蚊の機能解析のためのカルシウムの生物発光アッセイ（ネッタイシマカ）とダニ（ Rhipicephalus microplus）Gタンパク質共役受容体

本実験の全体的な目的は、合成した節足動物ニューロペプチドとその認識GPCRとの構造活性相関を解析することです。まず、チャイニーズハムスター卵巣（CHO-K1）空細胞に目的のGPCR発現ベクターをトランスフェクションし、単一細胞由来の安定形質転換細胞株を構築します。次に、この安定細胞株に、カルシウム生物発光プレートアッセイで細胞内生物発光を測定するためのリポーター遺伝子であるgaequorinを搭載したプラスミドをトランスフェクションします。その後、これらの組換え細胞にペプチドリガンドを添加し、カルシウム生物発光プレートアッセイを行うことで、細胞質内のカルシウムレベルを測定します。

プレートアッセイにおけるレポーターのcorrinによって検出された、誘発された細胞内カルシウム放出に基づき、構造の異なるペプチドまたは異なるペプチド濃度を組み換え細胞に適用した際の生物発光ユニットに差異があるという結果が得られました。一過性発現プロトコルよりも、組み換えGPCRを発現する安定形質転換クローン細胞株を利用する主な利点は、受容体の発現レベルがより均一であり、結果の一貫性が得られることです。さらに、アクアリウムタンパク質をミトコンドリアに標的化することで、生物発光による高感度なカルシウム測定が可能になります。本日の実験は、私の研究室の大学院生2名のShall in LieとSimon Kersch、およびポストドクターが行います。

安定した細胞株を樹立するために、まずチャイニーズハムスター卵巣（CHO）K1 empty細胞を、37°C、5% CO2の加湿インキュベーターで培養します。細胞が健全に増殖した後、1x 抗生物質・抗真菌剤を含む増殖培地でempty細胞を維持します。CHO K1細胞をT25組織培養フラスコに播種し、抗生物質を含まない増殖培地で一晩培養し、コンフルエンシーが約30%になるまで増殖させます。

トランスフェクションに先立ち、書面によるプロトコルに従って、目的のGPCRを含むDNA発現ベクターを調製します。このDNAを100 µLのOptum低血清培地と混合します。

6 µLのリポフェクション試薬を100 µLのF 12 K 無血清培地に混合し、室温で30〜45分間インキュベートします。インキュベート後、DNA溶液とリポフェクション試薬溶液を滴下するようにして静かに混合します。この混合液を15 mLチューブに入れ、室温で10〜15分間静置します。

トランスフェクション混合液を、新鮮なF 12 K培地1.8 millilitersに滴下しながら静かに混ぜ合わせます。次に、細胞をPBSで洗浄し、この新しいトランスフェクション溶液を細胞に添加します。その後、18時間インキュベートします。

培地を抗生物質を含まない10% FBS添加F 12 K培地に変更し、翌日まで一晩インキュベートします。書面の手順に従い、抗生物質を含まない10% FBS添加F 12 K培地を用いて、細胞を2本のT 25フラスコに分割します。さらに18時間インキュベートします。

培地を選択培地に交換します。その後、選択培地を用いて3〜4週間かけて細胞を培養します。これにより、プラスミドがゲノムDNAに安定して組み込まれた細胞が選択されます。

維持培地を用いて細胞の維持管理を継続し、予期せぬコンタミネーションによる喪失を防ぐため、定期的に細胞株を凍結保存します。クローナル細胞株を選別するには、まず記載のプロトコルに従って、維持培地を用いて細胞をトリプシン処理し、遠心分離します。その後、5 mLの維持培地で細胞を再懸濁します。

細胞懸濁液を0.5 milliliters分取り出し、そこに新鮮な維持培地を4.5 milliliters加えて10倍希釈液を作成します。単一細胞を選別するため、この10倍希釈液を100 microlitersずつ96ウェルプレートの12ウェルに分注します。これらの細胞を用いて10倍の連続希釈を約19回繰り返し、理論上の最終懸濁液が100 microlitersあたり1細胞となるようにし、各連続希釈液を100 microlitersずつ96ウェルプレートの12ウェルに分注します。18時間のインキュベーション後、倒立光顕微鏡または蛍光顕微鏡で96ウェルプレートを観察し、単一細胞のみが含まれていると思われるウェル、または単一細胞から明らかに分裂した2つの細胞が含まれているウェルにマークを付けます。

培地を3日ごとに交換しながら、毎日プレートを観察します。細胞が約80%コンフルエントになるまで1週間培養します。その後、マークしたウェルを200 µLのPBSで洗浄し、トリプシンを添加します。

100 µLのPBSトリプシンEDTA溶液で洗浄します。PBSトリプシンEDTA溶液を除去します。100 µLの維持培地を加え、各マークされたウェルから細胞を回収し、1 mLの維持培地を入れた6ウェルプレートの1つのウェルに移します。

6ウェルプレートで3日間細胞を培養した後、個別のT 25フラスコに細胞を移します。細胞の性能に一貫性がなくなった場合に回収できるよう、細胞株を定期的に凍結保存してください。最も反応性の高い細胞株を決定するために、受容体、ペプチド、リガンド、またはその他のポジティブコントロールアゴニストなどの活性リガンドを用いて、移殖した細胞をカルシウム生物発光アッセイでテストします。

カルシウム生物発光アッセイの詳細については、このビデオの後半で解説します。実験を進める前に、単一細胞選択を2回目まで行ってください。アッセイ用にクローン細胞株を選択して培養を維持する場合、継代数を記録しておくことが重要です。継代数が多い細胞は、T 25フラスコ内での性能が低下する可能性があるためです。

目的の受容体を発現している細胞株を、維持培地を用いて約90%のコンフルエンスまで培養します。細胞を回収して遠心分離した後、維持培地で再懸濁し、維持培地で約10倍に希釈してヘモサイトメーターで細胞数を計測します。次に、細胞数を約2 × 10⁵ cells/mLに調整します。6ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を2 mLずつ播種し、24時間インキュベートします。カルシウム生物発光プレートアッセイを開始する直前の細胞コンフルエンスは、約60%になっているはずです。

目的のレポーター遺伝子を発現ベクター構築物に組み込みます。本手順では、ミトコンドリア発現型のクオラムレポーターを使用します。その後、書面によるプロトコルに従い、1 µgのこのレポータープラスミドを細胞にトランスフェクトします。

6ウェルプレートで細胞を24時間インキュベートした後、トリプシン処理し、遠心分離して再懸濁させ、細胞数を400,000 cells/mLに調整します。これを96ウェル白色薄底マイクロタイタープレートの各ウェルに100 µLずつ分注し、コンフルエンスが約80%に達するまでさらに24時間インキュベートします。これが生物発光アッセイにおける最適な細胞濃度です。以降の工程は暗所で行う必要がありますが、ここでは明所で示しています。

実演のため、5 µMのCHO terezinを含むカルシウムフリーDME培地を、ウェルあたり90 µL分準備します。プレートから古い培地を取り除き、各ウェルに90 µLずつ加えます。プレートを37 °C、5% CO2の条件下で、暗所にて3時間インキュベートします。これで細胞の試験準備が完了します。

このデモンストレーションは、バイオルミネッセンスモードに設定したNova starプレートリーダーを使用して行います。パージを開始するために、暗所でプレートポンプをプレートホルダーに設置してください。ペプチドを1.5 milliliterのEORチューブで可溶化します。

1ウェルあたり10 µLの10倍濃縮ペプチド溶液に使用する十分な量のカルシウムフリーDMEおよび培地を用意します。使用前に、ペプチド溶液のアスピレーション深さと位置決定の設定を行います。10 µLのペプチドを添加して細胞を刺激し、直ちに光放出の記録を開始します。

本デモンストレーションでは、装置を各ウェルの465ナノメートルの光放出を2秒ごとに、計50秒間記録するように設定します。ランが完了した後、装置のポンプを洗浄してください。各ペプチド試料についてこのプロセスを繰り返し、データを保存し、アッセイ後に再度装置のポンプを洗浄してください。

各ウェルからの発光データは、ソフトウェアプログラムによってMicrosoft Excelデータシートに自動的に転送されます。ExcelからPrism Software 4.0にデータをペーストします。x軸にさまざまなペプチド濃度、y軸に生物発光単位（bioluminescence units）をプロットしたグラフを作成します。

Y軸において、非線形回帰曲線フィッティング解析を選択し、各ペプチドの濃度反応曲線および対応するEC 50値を算出します。データ解析のため、各実験は3回繰り返して実施する必要があります。チャイニーズハムスター卵巣（CHO-K1）細胞で発現させた際、蚊（Aedes aegypti）由来のキニン受容体はマルチリガンド受容体として挙動し、1 nMという低濃度で機能的に反応しました。

カルシウム生物発光プレートアッセイを用いて単独で試験した3種の内因性Rhipicephalus microplusキニンについて、統計的に有意な差があるEC 50値が、Rhipicephalus microplusキニン3で約16 nanomolar、Rhipicephalus microplusキニン2で26 nanomolar、Rhipicephalus microplusキニン1で49 nanomolarと決定されました。その結果、活性の強さはRhipicephalus microplusキニン3が最も強く、Rhipicephalus microplusキニン1が最も弱いという順位となりました。ここでは、カルシウム生物発光プレートアッセイによる、マダニキニン受容体を発現させたチャイニーズハムスター卵巣（CHO-K1）細胞株に対する6種のα-アミノイソ酪酸キニンアナログの活性比較を示します。

Y軸は、各アナログについて、テストした全濃度で観察された最大応答に対する、ある濃度で観察された生物発光の割合として、最大生物発光ユニットのパーセントで表しています。KININE HEXAペプチド F-F-F-S-W-Gアミドは、受容体活性のポジティブコントロールです。単一置換キニンアナログである double F アミノイソ酪酸 WGアミドは、ポジティブコントロールであるHEXAペプチド KININEアナログよりも活性が高く、2つのアミノ酪酸置換を持つKININEアナログである アミノ酪酸 FF アミノ酪酸 WGアミドは、テストした二重置換アナログの中で最も強力でした。このビデオを視聴することで、AGPCRを発現させ、カルシウム生物発光アッセイを用いて受容体に対するリガンドの構造活性相関を解析するためのクローナル細胞株を取得する方法について、十分な理解が得られるはずです。