Name: 静脈血栓症の電解下大静脈モデル（EIM） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: 学ぶ電解下大静脈モデルによるマウス静脈血栓誘導法。外科的露出、電流印加、血流存在下での血栓形成を含む。異なるマウス系統間の血栓サイズと可溶性ペクチン相関を評価する。

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NIH 1P01HL089407 - 01A1（ローレンス、PI）、動物のコアA、NIH 1 K01 HL080962 - 01A2（マイヤーズ、PI）によってサポートされています。

1。マウスの麻酔の手順<ol><li>動物は彼らのケージから取り出し、2％イソフルランと毎分0.5リットル（気化器制御）の流量で100％酸素でガスの誘導のための麻酔術前誘導のチャンバー内に配置されます。 </li><li>マウスは、麻酔の誘導チャンバ内鎮静チャンバーから除去し、髪の毛の脱毛は、（1分間）使用されている場合は腹側腹部を電気バリカンで剃毛、またはチャンバー内に保持されています。 </li><li>まだ鎮静下で、彼らの重量を測定している間、目がその後イソフルランと酸素を使用してノーズコーンと全身麻酔下に温水循環加熱装置に背recumbancyに配置された無菌の眼軟膏と、で潤滑されています。この時点で、酸素の割合は、毎分0.2リットルに削減されます。 </li><li>腹部はクロルヘキシジン液（クロルヘキシジン二酢酸は急速にbacterialcidalと持続性がある）を噴霧し、滅菌ガーゼで拭いて三回か手術部位はきれいになるまでさ。 </li></ol> 2。マウスマイクロ外科および回復手順<ol><li>腹側正中切開（2 cm）を腹部を露出皮膚や腹壁を通して虹彩をハサミで作られています。ガーゼの滅菌生理食塩水浸漬した2x2のは動物の左側に腸を反映するために使用されます。マウスの制止する人は、下大静脈（IVC）の可視化を可能にする場所に置かれている。 </li><li>この時点では、イソフルランを2％の保守レベルに低減され、酸素の割合は、外科的処置の残りのための毎分0.2リットルのままです。 </li><li>鈍的切開は、滅菌アプリケーター綿棒や余分な繊細な虹彩の半分の湾曲した組織鉗子を用いて促進される。ケアは、彼らは非常に壊れやすいために、マウス組織の取り扱いには注意が必要です。 </li><li>腎静脈から腸骨分岐へのすべてのIVCの側枝は、,7 - 0非反応性prolene縫合糸で結紮されています。バックの枝は、特許残った。 </li><li>電解IVCモデル（EIM）には、銀コーティング銅線（KY - 30 - 1 - GRN、Electrospec、ドーバー、ニュージャージー州）に接続されている25Gのステンレススチール針は、露出尾IVC、（図1）に挿入されますと前壁（陽極）に対して配置されます。 </li><li>別の線は、皮下回路（カソード）を完了注入される。 </li><li> 15分250以上のμAmpsの現在はグラスS48矩形波刺激装置と定電流ユニット（グラステクノロジー、アストロメッド社、ウェストワーウィ​​ック、ロードアイランド）を使用して適用した。血栓形成の環境とそれに続く血栓形成を促進するIVCの内皮表面を侵食し電気分解の有毒な生成物の形成における直流結果。 </li><li> 15分後、針が削除され、綿棒は、出血を防ぐために、地域との接触で穏やかに開催されます</li><li>シャム動物では、針は現在のアプリケーションなしで、IVC内に配置されてから削除されます。 </li><li>開腹部位は、2層方式で閉じられます。当研究室では、腹壁を閉じるには、連続的なパターンで5〜0 vicryl、合成縫合糸を、使用しています。接着剤の皮膚接着剤は、皮膚を閉じるために使用されます。除去するための外付縫合糸はありません。 </li><li>マウスは、その後、元の住宅に戻って、密接に加熱ランプ（24インチ離れてケージから分の距離）の下（2時間まで45分）手術後に観察された、個々のマウスのケージに回収されています。それは研究目的に干渉していない場合の鎮痛薬と抗炎症剤を用いることができる。科学的な鎮痛剤を差し控えることを正当化、獣医、そしてICUCAの承認が必要とされています。当研究室では、ブプレノルフィン,0.05 - 0 .1 mg / kgのSQは、マウスのための優秀なプリと術後の鎮痛剤であることを見出した。全身鎮痛薬は、実験結果を混乱させる可能性がある場合に加えて、4mg/kgでのリドカインは、（0.4 mlの1％溶液の/ kg）の切開部位に注入することができます。 </li><li>我々は一般的にDVTに起因する術後の副作用は発生しません。しかし、不利な術後の効果は、自発的な麻酔死、手術の失血、および神経の外傷に起因する部分的な麻痺を含めることができます。回復が遅い動物が飼育ヌートリアゲルであるか湿った固形飼料は、動物の回復を促進するためにケージの床に置くことができます。断絶術後合併症を有する動物を人道的に安楽死されるべきである。 </li><li>割り当てられた時点で、安楽死は、げっ歯類のための安楽死についてアメリカ獣医学協会のガイドラインで定められている勧告に従って人道的に行われます。 </li></ol> 3。代表的な結果 EIMは、連続的な血流の存在下で血栓形成モデルです。次の図は、このような斬新なモデルで検討したパラメータを示す。 <img src="/files/ftp_upload/2737/2737fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1 25Gステンレス鋼のdefinesthe解剖学的領域銀被覆銅線（KY - 30 - 1 - GRN、Electrospec、ドーバー、ニュージャージー州）に接続されている針は、挿入されます。リンパ節がほとんど存在していると尾IVCを見つけるために目印として役立つことに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2737/2737fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：2日間、異なる菌株のEIM後の血栓重量。予想されたように、血栓重量はPAI - 1 KOマウスと凝固亢進デルタCTマウスで大きい（^ CT）で低かった。 <img src="/files/ftp_upload/2737/2737fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3：可溶性P -セレクチン、深部静脈血栓症のためのメーカーは、異なる株で測定した。最高レベルが亢進デルタCTマウスで発見されたのに対し、最も低いレベルは、PAI - 1 KOマウスで発見された。 <img src="/files/ftp_upload/2737/2737fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 血栓重量およびP -セレクチン可溶性の間に図4の相関は、異なる株で発見された。注目すべきは、短い血栓サイズを生成されたグループで、検出されたP -セレクチン可溶性（PAI - 1 KOマウス）最も低かった。最大の血栓サイズを生成したグループでは、検出されたP -セレクチン可溶性（凝固亢進デルタCT）最高であった。 <img src="/files/ftp_upload/2737/2737fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5：血流の存在を実証するためには、超音波がEIMを受けたマウスで行われた。図5は、2日EIM後にマウスで行われた超音波を示しています。その後、試料は収穫だった。血栓の形状が流れの存在下で血栓形成を示唆することに注意してください

<ol><li>Diaz, J. A., Hawley, A. E., Alvarado, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombogenesis+with+continuous+blood+flow+in+the+inferior+vena+cava.+A+novel+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model.</a> Thromb Haemost. 104, 366-375 (2010).</li>
<li>Eitzman, D. T., Westrick, R. J., Nabel, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+activator+inhibitor-1+and+vitronectin+promote+vascular+thrombosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Plasminogen activator inhibitor-1 and vitronectin promote vascular thrombosis in mice.</a> Blood. 95, 577-580 (2000).</li>
<li>Myers, D., Farris, D., Hawley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectins+influence+thrombosis+in+a+mouse+model+of+experimental+deep+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Selectins influence thrombosis in a mouse model of experimental deep venous thrombosis.</a> J Surg Res. 108, 212-221 (2002).</li>
<li>Myers, D. D., Hawley, A. E., Farris, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-selectin+and+leukocyte+microparticles+are+associated+with+venous+thrombogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">P-selectin and leukocyte microparticles are associated with venous thrombogenesis.</a> J Vasc Surg. 38, 1075-1089 (2003).</li>
<li>Pierangeli, S. S., Barker, J. H., Stikovac, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+human+IgG+antiphospholipid+antibodies+on+an+in+vivo+thrombosis+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Effect of human IgG antiphospholipid antibodies on an in vivo thrombosis model in mice.</a> Thromb Haemost. 71, 670-674 (1994).</li>
<li>Pierangeli, S. S., Liu, X. W., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+thrombosis+in+a+mouse+model+by+IgG%2C+IgM+and+IgA+immunoglobulins+from+patients+with+the+antiphospholipid+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Induction of thrombosis in a mouse model by IgG, IgM and IgA immunoglobulins from patients with the antiphospholipid syndrome.</a> Thromb Haemost. 74, 1361-1367 (1995).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

マウスは 、in vivo実験での優れた研究ツールです。このように、密接に疾患や病態を模倣するマウスモデルの開発が必要である。光化学（2）、うっ血（3-4）と機械的外傷（5-6）：いくつかの静脈血栓症のマウスモデルを含むDVTを研究するために使用されています。しかし、これらのモデルのどれも連続的な血流の存在下で血栓を生成するために内部内皮刺激を使用します。 EIMは、IVC内に電解刺激を使用して、血流の存在下で内皮活性化（1）で静脈血栓形成を促進する。それは簡単に再現可能な、技術的に簡単であり、高い生存率（99％）を持っています。電流が電解を作成するために使用されているという事実にもかかわらず、熱は、（1）生成されません。 EIMのモデルは密接に臨床DVTをシミュレートし、そのため血栓形成と解決の本質的なメカニズムを研究するための貴重なツールとして機能します。 EIMのモデルでは、血栓症の疾患に対する新しい治療法の進歩にも便利です。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

静脈血栓症の電解下大静脈モデル（eim）

Electrolytic Inferior Vena Cava Model (EIM) of Venous Thrombosis

動物モデルでは血栓形成、血栓溶解を研究するために、潜在的な治療用化合物（1）をテストするために、深部静脈血栓症（DVT）の研究において重要な役割を果たす。 DVTの治療と予防に利用される新たな化合物は、現在開発されている。影響を受ける血栓静脈への潜在的な治療アンタゴニスト化合物の配信が問題となっている。治療への応用の文脈では、部分的な停滞を使用し、一貫して主要な静脈内に血栓を生成するモデルは、最近設立されました。電解下大静脈モデル（EIM）は、連続的な血流の存在下で血栓形成を可能にDVTのマウスモデルです。このモデルでは、治療薬は、動的な方法で血栓と接触することができ、DVT（1）の他のモデルよりも敏感です。さらに、この血栓モデルは密接に血栓形成の臨床的な状況をシミュレートし、静脈内皮細胞の活性化、白血球遊走、静脈血栓、および治療への応用をテストする（1）を研究する理想的です。 EIMのモデルは簡単に​​再現可能な、技術的に簡単である、一貫性のある血栓の大きさを作成し、分析目的のために必要とされる大規模なサンプル（例：血栓と静脈の壁）が可能になります。

内皮活性化と部分的な鬱血、ウィルヒョウの三つ組の二つの成分に起因する静脈型血栓形成における下大静脈の結果の内部表面に内皮活性化の電解誘導。

静脈血栓症の電解下大静脈モデル（EIM）

深部静脈血栓症（DVT）の研究において、動物モデルは血栓の形成や解消を研究し、潜在的な治療法の検討を行うために不可欠な役割を果たしています。

この手順の全体的な目的は、電解下大静脈（IVC）モデルを用いてマウスに静脈血栓を誘発することです。まず、腹腔を開いて下大静脈（IVC）を露出させます。次に、IVCの側枝を結紮します。次に、陽極と陰極を挿入し、血栓を誘発するために電流を印加します。最後に、動物を縫合し、回復させます。最終的に、血流がある状態でマウスの下大静脈（IVC）内に静脈血栓が形成されたこと、および異なるマウス系統におけるペクチンのレベルと血栓の大きさとの相関を示す結果を得ることができます。Lucchesi博士は1980年にこの手法のコンセプトを発表し、動脈系で成功裏に適用しました。私がミシガン大学の研究室に加入した際、この元の手法を静脈系で使用できるよう修正することが任務となりました。この過程で、血流の方向に合わせ、下大静脈（IVC）の起始部付近に針を挿入することを考案しました。マウスに深部静脈血栓症を誘発させるため、まず術前導入チャンバー内で5% isof fluorineおよび100% oxygenを0.5 liters per minuteの流量で投与し、動物を麻酔します。マウスが鎮静された後、導入チャンバーから取り出し、電気バリカンで腹側を剃毛します。次に、マウスの体重を測定します。次に、眼軟膏を塗布し、イソフルランと100%酸素による全身麻酔下で、温水循環式加熱パッドの上に背中を下にして安置します。切開部位を消毒するため、腹部にクロルヘキシジン溶液をスプレーし、滅菌ガーゼで拭き取ります。この操作を3回、または手術部位が清潔になるまで繰り返します。手術を開始するために、アイリスシザーを用いて皮膚および腹壁に2 cmの腹側正中切開を加え、腹部を露出させます。滅菌生理食塩水に浸した2×2インチのガーゼを用いて、腸管を動物の左側に寄せます。次に、マウス用固定具を装着し、下大静脈（IVC）を露出させます。これ以降、維持レベルとして2% isof fluorineおよび0.2 liters per minuteの酸素を使用します。滅菌済みのアプリケーター綿棒と極細のアイリス半分曲組織鉗子を用い、IVCおよびその分枝に完全にアクセスできるよう、IVC両側の筋膜を鈍的に剥離します。リンパ節が近くにあるため、これを指標としてIVCを探し、7-0非吸収性プロリン縫合糸で結紮してください。腎静脈から腸骨分岐までのすべての下大静脈（IVC）側枝を結紮します。後枝は開存させたままにします。次に、銀コーティング銅線を装着した25ゲージのステンレス製針を、露出したIVCに挿入し、前壁に沿わせて配置します。これがアノードです。次に、ワイヤーを取り付けた別の針を皮下に挿入し、回路を完成させます。これがカソードです。Grass S 48 方形波刺激装置と定電流ユニットを使用し、250 microamps の電流を 15 分間印加します。これにより、IVC の内皮表面が侵食され、コントロール用の血栓が形成されます。動物のIVCに針を挿入し、電流を印加せずに 15 分間保持します。手技中に、針の近くに小さな黒点が出現するといった軽微な変化が通常観察され、これにより手技の成功が確認されます。15分後、針を背側に下げて抜き取り、針の刺入点上の綿棒を用いて、針の周囲の下大静脈（IVC）腔内に血液が充填されるようにします。針を抜く際は、静脈を上から押さえてください。出血が止まるまで、綿棒で静かに圧迫します。開腹部位を閉じるには、5-0 Vicryl 合成縫合糸を用いて、腹壁を連続縫合します。次に、皮膚を閉じるために組織用接着剤を塗布します。マウスを個別のケージに入れ、保温ランプの下で回復させ、元の飼育ユニットに戻すまで注意深く観察してください。EIMは、連続的な血流が存在する状態で血栓を形成させるモデルです。以下の図に、この新規モデルで調査したパラメータを示します。血栓サイズの指標である血栓重量について、予想通りEIMの2日後のマウス系統における結果を提示します。ELA可溶性ペクチンを用いて、フィブリノリシスが亢進しており結果として血栓が小さくなることが知られているPA Iノックアウトマウスでは血栓重量が低く、一方で過凝固状態のdelta CTマウスでは血栓重量が高くなりました。また、異なる系統において深部静脈血栓症のマーカーを測定したところ、PIノックアウトマウスで最も低値であり、過凝固状態のdelta CTマウスで最も高値であることが分かりました。このグラフは、より小さな血栓サイズを形成したPI oneノックアウトマウスにおける、異なるマウス系統間の血栓重量と可溶性ペクチンの相関を示しています。検出された可溶性ペクチンは最も低値でしたが、一方のdelta CTマウスでは最大の血栓サイズが形成され、検出された可溶性ペクチンのレベルは最も高値でした。血流の存在を実証するため、EIMを施行しているマウスに対して超音波検査が行われました。この図は、EIMから2日後のマウスの超音波検査結果を示しています。血栓の形状から、本手順中の血流が存在する状態で形成されたことが示唆されます。常に被験個体の状態を注意深く観察することが重要です。低体温症は、術後の動物に深刻な影響を及ぼし、動物の生命および研究結果を左右する極めて重要な要因です。

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