Name: カテゴリの検出細菌性病原体のための生物発光レポーターファージ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶバイオ発光レポーターファージを用いたYersinia pestisの迅速検出法。遺伝子工学により細菌ルシフェラーゼを導入し、数分で病原体を同定する微生物学的手法です。

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この研究は国立衛生研究所（NIH）の中小企業イノベーション研究プログラム（NIAID、1R43AI082698 - 01）と食糧農業のUSDA国立研究所（NIFA、2009-33610-20028）によってサポートされていました。

（1）Y.ペストのプレートの接種<ol><li>ストリークY.ペスト A1122（BeiResources＃NR15）ストック培養ルリア-ベルターニ（LB）寒天（ミラー）上に。無菌操作を使用し、すべてのYを行うクラスII型バイオセーフティーキャビネット。Y.におけるペストの操作ペスト A1122はバイオセーフティレベル（BSL）2除外選択エージェントの株である。それは、プラスミド75キロバイトのペア低カルシウム応答（LCR）病原性の両方を欠いている、と病原性に必要なPGMの軌跡。 Yを拡大28℃ ペスト ℃の空気インキュベーターを制御する静的な温度で48時間。 Yの成長率ペスト菌は 1.25 H 9の世代時間と遅いです。 </li></ol> （2）Y.ペスト菌の液体培地接種<ol><li>単一のYを転送する滅菌金属接種ループを使用してLBブロス2 mLを含有する滅菌17 × 100mmの培養チューブにペスト菌のコロニー。サイズの均一なコロニーを選択し、他のコロニーを示している、と明らかにプレート上のコロニーの残りの部分から分離されている。軽くボルテックスチューブと28で文化を育てる° C振盪インキュベーター（225 rpm）で約20時間。 </li></ol> （3）Y.ペスト菌の伸長、レポーターファージ加え、そして生物発光検出<ol><li>一晩Yを薄めるペスト菌の培養50mlファルコンチューブに新鮮なLBブロス（例えば、培地の9.5 mLに細胞を500μL）に1:20 ° C（225 rpm）で振とうしながら28で成長する。 0.2の600 nm（A 600）での光学密度（約5時間）に達するまで成長する。生物発光反応を形質導入するファージの能力は、宿主細菌の生存と適応度に相関しているので、活発に増殖する細胞は、検出のために好ましい。それにもかかわらず、検出システムは、成長のサイクル7のすべての段階で採取された細胞との互換性であることが示されている。 </li><li> 2パーセントのn -デカナール溶液を調製することにより生物発光反応に必要な基質を生成する。 LBブロスの9.8 mLでのn -デカナール200μLを混合。 5秒間激しくボルテックスプライム2％のn -デカナール溶液2mLを持つマイクロプレートルミノメーターインジェクタ。ルミノメーターはよくして、各プレートにデカナールソリューションの67μLをautoinject直ちに10秒間のサンプルを読み込むようにあらかじめ設定さ</li><li> 3文化のチューブにLBブロス1 mLのアリコートを分注する。各チューブにレポーターファージストック溶液（5 × 10 9プラーク形成単位の株式[PFU] / mL）を20μLを追加し、ファージとメディアだけではサンプルは、ネガティブコントロールとして機能します。 Yの不在でペスト菌の細胞は、レポーターファージの追加により、生物発光反応を引き出すしないでください。 </li><li> Y. 1mLのアリコートを分注する6培養管にペスト菌の培養（ステップ3.1から）。文化の3（試験培養）にレポーターファージストックの20μLを追加。残りの3の文化は"単独で細胞のネガティブコントロール（バックグラウンドのautobioluminescence）として機能する。手短にボルテックスで文化をミックスし、各サンプルから収穫200μL（時間0読み取り用）と白色96ウェルマイクロタイタープレートに分注する。 28で、残りの培養液を、Cを（225 rpm）で振盪しながら。 </li><li>マイクロプレートルミノメーターを用いて生物発光の時間0サンプルを（相対発光ユニット、RLU）を測定します。 </li><li> 10以降の各サンプルの収穫200μL、20、30、40、50、および60分後のレポーターファージのほか、生物発光用の試料を測定する。 Y.場合ペスト菌の細胞が存在し、レポーターファージは、特に、細胞に結合し、そのDNAを注入し、luxABレポーター遺伝子（図1）転写と翻訳するの転写と翻訳機構をホストが使用されます。 </li><li>信号の強さと信号の応答時間が存在する細胞の数に比例します。細胞（10 5〜10 8 CFU / mL）を、対照と比較したRLUの大幅な増加が高濃度で20分以内に明らかにする必要があります。低細胞濃度では、（10 2 -10 4 CFU / mL）を、RLUの著しい増加は40〜60分以内に明らかにする必要があります。 </li><li>また、Y.を必要とせずに検出プロセスを迅速化するペスト菌の伸長は、新鮮な成長プレートからコロニーを、レポーターファージを保有するLBブロス200μLのを1.5mlのエッペンドルフチューブに直接（ボルテックス）混合することができる。マイクロタイタープレートのウェルに細胞/ファージ混合液を分注する。 28℃でマイクロタイタープレートをインキュベートし、60分（シングル時のポイントのみ）後の生物発光のためにサンプルをお読みください。 </li></ol> 4。代表的な結果： Yのレポーターファージを介した検出の代表的なタイムコース実験ペスト菌を図2に描かれている。 1の陰性コントロール）ファージ単独で（無細胞）、または2のみ）セル（無ファージ）60分株式会社を通じて約20 RLUの生物発光のベースラインレベルを提供ubation（ベースラインのレベルはルミノメーター固有のもの）。対照的に、テストサンプル（レポーターファージや細胞）のための生物発光の増加は、ファージ添加後15分で明らかである。信号強度は、60分かけて徐々に増やす必要があります。長期期間（80分以​​上）のためのインキュベーションは、宿主細胞の媒介溶解をファージに起因するピーク信号から減少する信号となります。同様の結果が37のインキュベーションの温度で得られる° Cにもかかわらず、Yの最適温度ペスト菌の成長は28℃で9です。 <img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 Yのファージを介した生物発光検出ペスト 。0の時点で、レポーターファージ、細胞を28℃でインキュベートし、混合し、そして生物発光は（RLU）を経時的にモニターした。 RLUの大幅な増加は、（*学生t -検定、p &lt;0.05）が15分以内に明らかである。

<ol><li>Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threats+in+bioterrorism.+I%3A+CDC+category+A+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Med+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents.</a> Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).</li>
<li>Chu, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChu%2C+MC+%22Laboratory+manual+of+plague+diagnostic+tests.%22">Laboratory manual of plague diagnostic tests.</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta. (2000).</li>
<li>, (1999).</li>
<li>Inglesby, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthrax+as+a+biological+weapon%2C+2002%3A+updated+recommendations+for+management%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management.</a> JAMA. 287, 2236-2252 (2002).</li>
<li>Schuch, R., Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+genomic+analysis+of+the+Wbeta+and+gamma+phages+infecting+Bacillus+anthracis%3A+implications+for+evolution+of+environmental+fitness+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance.</a> J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).</li>
<li>Garcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+Yersinia+pestis+bacteriophage+phiA1122+reveals+an+intimate+history+with+the+coliphage+T3+and+T7+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes.</a> J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).</li>
<li>Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+bioluminescent+phage+for+detection+of+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).</li>
<li>Schofield, D. A., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-mediated+bioluminescent+detection+of+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis.</a> Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).</li>
<li>Chu, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChu%2C+MC+%22CDC%3A+Basic+laboratory+protocols+for+the+presumptive+identification+of+Yersinia+pestis%22">CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. 1-19 (2001).</li>
<li>Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+differentiation+between+Pasteurella+pestis+and+Pasteurella+pseudotuberculosis+by+action+of+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage.</a> J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).</li>
<li>Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Action+of+Pasteurella+pestis+Bacteriophage+on+Strains+of+Pasteurella%2C+Salmonella%2C+and+Shigella%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella.</a> J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).</li>
<li>Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+Yersinia+pestis+using+amplification+of+plague+diagnostic+bacteriophages+monitored+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR.</a> PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このメソッドは、急速にYを検出するレポーターファージの能力を示していますレポーターファージからペスト菌は、培養Yに生物発光シグナルの応答を伝達することができるファージの添加後20分以内ペスト菌の細胞。レポーターファージはまた、直接Yを検出することができる分離とその後の栽培7の前提条件なしに臨床マトリックスにおけるペスト 、。一般的に完了するための48時間を必要とする標準的なファージの溶解アッセイと比較して、これは大幅に検出する時間が短縮されます。 これまでの研究では、野生型ΦA1122のファージは、ほぼすべての自然なYを溶解できることが実証されているペスト菌の分離株、 および Yのための&quot;特定&quot;です。 ペスト 6,10,11、しかし、いくつかY.偽結核の菌株は20℃6,10,12以上の温度で増殖させた場...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> Difco社製LB寒天、ミラー</td><td> VWR </td><td> 90003-346 </td></tr><tr><td> Difco社製LBブロス、ミラー</td><td> VWR </td><td> 90003-350 </td></tr><tr><td> 17 × 100 mmの培養管</td><td>米国サイエンティフィック</td><td> 1485-0810 </td></tr><tr><td> N -デカナール</td><td>シグマ</td><td> D7384 </td></tr><tr><td> VERITASマイクロプレートルミノメーター</td><td>ターナーバイオシステムズ</td><td> 9100-001 </td></tr><tr><td>マイクロライトマイクロタイター96ウェルプレート</td><td> VWR </td><td> 62402-984 </td></tr></tbody></table>

カテゴリの検出細菌性病原体のための&quot;生物発光&quot;レポーターファージ

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

ペスト菌と炭疽菌は、それぞれ1、ペストや炭疽の原因物質である細菌性病原体カテゴリです。両疾患"の自然発生は、今は比較的まれですが、生物兵器としてこれらの病原体を使用して、テロリスト集団の可能性は本当のです。病気の本質的な伝達性、急速な臨床経過、及び高い死亡率のため、発生を迅速に検出することが重要です。したがって、迅速な検出と診断を提供する方法論は、公衆衛生対策と危機管理の活性化の即時実施を確保するために不可欠です。 組換えレポーターファージは、Yの検出のための迅速かつ特異的なアプローチを提供することがありますペストとB.炭疽菌。疾病管理予防センターは、現在、これらの細菌性病原体2-4の確認同定のために古典的なファージの溶解アッセイを使用してください。これらのアッセイは、自然に彼らの細菌のホストの特定および溶解性であるファージを発生し活用する。特定のファージの存在下で培養細菌の一晩増殖した後、プラーク（細菌の溶解）の形成は、細菌のターゲットの肯定的な識別を提供する。これらのアッセイは堅牢ですが、彼らは3つの欠点に苦しむ：1）彼らは、実験室ベースで、2）彼らが疑われる試料から細菌の分離培養を必要とし、3）彼らは、完了までに24〜36時間かかります。これらの問題に対処するため、組換え"光-タグ"レポーターファージは遺伝的にYのゲノムにビブリオharveyi luxABの遺伝子を統合して設計されたペストとB.炭疽菌の特定のファージ5-8。結果luxABレポーターファージが急速にすることで、特定のターゲットを検出することができた（分以内）と敏感に受容細胞に生物発光表現型を付与する。重要なのは、検出が培ってきたレシピエント細胞にまたはモック感染臨床検体7とどちらが得られた。 デモンストレーションの目的で、ここでは知られているYのファージを介した検出のための方法を説明します。 ペスト菌は CDCペスト診断ファージΦA11226,7（図1）から構成さluxABレポーターファージを用いて分離する。軽微な変更（成長温度やメディアの例：変更）、と同様の方法は、Bの検出に使用されることがあります炭疽菌はB.を使用して隔離炭疽菌のレポーターファージWβ：：luxAB 8。方法は、栽培Yにbiolumescent表現型のファージを介した情報伝達を説明しますその後、マイクロプレートルミノメーターを用いて測定しているペスト菌の細胞。伝統的なファージの溶解アッセイに比べてこの方法の主な利点は、使いやすさ、迅速な結果、そして96ウェルマイクロタイタープレートフォーマットで同時に複数のサンプルをテストする機能です。 <img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。検出の回路図。ファージを試料と混合され、ファージが細胞に感染する、luxABが発現し、細胞のbioluminescesされています。サンプルの処理が不要です。ファージや細胞を混合し、続いて光を測定している。

優先細菌性病原体の同定のための簡単​​な方法は、遺伝子組み換えレポーターファージを使用することです。その特定の宿主種に固有のこれらのレポーターファージは、、急速に宿主細胞に生物発光信号応答を伝達することが可能です。ここで、我々は、検出のためのレポーターファージの使用について説明します。<em&gt;ペスト菌</em&gt;。

Yersinia pestisおよびBacillus anthracisはカテゴリーAの細菌性病原体であり、それぞれペストおよび炭疽病の原因菌である1。...

Yesinia PestisおよびBacillus Anthraxは、それぞれペストおよび炭疽病の原因菌であるカテゴリーAの細菌性病原体です。現在、両疾患の自然発生は比較的まれになっていますが、テロリスト集団がこれらの病原体を生物兵器として利用する可能性は現実的な脅威となっています。本ビデオでは、yersinia pestisを検出および同定する方法を実演します。まず、微生物を農業用プレートおよび液体培地で培養します。次に、y pesti特異的リポーターpHを培養液に添加します。このリポーターpHのゲノムには、細菌ルシフェラーゼをコードするluxE AB遺伝子が含まれています。Y. pestis細胞が存在する場合、レポーターファージが細胞に特異的に結合し、luxe AB遺伝子を含む組換えDNAを注入します。そして、宿主の転写および翻訳機構を利用してluxe ABレポーター遺伝子を転写・翻訳します。その結果、サンプルが生物発光表現型を獲得したことが示され、未知の微生物がY. pestisであると正しく同定されます。従来のファージ溶菌アッセイなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、Y. pestisの検出および同定に要する時間が数日ではなく数分であることです。この方法は、分離培養物、あるいは複雑な臨床検体や環境サンプルから直接、Y. pestisの存在を迅速に同定・検出するのに役立ちます。この手法の意義はペストの診断へと広がる。なぜなら、この疾患は症状の発現から24時間以内に治療が行われない場合、通常は致命的となるからである。したがって、良好な予後のためには Yersinia pestis の迅速な特定が不可欠である。ほぼすべての細菌種にファージが存在するため、この手法は Y. pestis 以外に医学的、環境的、あるいは農業的に重要なあらゆる種に適用できる可能性がある。A 1122は、バイオセーフティレベル2の除外選択病原体株です。本株は、病原性に必要な75 Kilobase Perloカルシウム応答またはLCR病原性プラスミドおよびPGM遺伝子座の両方を欠いています。この手順は、クラス2タイプAのバイオセーフティキャビネット内で、無菌操作を用いてY. pestis A 1122の画線培養から開始してください。ここに示すように、ストック培養物をLBアガーにストリーキングします。プレートを倒立させた状態で、温度制御された静置空気インキュベーターに入れ、28°Cで48時間培養します。Y pestisの増殖速度は遅く、2日後の世代時間は1.25時間です。滅菌済みの金属製接種ループを使用して、y pestisの単一コロニーをピックアップします。サイズが均一で、他のコロニーを代表しており、プレート上の他のコロニーから明確に分離しているコロニーを選択してください。そのコロニーを、2 mLのLBブロスを含む滅菌済みの17 × 100 mm培養チューブに転移します。チューブにキャップをして短時間ボルテックスし、その後、28°C、225 RPMの振盪インキュベーターに約20時間置きます。このアッセイでは、検出のために活発に増殖している細胞が好ましいです。ファージの形質導入能により、生物発光応答は宿主細菌の生存率および適応度と相関します。それにもかかわらず、この検出システムは、増殖サイクルのあらゆる段階で回収された細胞と互換性があることが示されています。20時間の培養後、500 µLの細胞を10 mLのlb brothに加えることで、50 mLコニカルチューブ内でY pestis培養液を20倍に希釈します。その後、培養液を28 °Cの振盪インキュベーターに戻します。600ナノメートルにおける光学的密度（OD600）が0.2に達するまで培養します。生物発光反応基質を生成させるために、通常は約5時間かかります。200µLのN-デカナールを9.8mLのLB培地に混合し、2%N-デカナール溶液を調製します。5秒間激しくボルテックスします。次に、マイクロプレートルミノメーターのインジェクターをプライミングします。インジェクターチューブの一端を2%のend decal溶液が入った13 mLチューブに、もう一端を廃棄容器に入れます。装置ソフトウェアを使用して、2 mLのデカナール溶液でインジェクターラインをプライミングするように指示します。完了するとラインに基質が充填されます。インジェクターの先端ラインを元の位置に戻し、ウェルへの注入準備を整えます。次に、ルミノメーターに指示し、各マイクロプレートに67 µLの溶液を自動注入します。その後、直ちに10秒間の生物発光レベルを測定します。次に、各サンプルを調製するため、各条件につき3本の培養チューブにトリプリケートでラベルを貼ります。ここでは、テストサンプルの他に、フェーズのみのコントロールと細胞のみのコントロールを調製します。したがって、ファージのみのコントロールサンプルを調製するために9本のチューブが必要です。3本の培養チューブにLBブイヨンを1 mLずつ分注します。各チューブに、5 × 10⁹ plaque forming units（PFU）/mLを含むレポーターファージのストック溶液を20 µLずつ加えます。Y pesti細胞が存在しない場合、レポーターファージを添加しても生物発光反応は誘導されないはずです。次に、試験サンプルを調製するため、Y pesti培養液を1 mLずつ3本の培養チューブに分注します。そのうち3本の培養液に、レポーターファージストックを20 µL添加します。ボルテックスで短時間混合し、細胞のみを準備します。バックグラウンドの自発的生物発光を測定するためのネガティブコントロールとして、Y pestis培養液を1 mLずつ、さらに3本の培養チューブに分注します。サンプルの準備が完了したら、タイムゼロ（0分）の測定のため、各培養液から200 µLを白色の96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに転写します。各培養液の残りを、マイクロプレートルミノメーターを用いて28 °Cのシェーカーに配置します。時間を測定します。バイオルミネセンスまたは相対光量（RLU）のゼロ点サンプルを測定します。各培養液から200 µLを回収し、マイクロプレートルミノメーターを用いて20、30、40、および60分に生物発光測定を行います。y pestisを増殖させることなく検出プロセスを迅速化するため、レポーターファージを添加します。新鮮に培養したプレートからコロニーを回収し、レポーターファージを含む200 µLのlbが入ったマイクロ遠心チューブに移します。サンプルをボルテックスで混合し、細胞とファージの混合液をマイクロタイタープレートのウェルに分注します。マイクロタイタープレートを28 °Cで60分間インキュベートします。その後、サンプルの生物発光を測定します。このビデオで実演したアッセイは、導入部で説明したようにY pesti細胞の存在を検出します。y pestisが存在する場合、レポーターファージは細胞上の特定の受容体に結合してDNAを注入し、宿主の転写および翻訳機構を利用してluxレポーター遺伝子を転写および翻訳します。信号強度と信号応答時間は、1 mLあたり10⁵から10⁸ CFUという高濃度の細胞が存在する場合、その細胞数に比例します。低濃度の細胞濃度（10²〜10⁴ CFU/mL）では、対照群と比較して20分以内にRLUの有意な増加が認められるはずです。また、40分から60分以内にRLUの有意な増加が認められるはずです。ここでは、Y. pestisのレポーター・ファージ介在検出における代表的なタイムコース実験の0分時点を示します。レポーターファージと細胞を混合し、28 °Cでインキュベートして、生物発光 RLU を経時的にモニタリングした。12分以内に RLU の上昇が認められ、P値が P < 0.05 で有意であった。一方、ファージのみまたは細胞のみの陰性対照では、60分間のインキュベーションを通じて約 20 RLU というベースラインの生物発光レベルを示した。なお、ベースラインレベルはルミノメーターによって異なる点に注意されたい。対照的に、テストサンプルのレポーターphant細胞では、phia添加から12分後に生物発光の増加が認められます。シグナル強度は50分間にわたって着実に増加しますが、ここでは示していませんが、80分を超える時間でインキュベートすると、ファージによる宿主細胞の溶菌により、ピークからシグナルが低下します。Y pestisの増殖に最適な温度は28 °Cですが、37 °Cのインキュベーション温度でも同様の結果が得られます。このビデオを視聴することで、検出のための組み換えレポーターの使用方法について十分に理解できるはずです。Yersinia pestisの同定方法を習得すれば、S Golden Coloniesを初期接種菌として使用し、30分でこの手法を実施することが可能です。この手順を試行し、研究室でファージを使用する際は、細菌ストック培養物がファージによって非常に汚染されやすいことを念頭に置き、汚染の可能性を低減させることが重要です。使い捨てのプラスチック器具およびピペットチップを使用し、定期的に手袋を交換してください。レポーターによるBlum反応の誘発能は、細胞の適合性と相関しています。したがって、Yesenia Pestaの同定後、このレポーターを用いて分離株の抗生物質感受性を決定することができます。例えば、抗生物質の阻害濃度でインキュベートしたYesenia pesta細胞は、生物発光シグナルを産生できなくなるか、あるいはその能力が著しく制限されます。対照的に、抗生物質耐性を持つYesenia pesta細胞は、抗生物質の存在によって影響を受けず、阻害されていない細胞と同等の生物発光反応を示すことができます。これにより、病原体の抗生物質への感受性プロファイルを迅速に決定することが可能です。例示のため、減毒化したYersinia pestis株を使用しました。本実験において、Yersinia pestisは細菌性病原体というカテゴリーに属します。Yersinia pestisが含まれていると想定されるサンプルを用いて本手法を行う際は、適切なバイオセキュリティおよびバイオハザード対策を講じなければなりません。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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関連する原則を調査し、フルオロフォアおよび抗体標的条件は多岐との互換性を実証することによって発光（燃料）から未励起によって蛍光の基礎と応用性を拡大しています。...

BRET歩：バインドされていない励起による蛍光発光から（燃料）

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発光細菌クオラムセンシングなどのメカニズムのさまざまな光の生産を調節します。この手法では、生物発光における原位置調査および細胞密度に発光の相関をことができます。人工の発光性大腸菌システムはluxオペロン、ルクスのタンパク質及びその相互作用の特性をことができます。...

その場で測定と細胞密度の相関、発光細菌の発光

ここで説明は、動物組織細胞レベルでの細菌の遺伝子発現解析の方法です。このメソッドは、組織環境への応答で感染症に細菌の人口の内で発生する表現型の多様性を研究するためのリソースを提供します。...

感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

ここでは、感染時の病原菌の臓器全体にわたる検出と蛍光レポーター活性の定量化を可能にする手順について説明します。...

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

学ぶバイオ発光レポーターファージを用いたYersinia pestisの迅速検出法。遺伝子工学により細菌ルシフェラーゼを導入し、数分で病原体を同定する微生物学的手法です。

カテゴリの検出細菌性病原体のための"生物発光"レポーターファージ

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