Name: 軸索のストレッチの成長：神経成長のメカノトランスダ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 学ぶ軸索ストレッチ成長法による神経組織工学。バイオリアクターで軸索を1日最大10mmに伸長し、神経損傷治療や神経系の発達メカニズム解明に応用する革新的培養技術です。

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この作品は、NSF CAREER CBET - 0747615によって賄われていた。著者は、博士に感謝します。彼らの指導と支援のためのダグラスH.スミスとデビッドF.ミーニー。

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</ol>

神経細胞の ex - vivoで機械的な伸びは、米国特許＃6264944と＃7429267の下に特許を取得しています。

二つの重要なステップは、バイオリアクターの製造中に観察する必要があります。最初に、基板界面での最適なオーバーラップは、軸索が静止基板上に交差することができることを保証するために必要です。過度にカールしたり、そうでなければ不完全さACLARは（図3）は使用しないでください。オーバーラップを最適化するために、曳航基板が2〜3ミリメートル長い接触パッチに均一に固定基板を均一にサンディングし、コンタクトしていることを確認します。オーバーラップは、慎重に曳航脚の高さを調整することによって、前に、各実験に最適化する必要があります。 第二に、神経細胞の付着のために提供しながら、基板のコーティングは、バイオリアクターの変位と軸索の収縮張力（;フィスター、岩田ら2004;。。Loverde、Ozokaら 2011 HeidemannとBuxbaum 1990）によって引き起こされるかなりのシェアーリング力を維持する。基板は、前のリジンコーティングすると後の両方の滅菌水で十分に洗い流してください。コー​​ティングはたての融解アリコートから適用し、できるだけ均等に分散させる必要があります。接着期間中に重要なことは、基板を移動されるべきではない、あるいは乱れ。以降の手順では、メッキ中に基板に触れないように注意してください、と離れて基板界面からの車線の遠端からピペットすべてのソリューションを。 各バイオリアクターのコンポーネントの接続の公差は、緩みの形で現れます。自動化されたリニアモーションテーブルの動きが牽引、ブロックの動きなしに発生するようにASGの初期期間中は、システム内の緩みは明らかです。スラックは、実験ごとに異なりますが、我々の経験では一般的に&lt;1 mmですできます。このような理由から、&quot;プリテンション&quot;1mm/dayのたるみ除去の段階では、一日のために、バイオリアクターの部品が牽引基質の動きを引きつけ、開始、その間ASGスケジュールの前に。 プリテンションのフェーズが完了した後に自動直動テーブルの変位ステップが牽引、ブロックの変位と一致しない場合のトラブルシューティングが必要な場合があります。曳航ブロックの非同期、不正確な変位は、アダプタの曳航ハードウェアと屈曲内で&quot;静止摩擦&quot;や静止摩擦に関連付けられています。発生からこれらの問題を防ぐために、曳航ブロックの動きがスムーズに近い楽な動きのために、組み立て後に、手作業でチェックする必要があります。バインディングが発生した場合、曳航アセンブリは、実験の前に解放されるべきです。アダプタの十分な剛性も曳航ハードウェアの静止摩擦によって克服されていない正確な、同期変位を確保する必要があります。

<table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネントの名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ポリエーテルエーテルケトン（PEEK） </td><td>マクマスター - カー、エルムハースト、イリノイ州</td><td> 8504K69 </td><td>カスタムは、バイオリアクターチャンバーを作った</td></tr><tr><td>ポリカーボネート</td><td>マクマスター - カー、エルムハースト、イリノイ州</td><td> 8574K28 </td><td>カスタムは、バイオリアクターチャンバーの蓋をした</td></tr><tr><td>ステッピングモーター</td><td>適用されるモーション製品、ワトソンヴィル、カリフォルニア州</td><td> HT23 - 397 </td><td></td></tr><tr><td>リニアモーションテーブル</td><td>サーボシステム、モントビル、NJ </td><td> MIPS - 2 - 10〜1.0ミリメートル</td><td></td></tr><tr><td>ステップモータ駆動制御装置</td><td>適用されるモーション製品、ワトソンヴィル、カリフォルニア州</td><td> Si2035 </td><td></td></tr><tr><td> ACLAR </td><td>構造プローブ（株）、ウエストチェスター、ペンシルバニア州</td><td> 1859 </td><td>曳航文化基質</td></tr><tr><td>第1カバースリップ</td><td>脳リサーチラボ、ニュートン、マサチューセッツ</td><td> 4865から1 </td><td>静置培養の基質</td></tr><tr><td>シリコンRTV </td><td>マクマスター - カー、エルムハースト、イリノイ州</td><td> 7587A37 </td><td></td></tr><tr><td>綿棒</td><td>マクマスター - カー、エルムハースト、イリノイ州</td><td> 7074T62 </td><td></td></tr><tr><td>ポリ- D -リジン</td><td> BD、ベッドフォード、マサチューセッツ</td><td> 354210 </td><td></td></tr></tbody></table>

軸索のストレッチの成長：神経成長のメカノトランスダ

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

シナプス前胚発生時に、神経突起の成長円錐を経由して、その目標を達成するために短い距離を通過する。時間が経つにつれて、神経somaの複数形が原因で大きくするには、生物の骨格成長（。。グレー、Hukkanen ら 1992ワイス1941年）に、その軸索末端から分離されています。このメカノトランスダクションには、軸索の継続的な伸びに対応できる神経細胞の成長の二次モード誘導（ブレイ1984; HeidemannとBuxbaum 1994; Heidemann、ラムルーら1995;。フィスター、岩田ら2004。）。 軸索のストレッチの成長（ASG）が考えられる長い神経と大人の神経系の特徴的な白質の器官に短い胚のプロセスの成熟化の中心的な要因である。 in vitroで ASGの勉強に、我々は、ニューロン培養の短い軸索のプロセス（Loverde、Ozoka ら、2011）に張力を適用するバイオリアクターを設計した。ここで、我々は、細部我々はバイオリアクターを準備し、ASGを行うために使用するメソッドを。最初に、バイオリアクターの各ストレッチ車線内で、神経細胞は、マイクロ操作曳航基板上にメッキされています。次に、神経細胞は静止基板上に、成長円錐の拡張によって、それらの軸索のプロセスを再生成する。最後に、ストレッチの成長は、めっきされた細胞体は離れて静止して基板に付着して軸索末端から曳航によって実行されます。成長円錐の拡張子の後に骨格の成長をrecapitulating。 同時に増加した軸索の直径（スミス、Wolf らの結果ながら、2001;;前の仕事は、後根神経節の神経細胞が10cmまでの長さに達し、最高10mm/dayまで前例のない成長率が可能な胚性ラットのASGのことが示されているフィスターを、岩田ら2004;。フィスター、Bonislawski ら2006;。フィスター、岩田ら2006;。スミス2009）。これは、再生、成長円錐の拡張子（機械的刺激の非存在下での）成長率3センチメートル未満の長さに制限が成功再生を伴う平均1mm/day（。。フィスター、ゴードンら 2011 Fuとゴードン1997）への劇的な対照的ですしたがって、ASGのさらなる研究は、機械的刺激のない状態で再生を制限する調節不全成長メカニズムを明らかにするために役立つことがあります。

ユニークな組織工学の手法は、軸索の伸長の成長をrecapitulatingで培養中の多数の神経線維を伸長するために開発された、神経は大きくするには身体の成長と一緒に細長いそれによって神経系の成長の形。

シナプス前胚発生において、神経突起は成長円錐を介して短距離を移動し、標的に到達します。時間の経過とともに、神経細胞体は...

本実験の全体的な目的は、ニューロンの軸索突起に牽引力を加え、その成長を刺激および維持させることです。これは、リアクターによって制御されるコンピューターを用いて、マイクロマニピュレーターで操作可能な牽引基材上にニューロンを播種することで達成されます。播種後、ニューロンを最大1週間培養し、その間に成長円錐の伸展を通じて、軸索が静止基材上へと伸展します。次に、基質に固定された軸索末端から、播種した細胞体を牽引することで軸索伸展成長（Axon stretch growth）を行います。組織工学的手法である軸索伸展成長は、1日あたり最大10 millimetersの持続的な成長速度を達成することができ、顕微鏡解析に基づくと、肥大化した軸索路からなる長い小胞束が形成されます。成長電流伸展などの他の手法に対するこの手法の主な利点は、軸索伸展成長を用いることで、任意の望ましい長さまで軸索路をより短期間で成長させ、実験することが可能になる点にあります。軸索伸展成長の意義は、神経成長を刺激するバイオメカニカル信号を再現できる点にあります。これらの信号を研究することで、それらを活用し、疾患や損傷した神経を治療するための新しい戦略を開発することが可能になります。したがって、軸索伸展成長法は、神経系の発達と維持に関する重要な基礎的疑問を解決するのに役立ちます。重要な点として、軸索が想定よりも速い速度で伸展することを可能にするメカニズムを探索することができます。軸索伸展成長バイオリアクターシステムは、主に3つの構成要素で成り立っています。1つ目は、ニューロンを培養し、伸展させるためのバイオリアクターチャンバーです。次に、伸展力を加えるための自動リニアモーションテーブルです。そして最後に、伸展成長を制御するためのソフトウェアを備えたステッピングモーター駆動コントローラーです。ここでは、顕微鏡下での操作が可能な小型化システムを用いてプロトコルを実演します。生体適合性と滅菌培養の容易さを考慮し、縦型フライス盤を用いてバイオリアクターのプロトタイプを製作しました。チャンバーの構成部品は耐腐食性のPolyether ether ketoneから機械加工し、アセンブリの完了には3つの16ステンレス製ファスナーを使用しました。バイオリアクターの培養チャンバーには、ストレッチングフレーム、調整可能な牽引ブロック、外部操作用の牽引ロッド、および使い捨ての牽引・固定培養基材が備わっています。自動リニアモーションテーブルは、デルリン製テーブルに取り付けられたステッピングモーターを備えたリニアモーションテーブルで構成されています。ステッピングモーターとインターフェースを持つドライブコントローラーのプログラミングおよび監視には、P si programmerというソフトウェアプログラムを使用します。LARフィルムを約0.5 by 2.5 cmの細い帯状に切断し、牽引培養基作製してください。牽引培養基材の下面3分の1を、細目の1,200番のサンドペーパーを用いて両面とも軽く研磨し、牽引基材から静止基材への軸索伸展を促進させます。ディバイダータブを使用すると、より均一に研磨できます。LARを5×7 cmに切断するか、あるいは1番のガラスカバースリップを静止基材として使用します。培養基材およびバイオリアクターチャンバーを希釈したAlcan溶液で洗浄し、脱イオン水で十分にすすぎます。培養基材は70% ethanolに30分間浸漬して滅菌します。バイオリアクターチャンバーは、オートクレーブ可能な容器に入れてオートクレーブ滅菌します。滅菌後、培養基材とバイオリアクターチャンバーを組織培養フードに移し、風乾させます。培養基材の乾燥には、ピペットチップのボックスを利用することができます。滅菌済みの綿棒を用いて、towing culture substratesを挿入してください。牽引培養基材を牽引ブロックのレッグに接着します。シリコンRTVを薄く塗布し、研磨されていない部分で基材を接着させ、研磨された培養面には接触しないようにしてください。次に、定置培養基材をバイオリアクターチャンバーの底面に接着します。乾いた綿棒で固定基質の底部を軽く押さえ、余分な接着剤と気泡を取り除きます。組織培養フード内でチャンバーを丸2日間乾燥させます。2日後、牽引ブロックの脚を調整し、標準牽引基質の先端と固定基質との間に2〜3 mmのオーバーラップができるようにします。オーバーラップのサイズには細心の注意を払う必要があります。オーバーラップが大きすぎると、牽引基質の先端が固定基質から外れてたわみ、オーバーラップをまたぐ軸索の数が減少します。牽引ロッドを生体反応器（バイオリアクター）内部に格納した状態で、牽引ブロックを開始位置に配置します。牽引ロッドが動かないように、固定ネジを締めます。ストレッチ成長の操作に先立ち、組織培養フード内で、各レーンの基板界面に無血清培地で調製した高分子量ポリリジンを1 mL分注します。この溶液を室温で1時間静置した後、脱イオン水で3回洗浄し、最後に培養培地で洗浄します。E16ラット胎仔から採取した後根神経節（DRG）外植えを、研磨済みの牽引培養基板上に播種します。実体顕微鏡を用いて、まずシャーレ内でエクスプランを滴下して希釈し、次に100 µLピペットプレートを用いて3〜4個の卵植物（eggplants）を回収します。牽引基質の端にある小さな培地プールに植物を配置し、最大1 mLの培養液を加えます。この量の培地があれば、卵植物の移動を制限しつつ、数時間にわたり蒸発を防ぐのに十分です。バイオリアクターの蓋を固定し、インキュベーターに1時間置いてナスを接着させます。1時間後、ナスを剥がさないよう、ナスから最も遠い位置から培養液をバイオリアクターに満たします。その後、DRGニューロンが静止基質上に軸索突起を伸展させるため、バイオリアクターを5日間インキュベートします。組織培養フード内で、バイオリアクターのリザーバーにリン酸緩衝生理食塩水を満たし、チャンバー内を加湿して培地の蒸発を抑制します。最後に培地交換を行い、バイオリアクターの各レーンを容量一杯まで満たします。その後、非加湿インキュベーター内の自動直線駆動テーブルにバイオリアクターを設置します。牽引ロッドアダプターを牽引ロッドに固定します。Cyプログラマーソフトウェアを使用して、リニアモーションテーブル上のステージをジョグ移動させ、牽引ロッドアダプターの位置に合わせてから、便宜上ステージに固定します。ステージを特定の増分で操作するために、あらかじめプログラマーシーケンスを準備してください。Axon Stretch成長プログラムを開始する前に、バイオリアクターチャンバーの固定ネジを緩めます。ストレッチは、休止期間を挟んだ一連の小さな変位ステップを繰り返すことで、段階的に適用されます。このパラダイムでは、まず172秒ごとに2 µmのステップ移動を行い、予緊張後の最初の24時間で正味1 mmの伸展を実現します。1日後、変位ステップサイズを大きくするか、休止時間を短くすることで、伸展速度を加速させることができます。軸索伸展成長プロセスの代表的な結果をここに示します。プレートされたインプラント内の最初の細胞が、牽引基質へと移動します。その後5日間にわたり、成長円錐が静止基質上に軸索突起を伸長させます。成長円錐が静止基質上を少なくとも1 mm伸長させた時点で、軸索伸展成長を開始します。牽引基質をAED成長円錐から遠ざけるように操作します。一連の手順において、またがる軸索が伸展されると、その弾力性がすぐに明らかになります。通常、軸索は最初的に細くなりますが、数時間以内に成長相に入り、直径を回復して維持します。24時間の連続的な伸展成長後、軸索は伸展に対する耐性が向上し、伸展速度の増加に耐えられるようになります。軸索がさらに伸長しFASが循環するにつれて、伸展に対する耐性が高まります。ここでは、バイオリアクターを意図的に手で軽く叩くことで、伸展成長させた軸索の浮遊状態が明確に示されています。時折、接着不十分により軸索が固定基質から脱落することがあります。これは最も一般的な失敗例であり、初期ステップサイズが大きすぎるか、静止基板のコーティングが不十分な場合に発生しやすくなります。この場合、ステップサイズが大きすぎるため、ストレッチ成長の開始時に軸索の一部が静止基板から剥離します。この手順を行う際は、基板界面の作製に時間をかけて丁寧に行うことが重要です。toe部分と基質は、静止基質に2～3mm重なるようにし、伸展成長が行われている間、DRGは界面にできるだけ近い位置に播種してください。生細胞蛍光プローブを用いた軸索成長の観察や、伸展中の細胞を溶解して遺伝子発現を解析するなど、独自の解析を行うことが可能です。このビデオを視聴することで、印加張力を利用して軸索成長を促進させる方法について十分に理解できるはずです。この手法を用いることで、軸索には我々が考えていたよりもはるかに速く成長する驚異的な能力があり、他のいかなる手段でも達成できない接続を形成できることが明らかになりつつあります。

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このペーパーでは、以前に設計したデバイスを使用して接着細胞に機械的ひずみを適用し、再設計された基層ジオメトリと、100x...

一軸引張ひずみ下での生細胞における核動態の高分解能イメージング

このプロトコルは、 その場で 軸索の成長および成長円錐ダイナミクスを研究するための簡単で堅牢な方法を実証する。 これは、生体外で...

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

前進するためには、成長コーンは外部環境に対して牽引力を発揮しなければならない。牽引力の生成はアクチンの動態およびクラッチの結合に依存する。本研究では、成長コーンアドバンスのためのアクチンダイナミクス、クラッチカップリングおよび牽引力を分析する方法について説明する。...

アクチンダイナミクス、クラッチカップリング、成長コーンアドバンスの牽引力の解析

ここでは、空気圧で作動し、高解像度顕微鏡法と互換性のある汎用性の高い等二軸ストレッチデバイスを紹介します。...

高倍率生細胞共焦点蛍光顕微鏡用等二軸延伸装置

ここでは、細胞に対して等方的および一軸のひずみ波形を適用しつつ、基質上で培養を支持し、剛性を調整可能かつタンパク質行列をカスタマイズ可能な新しい装置として紹介します。このシンプルで経済的なプラットフォームにより、研究者は基礎研究から疾患関連の文脈において、機械的な手がかりがどのように細胞機能を調節するかを調査できます。...

in vitro 細胞の伸縮および画像診断のための新しいプラットフォーム

学ぶ軸索ストレッチ成長法による神経組織工学。バイオリアクターで軸索を1日最大10mmに伸長し、神経損傷治療や神経系の発達メカニズム解明に応用する革新的培養技術です。

軸索のストレッチの成長：神経成長のメカノトランスダ

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