無菌室のテクニック：血清ピペットMicropipettorsのボリュームを転送

本デモンストレーションでは、ラボベンチにおけるセロロジカルピペットおよびマイクロピペットを用いた、分注時の無菌的な実験操作について解説します。ブンゼンバーナーの火によって形成される無菌領域内で作業を行ってください。用途に応じて、適切な分注器具を選択してください。

その後、滅菌状態を損なわないよう適切に使用し、培地試薬や材料の滅菌状態を維持しながら、液体の吸引を正確に行います。これらの手順は、汚染源を最小限に抑え、基礎的な実験における精度を確保するために不可欠です。当初は、器具の正確な設定や読み取り、および移送する液体の滅菌状態を維持しながら器具と実験器具の操作を連携させることが困難な場合があります。

生体試料を扱う際、実験を成功させるためにはラボにおける無菌操作の実践が不可欠です。したがって、これらの手順を習得し、無意識にできるように時間をかけて取り組んでください。ベンチでの作業については、研究室コーディネーターのDr.Chris Reddyがプロトコルを実演します。ラボでの手順を開始する前には、必ず殺菌石鹸と温水で十分に手を洗ってください。まず、流水の温水で手を濡らします。

次に、石鹸を塗布し、力強く全体に行き渡らせます。親指、指の背面、手の甲、爪の間を含むすべての表面に摩擦を加えるようにして手をこすります。その後、残った石鹸を完全に洗い流し、ホルダーから取り出したペーパータオルで手を乾かします。

最後に、新しいペーパータオルを使用して、蛇口を締め、実験台の作業エリアを片付けます。次に、キャニスターからあらかじめ湿らせた除菌ワイプを取り出し、エリア全体を拭き上げます。点火用ライトを用いて、除菌剤を蒸発させます。

ブンゼンバーナーを使用します。炎を調節し、中央に青い円錐形が現れるようにしてください。手順に必要なすべての備品を、実験台の滅菌領域の近くに配置します。

また、すべての材料に適切にラベルを貼ってください。セロロジカルピペットには、プラスチック製またはガラス製、使い捨てまたは再利用可能、プラグ付きまたはプラグなしなど、多くの選択肢があります。さまざまなサイズのピペットには、過剰に充填されるのを防ぐバリアとして機能するプラグによる校正がなされています。

セロファンピペットにも2種類の校正方法があることに注意してください。上部に二重線があるTDピペットは、先端に残る液量を除いた量で校正されています。ここでは示していませんが、TCピペットは全量を排出するように校正されているため、ブローアウト（吹き出し）を行う必要があります。個別に包装された滅菌プラスチックセロファンピペットを用い、無菌操作で、塞がれた端から慎重に紙を剥がし始めてください。

スリーブ全体を取り除かないでください。代わりに、ピペットハンドルの先端、つまり目盛線より上の部分のみを保護し、バルブポンプやガンなどのピペットエイドをセロロジカルピペットの上端に取り付けます。片手でピペットエイドを保持し、もう一方の手でプラスチックピペットから紙スリーブを取り除きます。

金属製キャニスターに保管されているガラス製セロファンピペットを使用する場合、キャニスターの上部を緩めてキャップを取り外し、キャップとキャニスターの両方の開口端を火炎滅菌します。次に、消毒済みのベンチ上にキャップを横にして置きます。キャニスターを水平に持ち、1本または2本のピペットの先端が出るように振ってください。

約1インチ（約2.5cm）突き出させます。キャニスターを横に寝かせ、他のピペットに触れないように注意して、ピペットを1本取り出します。ピペットの先端が手や非滅菌面に触れないようにしてください。

ピペットエイドを取り付けます。次に、ガラスピペットの下方3分の1をブンゼンバーナーの炎にかざし、青いコーンの部分を1〜3秒間加熱します。その後、滅菌培地が入ったボトルのキャップを取り外します。

片手の薬指と手のひらでボトルを保持し、同じ手の親指、人差し指、中指でピペットエイドを操作します。もう一方の手でボトルを45度の角度に傾け、ボトルの口をブンゼンバーナーの炎に通します。滅菌済みのピペットチップを培地に挿入します。次に、ピペットエイドを使用して吸引し、目盛りに合わせて流量を調節します。

ピペットに吸い込まれた液量を確認し、正確に読み取ります。ピペットを垂直に保持し、液面のメニスカスをちょうど目の高さで観察してください。再度、ボトルの縁をブンゼンバーナーの炎に通します。

その後、キャップを締めます。培地ボトルを脇に置きます。次に、滅菌チューブを取り、無菌的に操作します。

前述の手順に従ってキャップを取り除きます。チューブの縁を火炎滅菌し、無菌状態を確保します。サンプルの流れを制御しながら、ピペットを用いて培地をチューブに分注し、液が飛び散らないようにします。

リムを火炎滅菌します。再度、キャップを閉めてチューブを脇に置きます。次に、ピペットエイドを取り外し、プラスチックピペットは指定の鋭利物廃棄容器に廃棄し、ガラスピペットは10%次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸します。

マイクロピペッターを使用すると、特定の容量範囲に対応した異なるサイズの器具を用いて、微量サンプルを正確に測定および分注できます。滅菌済みのチューブとプラスチックチップを使用してください。また、あらかじめ湿らせた消毒用ワイプを使用して、マイクロピペッターを拭き上げてください。注意点。

Volterには、最小目盛りに精度が反映されるマイクロピペッターのタイプに応じて解釈すべき3つの数字が表示されます。例えば、P 20は2.0から20.0 µLの容量に使用されます。黒色で表示されている一番上の数字は、10 µL単位を示しています。

2番目の黒い数字は、マイクロリットル単位の体積を示しています。赤い数字は0.1マイクロリットル単位を示しており、目盛り1つ分は0.02 µLの増分に相当します。まず、調整ノブを回して、数値表示計に表示される通りにディスペンサーの容量を設定してください。

マイクロピペッターの容量設定を減らす場合は、サムホイールをゆっくりと回して目盛りまで合わせます。容量設定を増やす場合は、目的の目盛りを1/3回転ほど過ぎるまでダイヤルを回し上げます。その後、サムホイールをゆっくりと回して、目的の容量に合わせます。

常に滅菌済みのプラスチック製使い捨てチップを使用してください。マイクロピペットのバレル端にチップをしっかりと装着します。押し込みながら軽く回し、気密性が確保されていることを確認してください。

マイクロピペットを垂直に保持します。マイクロピペットには、レストポジション、第1ストップ、第2ストップの3つの位置があることに注意してください。

プランジャーのプッシュボタンを静止位置から第1ストップまで押し下げ、設定量に相当する空気を排出します。次に、プッシュボタンを第1ストップまで押し下げたまま、チップを液体に浸します。プッシュボタンをゆっくりと離して、液体をチップ内に吸引します。

プッシュボタンがレストポジションに達したら、液体がチップ内に吸い込まれるまで待機します。その後、チップを液体から取り出します。チップ内に吸い上げられた液量を目視で確認し、気泡が混入していないことを確かめてください。

チップを、液体を受けるチューブの壁面に対して10～45度の角度で配置します。次に、プランジャーのプッシュボタンを第一ストップまでゆっくりと押し下げ、液体を分注します。

少し待った後、プッシュボタンを第2ストップまで押し込み、残液を排出します。チップを液体から引き抜いた後、プランジャーを元の位置まで戻します。最後に、マイクロピペットのイジェクションボタンを押し、チップを指定の鋭利物廃棄容器に廃棄してください。

まず、ブンゼンバーナーの火を消します。すべての備品と試薬を片付けた後、LabWareを保管場所に戻す前に、その外表面を消毒用ワイプで拭きます。次に、汚染されたガラス器具および有害廃棄物を適切な廃棄容器に廃棄します。

作業エリア全体をもう一度拭き上げ、消毒液を自然乾燥させます。最後に、抗菌石鹸と温水で手を十分に洗ってください。無菌操作を怠ると、培養物が汚染され、実験が遅れる原因となります。

セロロジカルピペットを用いた液体の無菌操作は、この25 milliliterのe coli調製液のような純粋な細菌培養物の増殖において不可欠です。さらに、セロロジカルピペットを使用することで、滅菌済み試験管への液体の無菌的な移送が可能になります。この例では、試験管へ培地をポイントツーポイントで分注し、e coliの純粋培養物と汚染された培養物を比較して示します。

精密な分注量が必要な場合があります。この例では、培地の移送が不正確であることがわかります。ここでは、バッファーの移送量が不適切である例を示しています。

学生は12.5 µLを分注する代わりに、125 µLを分注してしまいました。ボリュメーターの設定数値は同じでしたが、作業に不適切なマイクロピペッターが選択されていました。このビデオを視聴することで、セロロジカルピペットやマイクロピペッターを用いて溶液や培養物を移送するなどの日常的な実験操作において、無菌性を損なわせずに無菌操作法を適用するための実用的知識を習得できるはずです。

目的は、ガラス器具、ピペットチップ、培養チューブ、フラスコの火炎滅菌などの予防処置や、実験台上の滅菌区域内での作業が、あらゆる実験において習慣的に行えるようにすることです。また、実験を行う際には、正確かつ精密な容量を測定し、分注することが不可欠です。これらの容量移送器具の適切な使用方法を習得することで、実験結果の信頼性を向上させることができます。