してください。 </li><li>光音響レーザーシステムの電源を入れ、システムのアライメントを確認してください。 </li><li>吸入ガス（典型的な流量は、動物の体重に応じて、1.0〜1.5リットル/分である）でイソフルラン3％を気化して、マウスを麻酔し、実験を通してイソフルラン1％の麻酔を維持する。メディカルグレードの空気は、正常な生理状態でマウスを維持するために吸入ガスとして推奨されます。 </li><li>定位ステージにマウスを移し、そして加熱パッドで37℃の体温° Cを制御します。 </li><li>プラスチック板上にマウスの耳を平らにし、耳の上に超音波ゲルの層を適用する。ゲル内部の気泡をトラップすることは避けてください。その後、イメージングのウィンドウの下に耳を配置し、徐々に超音波ゲルコンタクトポリエチレン膜の底まで、動物の段階を上げる。膜に対して耳を押すと、耳に血流に影響を与える可能性があるので、ソフトコンタクトが必要です。 </li><li>その生理的状態を監視するためにマウスの足や尾部にパルスオキシメータをクランプし、乾燥やマウスの眼への偶発的なレーザーの損傷を防ぐために、目に軟膏を塗る。 </li><li>音響レンズを脱イオン水に浸漬されるまで、イメージングヘッドを下ろし、そして音響レンズの下に閉じ込められた空気の泡を取り除く。 </li><li>それは米国規格協会13のレーザーの安全基準内であることを確認するためにレーザフルエンスを確認してください。レーザーのフルエンスは、レーザビームが皮膚の表面下150μm以下に集束されたレーザパルスのエネルギーの80 NJに変換する20 MJ / cm 2の 、超えてはならない。 </li><li>外部トリガモードにレーザーを設定し、裁判のスキャンを開始します。最強の光音響信号が音響焦点面からになるまで、イメージングヘッドのZ位置を調整します。 </li><li>正しいスキャンパラメータを設定し、正式な画像取得を開始します。 </li><li>実験後、レーザーをオフにする、、マウスを離す脱イオン水でマウスの耳をきれいに、麻酔のシステムと温度コントローラをオフにし、マウスをアンロードするために動物の段階を下げ、脱イオン水のイメージングヘッドを持ち上げ定位のステージから。 </li><li>反復的なイメージングが必要な場合は、37℃で設定された環境温度℃でインキュベーターにマウスを置くそれが自然にウェイクアップ後の動物施設にマウスを返します。そうでなければ、euthanatizeとそれを処分するために動物のプロトコルに従ってください。 </li></ol> 4。機能的OR - PAM総濃度とヘモグロビンの酸素飽和度の<ol><li>オキシヘモグロビン（HBO 2） ​​とデオキシヘモグロビン（HBR）はヘモグロビンの二つの主要な形態、可視スペクトル領域で支配的な内因性光音響源です。 HBO 2とHBRは、別個の光吸収スペクトルを有し、したがってスペクトルヘモグロビン5の合計濃度（HBT）と酸素飽和度（SO 2）の両方を定量化するために区別することができます。ここでSO 2の測定のための適切な光波長を選択するのに役立つ2つのガイドラインは以下のとおりです。 </li><li>波長が十分な信号対雑音比と十分な浸透を確実にするためにヘモグロビンの吸収スペクトル（すなわち、550〜600 nm）のQ -バンドの中で選択する必要があります。 </li><li> HBO 2、HBRの吸収係数は顕著な違い（例えば、HBR -支配的な561 nmのとHBO 2 -支配的な578 nm）を持つ波長が推奨されます。 </li></ol> SO 2に加えて、HBTは追加[HBR]と[HBO 2]を一緒にして計算することができる、または、直接ヘモグロビンのモル吸光係数スペクトルの等吸収波長で測定することができます（例えば、530nmで、545 nmの、570nm以下、及びHBRとHBO 2は等しいモル吸光係数が584 nm）を14。 5。代表的な結果： 図1に示すように血管解剖とSO 2のデュアル波長（561および570 nm）のOR - PAMによって撮像された生きているヌードマウスの耳の中にあります。デュアル波長の典型的な画像取得時間は、関心のような地域のSO 2の測定（画像サイズ：10ミリメートル× 10ミリメートル、ステップサイズ：2.5μmの× 5μm）を〜80分です。 p_upload/2729/2729fig1.jpg&quot;altが=&quot;図1&quot;/&gt; 図1。 生体光学分解能光音響顕微鏡で 。血管の解剖学的構造を示す（A）総ヘモグロビン濃度（570 nmで買収）とヌードマウスの耳の中に（B）ヘモグロビンの酸素飽和度（561 nmと570 nmで取得した）のMAP画像。 （C）クローズアップパネルで囲み領域（）の。パネルのスケールバーは、（）両方（）と（B）に適用されます。

<ol><li>Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical-resolution+photoacoustic+microscopy+for+in+vivo+imaging+of+single+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries.</a> Opt. Lett. 33, 929-931 (2008).</li>
<li>Zhang, C., Maslov, K., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subwavelength-resolution+label-free+photoacoustic+microscopy+of+optical+absorption+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Subwavelength-resolution label-free photoacoustic microscopy of optical absorption in vivo.</a> Opt. Lett. 35, 3195-3197 (2010).</li>
<li>Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+photoacoustic+and+fluorescence+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE.+Trans.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy.</a> IEEE. Trans. Biomed. Eng. 57, 2576-2578 (2010).</li>
<li>Jiao, S., Xie, Z., Zhang, H. F., Puliafito, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multimodal+imaging+with+integrated+photoacoustic+microscopy+and+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multimodal imaging with integrated photoacoustic microscopy and optical coherence tomography.</a> Opt. Lett. 34, 2961-2963 (2009).</li>
<li>Hu, S., Maslov, K., Tsytsarev, V., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+transcranial+brain+imaging+by+optical-resolution+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Functional transcranial brain imaging by optical-resolution photoacoustic microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 14, 040503-040503 (2009).</li>
<li>Hu, S., Yan, P., Maslov, K., Lee, J. M., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+amyloid+plaques+in+a+transgenic+mouse+model+using+optical-resolution+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of amyloid plaques in a transgenic mouse model using optical-resolution photoacoustic microscopy.</a> Opt. Lett. 34, 3899-3901 (2009).</li>
<li>Hu, S., Rao, B., Maslov, K., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+Photoacoustic+Ophthalmic+Angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Label-free Photoacoustic Ophthalmic Angiography.</a> Opt. Lett. 35, 1-3 (2010).</li>
<li>Jiao, S. L., Jiang, M. S., Hu, J. M., Fawzi, A., Zhou, Q. F., Shung, K. K., Puliafito, C. A., Zhang, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+ophthalmoscopy+for+in+vivo+retinal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic ophthalmoscopy for in vivo retinal imaging.</a> Opt. Express. 18, 3967-3972 (2010).</li>
<li>Oladipupo, S., Hu, S., Santeford, A., Yao, J., Kovalski, J. R., Shohet, R., Maslov, K., Wang, L. V., Arbeit, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+HIF-1+induction+produces+multistage+neovascularization+with+stage-specific+sensitivity+to+VEGFR+inhibitors+and+myeloid+cell+independence%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Conditional HIF-1 induction produces multistage neovascularization with stage-specific sensitivity to VEGFR inhibitors and myeloid cell independence.</a> Blood. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+functional+chronic+imaging+of+a+small+animal+model+using+optical-resolution+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">In vivo functional chronic imaging of a small animal model using optical-resolution photoacoustic microscopy.</a> Med. Phys. 36, 2320-2323 (2009).</li>
<li>Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-generation+optical-resolution+photoacoustic+microscopy+with+improved+sensitivity+and+speed%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed.</a> Opt. Lett. 36, 1134-1136 (2011).</li>
<li>Wang, X., Pang, Y., Ku, G., Xie, X., Stoica, G., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+laser-induced+photoacoustic+tomography+for+structural+and+functional+in+vivo+imaging+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive laser-induced photoacoustic tomography for structural and functional in vivo imaging of the brain.</a> Nat. Biotechnol. 21, 803-806 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Laser+Institute+of+America%2C+American+National+Standard+for+Safe+Use+of+Lasers+ANSI+Z136%22">Laser Institute of America, American National Standard for Safe Use of Lasers ANSI Z136</a>. , American National Standards Institute Inc. New York, NY. (2007).</li>
<li>Jacques, S. L., Prahl, S. A. Optical Absorption of Hemoglobin . Oregon Medical Laser Center [Internet]. , Available from: http://omlc.ogi.edu/spectra/hemoglobin/index.html (1999).</li>
</ol>

すべての実験動物の手順は、セントルイスのワシントン大学医学部動物実験委員会の学校で承認された実験動物のプロトコルに準じて実施した。

このビデオでは、我々は、システム構成、システムのアライメント、および典型的な実験手順を含むOR - PAMの実験的なプロトコルに関する詳細な指示を提供しています。ラベルのない、非侵襲的OR - PAMは、シングルキャピラリー的に微小血管機能と代謝の研究を有効にし、それにより微小循環に関連した生理学と病理学の理解を拡大する可能性を保持しています。 Microphotoacousticsは現在、このOR - PAMシステムを製造しています。

自家製音響光学ビームコンバイナ： <ul><li>直角プリズム（NT32 - 545、エドモンドオプティクス） </li><li>菱形プリズム（NT49 - 419、エドモンドオプティクス） </li><li>シリコーンオイル（1000cSt、Clearco製品） </li><li> OR - PAMシステム（Microphotoacoustics） </li></ul>

三次元光学分解能光音響顕微鏡

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

携帯とオルガネラレベルでの貴重な洞察を提供する光学顕微鏡は、、広く可能にする生物医学技術として認識されている。 in vivoでの柱として、3次元（3 - D）光学顕微鏡、single-/multi-photon蛍光顕微鏡および光コヒーレンストモグラフィは、（OCT）はそれぞれ、蛍光および光散乱コントラストに彼らの異常な感受性を示している。しかし、本質的な生理学的/病理学的情報をエンコードする生体組織の光吸収コントラストでは、、まだ課税をされていない。 生物医学photoacousticsの出現は、光照射が細胞内局在、たとえ1携帯電話または2レベルの横方向の解像度を達成するための回折限界に焦点を当てている光学顕微鏡の光学解像度光音響顕微鏡（OR - PAM）1の新しい枝につながっている。既存の光学顕微鏡技術に貴重な補完するものとして、OR - PAMは、少なくとも2つのノベルティにもたらします。まず、最も重要なことは、OR - PAMは、異常な感度（すなわち、100％）と光吸収のコントラストを検出します。蛍光顕微鏡3でまたは光散乱ベースの10月4日 （あるいはその両方を持つ）とOR - PAMを組み合わせることにより、生体組織の包括的な光学特性を提供します。第二に、OR - PAMは、蛍光顕微鏡およびOCTの純粋な光学過程とは対照的に、音響波に光吸収を符号化し、バックグラウンドのない検出を提供します。 OR - PAMの音響検出は、信号劣化の光散乱の影響を軽減し、自然に励起し、励起と蛍光スペクトルの重なりに起因する蛍光顕微鏡での共通の問題である検出、間に可能な限り干渉（すなわち、クロストーク）を排除。 光吸収イメージングのためのユニークな、OR - PAMは神経学5、6、眼科7、8、血管生物学9、皮膚科10、を含むがこれに限定されないが、その発明以来、広範な生物医学アプリケーションを、実証されています。このビデオでは、我々はシステム構成とOR - PAMの配置だけでなく、in vivoで機能的な微小血管イメージングのための実験手順を教える。

光学分解能光音響顕微鏡（OR - PAM）は、撮像光学吸収が可能な新たな技術は対照的です。<em&gt; in vivoで</em&gt;携帯電話の解像度と感度を持つ。ここで、我々は典型的なシステム構成、システムの配置、を含むOR - PAMの実験プロトコル、上に可視化命令を提供する<em&gt; in vivoで</em&gt;実験手順、および機能イメージングの手法。

細胞およびオルガネラレベルで有用な知見を提供する光学顕微鏡法は、基盤となるバイオメディカル技術として広く認識されています。

本手順の総合的な目的は、非侵襲的かつラベルフリーな微小循環の生体内（in vivo）光学分解能光音響顕微鏡（PAM）の実証です。まず、実験動物を麻酔させることでこれを達成します。手順の第2段階として、光学分解能光音響顕微鏡のイメージングヘッドを移動させて関心領域を positioning し、その後、スキャンパラメータを設定して画像取得を開始します。最終的に、多波長実験データの計算を通じて、総酸素濃度とヘモグロビン酸素飽和度の分布が得られます。光解像光音響顕微鏡は、レーザー励起と超音波検出に基づいています。短パルスレーザービームを生物組織に集光させます。光吸収によって一過性の加熱が生じ、それに続いて超音波が放出され、それを検知することで画像が形成されます。光音響顕微鏡（PAM）の独自の利点は、非接触での検出が可能であることと、光吸収に対する極めて高い感度を備えていることです。対照的に、既存の反射型または光学顕微鏡技術は、主に光散乱や蛍光に感度を持ちます。光吸収のin vivoでのラベルフリー高解像度イメージングを可能にするPAMは、神経学、眼科学、血管生物学、皮膚科学などの幅広い生物医学分野で応用されています。光学解像光音響顕微鏡（pamm）は、光学コンポーネントと超音波コンポーネントの両方で構成されています。光学照射光源には、固体パルスレーザーで励起される色素レーザーが用いられています。出力されたレーザービームは、中性密度フィルターで減衰され、シングルモード光ファイバーに結合されて導光されます。これにより、生体試料ではなく顕微鏡のイメージングヘッドを機械的に走査させ、マルチモードレーザービームをシングルモード光ファイバーに効果的に結合させることが可能になります。まず、直径50 µmのピンホールでフィルタリングを行います。ピンホールは、その直径を基本モードビームの直径に合わせるため、コンデンサーレンズの焦点からわずかに離れた位置に配置します。回折限界に近い光学フォーカスを作成するため、シングルモードファイバーの出力光をコリメートし、顕微鏡対物レンズの背面開口部を満たすようにします。超音波検出には、超音波トランスデューサーに接続された自作のアコースティック光学ビームコンバイナが使用されます。このコンバイナにより、光照射と音響検出を同軸上に整列させます。コンバイナの底部には球面キャビティが研磨されており、水中で開口数0.5の音響レンズとして機能し、中心周波数50 megahertzにおいて43 µmの音響焦点径を実現します。最初の調整では、パルスエコー超音波を用いて音響焦点面の位置を特定すると効率的です。パルスエコー超音波信号が最大になるまで、イメージングヘッドを垂直方向に調整します。検出感度を最大化するため、光学焦点と音響焦点を一致させます（共焦点）。黒色の絶縁テープなどの光吸収ターゲットを、音響焦点面に配置します。次に、光音響信号が最大になるように光焦点位置を調整します。また、PAMシステムには、電子増幅器とアナログ-デジタル変換器、メカニカルスキャナー、およびスキャナコントローラーが含まれています。デジタル化された信号は、画像形成のためにコンピュータに転送されます。ソフトウェアは、生データを一連の断層走査画像に変換します。顕微鏡ヘッドが物体をラスタースキャンすると、記録された画像は、個別の断層画像、2D最大振幅投影画像、または3Dレンダリングとして表示できます。顕微鏡のイメージングヘッドを収容するために水槽を使用します。ペトリ皿にイメージングウィンドウを切り抜き、超音波および光学的に透過性のあるポリエチレン膜で密封します。物体から発生した光音響波は、まず物体とポリエチレン膜の間の超音波ゲルによって、次いでペトリ皿内の脱イオン水によって、超音波検出器に音響的に結合されます。これらの発明と、利用可能な光学レーザーおよび超音波トランスデューサの応用によって、光音響（PAM）システムが構成されています。次のセグメントでは、このシステムを用いて生体マウスの微小血管をイメージングします。イメージングする動物がヌードマウスでない場合は、実験の24時間前に脱毛を行うことが理想的です。これにより、皮膚血管の刺激状態が回復します。医療用酸素で気化させた3%イソフルランを用いてマウスを麻酔しました。一般的な流量は分あたり1〜1.5リットルです。動物の体重に応じて投与します。実験を通して1%のイソフルランで麻酔を維持し、足指へのピンチ刺激を行ってマウスが完全に麻酔されていることを確認してください。マウスをステレオタキシス固定台に移動させ、ヒーティングパッドを用いて体温を37 °Cに維持します。次に、耳をプラスチックプレートの上で平らにします。その後、耳の上に超音波ジェルを塗布します。ジェルの内部に気泡が入らないように注意してください。また、乾燥や不慮のレーザー損傷を防ぐため、眼に眼用軟膏を塗布します。その際、アプリケーターで眼に直接触れないように注意してください。次に、耳をイメージングウィンドウの下に配置し、超音波ジェルが膜の底部に接触するまで動物ステージをゆっくりと上昇させます。耳をメンブレンに押し付けると耳の血流に影響を与える可能性があるため、ソフトコンタクト（緩やかな接触）が必要です。次に、動物の生理学的状態をモニターするために、いくつかの注意点を確認します。マウスの脚または尾にパルスオキシメーターを装着します。次に、音響レンズが脱イオン水に浸かるまでイメージングヘッドを下げ、音響レンズの下に溜まった気泡を取り除きます。レーザーを外部トリガーモードに設定し、テストスキャンを開始します。光学焦点と音響焦点の両方が耳の中央に位置するように、イメージングヘッドのZ位置を調整します。次に、スキャンパラメータを設定し、正式な画像取得を開始します。総ヘモグロビン濃度を測定するため、波長をオキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンのモル吸光係数が等しくなるISO等吸収点に設定します。ヘモグロビン酸素飽和度を測定するために、オキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンのモル吸光係数に顕著な差がある波長を2番目の波長として設定します。終了後、マウスの耳を洗浄し、マウスをインキュベーターに入れます。環境温度を37 °Cに設定し、マウスが覚醒したら、自然に動物飼育施設に戻してください。この最大振幅投影画像は、570 nmでo-PAMを用いて撮影した生存ヌードマウス耳の血管解剖学的構造を示しています。この投影画像は、同じ耳におけるヘモグロビンの酸素飽和度を示しています。これは、等吸収波長である570 nmと、デオキシヘモグロビン吸収優位波長である561 nmで取得した画像から算出されています。囲み領域を拡大すると、ORPMの解像度が確認できます。密に配置された毛細血管網が明確に捉えられています。このビデオでは、システムの構成、生体内でのシステムアライメント、実験手順、および機能イメージングスキームを含む、ORPMの典型的な実験プロトコルを実演しました。装置の設計と操作において最も重要な側面の1つは、光学・音響の共焦点アライメントであり、これは光音響顕微鏡のイメージング感度と光学解像度にとって極めて重要です。深部浸透型の音響解像度光音響顕微鏡および光音響コンピュータ断層撮影との組み合わせにより、in vivoでの機能的および分子イメージングが可能となり、細胞、組織、そして臓器に至るまで、複数のスケールで同一のコントラストを用いてイメージングできます。このようなイメージングの拡張性は、微視的な研究室での発見から巨視的な臨床実務に至るまで、マルチスケールシステム生物学およびトランスレーショナルリサーチに革命をもたらす可能性を秘めています。

three-dimensional-optical-resolution-photoacoustic-microscopy

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

Lensfree光トモグラフィーは、&lt;1μmの空間分解能を提供して三次元顕微鏡技術である×&lt;1ミクロン×15〜100ミリメートルの大型イメージングボリューム上のそれぞれx、yおよびz次元において&lt;3μmの...

マルチアングル照明とピクセル超高解像度を採用しLensfreeオンチップ·トモグラフィー顕微鏡

光音響眼科（PAOM）、光吸収ベースのイメージングモダリティは、現在入手可能な眼科イメージング技術に網膜の補完的な評価を提供します。我々は、ラットにおける同時マルチモーダル網膜イメージングのためのスペクトラルドメイン光コヒーレンストモグラフィー（SD-OCT）と統合PAOMの使用を報告している。...

統合された光音響眼底検査とスペクトラルドメイン光コヒーレンストモグラフィー

光音響膀胱造影（PAC）は、任意の電離放射線や有毒な造影剤を使用せずに膀胱、小児患者における放射線感受性の臓器を、マップする大きな可能性を秘めている。ここでは、ラットの光不透明なトレーサーの注射で膀胱をマッピングするためにPACを使用する方法を示す...

光音響膀胱造影

成体マウスのリンパ節における120μmの深さまでの造影による高解像度の生体内イメージングは​​、空間的に多重焦点二光子顕微鏡の励磁パターンを調節することによって達成される。 100μmの深さでは、このように散乱や回折限界を回避し、（横）487 nmおよび551 nmの（軸方向）の解像度を測定した。...

胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

ここでは、3次元の機能的および分子的なイメージングのための新しく開発されたハンドヘルド光音響(光音響)システムを用いたイメージングのための実験プロトコルの詳細な説明を提供します。実証された強力な性能と汎用性は、前臨床研究および臨床診療における光音響技術の新たな応用分野を定義する可能性があります。...

ディープティシュ人間血管造影および機能前臨床研究のためのユニバーサルハンドヘルド三次元光音響イメージングプローブリアルタイムで

ここでは、インビボで同じ試料上の浅い深度での高分解能画像化と低分解能深部組織画像化の両方が可能な切り替え可能な音響分解能（AR）および光学分解能（OR）光音響顕微鏡法（AR-OR-PAM）...

切り替え可能な音響光学分解能光音響顕微鏡<em&gt;インビボ</em&gt;小動物の血管系イメージング

小型動物での高速インビボ脳イメージングのためのコンパクトパルスレーザダイオード光音響トモグラフィ（PLD-PAT）システムが実証されています。...

高性能小型光音響トモグラフィーシステム<em&gt;インビボ</em&gt;小動物脳イメージング

本稿では、新規のセットアップと光音響顕微鏡やウサギなどの大型動物の非侵襲的、ラベル無料網脈絡膜イメージング用光断層影像デュアル...

生活家兎眼に新規光音響顕微鏡、光コヒーレンストモグラフィーのデュアル モダリティ網脈絡膜イメージング

広視野イメージングとリアルタイムイメージングを統合したデュアルラスタースキャン光音響イメージャーが設計されました。...

血管可視化のための二重ラスター走査光音響小動物イメージャー

システム構成、光アライメント、サンプル調製、実験手順など、手術マージン分析のために術中に組織学的画像を提供できる高速でオープントップの紫外線光音響顕微鏡を実証します。...

ディープラーニングによる仮想染色による組織学的イメージングのための高速紫外線光音響顕微鏡

本プロトコルは、 インビボ ヒト皮膚血管系のマルチスペクトル光音響画像の取得を記載する。これらには、機能分析の対象となる発色団と見なされるヘモグロビンとメラニンの定量が含まれます。...

血管研究における機能イメージングのためのマルチスペクトル光音響断層撮影

学ぶ光学分解能光音響顕微鏡を用いたマイクロ循環の非侵襲的イメージング手法。ラベルフリーで組織の酸素濃度と飽和度を計測し、神経科学や血管生物学の研究に応用可能です。

三次元光学分解能光音響顕微鏡

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