Name: 二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学ぶマウス脊髄のin vivoイメージング法。二光子顕微鏡とカスタム固定装置により呼吸による動きを最小化し、高解像度で長期的な細胞動態観察を可能にする。神経変性疾患や炎症のリアルタイム研究に応用できる。

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この作品は全国多発性硬化症によってサポートされていた社会助成金適応および/ ​​またはDavalos ら 、J Neurosciの方法より転載KAフィギュアや映画へのDDとNIH / NINDS助成NS051470、NS052189とNS066361へRG4595A1 / T。 2008年03月30; 169（1）:1 - 7 2008著作権、エルゼビアの許可を得て。

1。脊椎安定化装置の構築<ol><li>ナリシゲSTS -コンパクト脊髄クランプとナリシゲMA - 6Nヘッド保持アダプタを注文。 </li><li>カスタム設計とその脊柱と尾部がクランプされている間、動物の頭部がサポートされているように整列二つナリシゲの部分を保持するためにステンレス製の底板を作る。デバイス全体は通常低下顕微鏡のステージ上に顕微鏡レンズの下に入る必要があることに留意してください。 </li></ol> 2。動物の手術<ol><li>空気加熱装置とプレヒート顕微鏡室、37でそれを維持℃に</li><li>動物を秤量し、100mgのケタミン、15mgのキシラジンと無菌条件下で0.9％NaCl溶液で希釈した体重1kg当たり2.5mgのアセプロマジンを使用して、麻酔薬のミックスを作る。 </li><li>麻酔ミックス（KXA）を腹腔内注入することにより、動物を麻酔。定期的なつま先の挟み込みは、全体に深い麻酔を確保するために実行する必要があります実験。毎時または必要に応じて半分の投与量で補う。 </li><li>外科手術の実行中に熱のサポートを提供するために、小動物の加熱パッドを使用してください。 </li><li>角膜脱水および損傷を防ぐために目の上に人工涙液軟膏を適用する。 </li><li>トリミング装置とし、完全に切開周辺から髪を削除するには、鋭い刃を持つ最初の動物の背中を剃る。 </li><li>剃毛を取り除くとアルコールパッドで剃毛、皮膚の表面を消毒する。 </li><li>希望する脊髄レベル（胸椎がここに示されている）の皮膚の小さな（〜1.5 cm）の長手方向の切開を行います。 </li><li>慎重に後退による皮下の結合組織を戻す筋肉を公開。 </li><li>慎重に必要なレベルで脊柱から傍脊柱筋を分離。各棘突起の両側から筋肉をデタッチし、デタッチされた筋肉をこすり取る際には、できるだけ少ない切開を行います層の表面からの方法。 </li><li>すぐに吻側と椎弓切除の尾、削除されるラミナを選択し、脊柱の両側の脊髄クランプ用エントリのサイトを準備。慎重にクランプが挿入される4つのポケットを作るために筋肉組織を置換する。 </li><li>脊髄に触れることなく粘膜の下に湾曲した鈍先端はさみの安全な挿入を可能にするストレート歯先端の鉗子と脊柱を持ち上げる。ゆっくり片側、次に反対側にある骨を切断することにより椎弓切除を行います。 </li><li>綿棒を使用するか、少量の出血を制限するために切開隣プレカット小さなgelfoam吸収ゼラチンスポンジの部分を挿入します。必要に応じてさら​​に出血を抑えるために小血管のcauterizerを使用してください。組織を洗浄するために予熱無菌人工脳脊髄液（ACSF）を使用してください。 </li></ol> 3。 in vivoイメージングのための脊柱と準備の安定化<ol><li> PLAC電子脊椎安定化装置のベースプレート上に標高のパッド上に動物とヘッド保持アダプターでヘッドを固定します。 </li><li> STS -椎弓切除に隣接する、事前に用意されたポケットの中の動物（図1）の前後軸に沿ったデバイスの脊髄クランプを置きます。 2個のクランプは〜45 °露出した脊髄（図1）上の水浸レンズを低減するための十分なスペースを可能にするために動物のrostro -尾軸に対しての角度で配置する必要があります。 </li><li>動物の体をイメージング実験（図1）の期間中、標高のパッドを除去した後、空気中に浮遊することができるように尾の基部にSTS -装置の第3のクランプを置きます。 </li><li> ACSFで脊髄のメンテナンスおよびin vivoイメージングのためのこのソリューションでは顕微鏡のレンズの浸漬を容易にするために、露出した脊髄の周りのGelseal（アマシャムバイオサイエンス社）の小さな井戸を構築する。 </li></ol>jove_title"&gt; 4。二光子顕微鏡によるマウス脊髄のin vivo イメージング <ol><li>顕微鏡をカバーする予備加熱チャンバ内に脊椎安定化装置に動物を移し、まっすぐレンズ（図1）の下に椎弓切除を置く低下顕微鏡のステージ上に固定。 </li><li> ACSFのソリューション、それが脊髄クランプまたはGelsealに接触しないことを確認することに慎重に水浸レンズを下ろします。 </li><li>関心のある分野を特定し、それに集中する落射蛍光使用。レーザースキャンモードに切り替え、イメージ化された組織中に存在する蛍光物質のために適切な二光子レーザーの励起波長、dichroicsとバンドパスフィルタを用いた in vivo イメージングで行います。 </li></ol> 5。反復的なイメージングと術後ケア<ol><li>イメージング実験の終了時に、脊椎安定化デバイスからマウスを削除し、慎重に椎弓切除周辺からGelsealを拭いてください。エリアをよく清掃してください。 </li><li>椎弓切除以上の背中の筋肉を復元し、縫合。 </li><li>椎弓切除の皮膚を復元し、縫合、betadineでそれを綿棒。 </li><li> 1ミリリットル栄養と水分補給補助食品として乳酸リンゲル液（バクスターヘルスケア）、ならびに皮下鎮痛治療を（0.1 mg / kgのブプレノルフィン）を提供。 </li><li>防腐処理の腹腔内（マウス1匹あたり0.03ミリリットル、2.27％のエンロフロキサシン注射剤抗菌ソリューションを）管理する。 </li><li>完全な麻酔から回復し、その後個別にそれを収容するまで加熱パッドの上に置いて動物。 </li><li>術後2〜3日の手術と鎮痛治療ごとに8〜12時間後の最初の3〜5日間毎日消毒剤投与を繰り返す。通常の動作と完全な回復を確実にするには、毎日動物を監視します。 </li><li>同じ椎弓切除を介しての再イメージングのために、縫合皮膚と筋肉を再度開き、セクション2で説明した手順を繰り返して - 4。 </li><li>再度見つけるpreviously以前に10を説明するようにマップのように血液の血管を使用して領域を撮像。 </li></ol> 6。代表的な結果すべての動物の手続きは、カリフォルニア、サンフランシスコの大学の制度的動物実験委員会によって設定されたガイドラインの下で行われ、連邦規則に準拠していますれた。脊椎安定化装置の画像と顕微鏡のレンズの下にデバイス上でマウスの位置を示す模式図を図1に示されています。動物の体の下に呼吸運動に十分なスペースを許可することは、脊髄におけるin vivoイメージングで安定が保証されます。それはCX3CR1 GFP / +トランスジェニックマウス18の脊髄に生体内でイメージを作成したとして、 図2は、ミクログリアと血管の間の密接な関係を示し、これでミクログリアが内生的にGFPで標識されています。 図3は、反復の例を示しています。in vivoイメージングでは蛍光脊髄軸索におけるタンパク質（YFP - Hライン3）とミクログリアを（CX3CR1 GFP / +マウスで）発現するマウスで同じ脊髄領域で実行されたとして。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1二光子顕微鏡を用いたin vivoイメージングのためのマウス脊柱の安定化。（A）カスタムメイドのスチール製ベースプレートをSTS -ナリシゲコンパクト脊髄クランプとMA - 6Nナリシゲをサポートして整列させるために使用されるここに示されているようにアダプターを保持しているヘッド。脊椎安定化デバイス上にKXA麻酔薬で麻酔成体トランスジェニックマウスの（B）適切なポジショニング。インサートは、直ちに吻方と尾側椎弓切除と露出した脊髄組織に脊髄クランプの配置を示します。 &lt;IMG ALT ="図2"SRC ="/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg"/&gt; 図2。麻酔したマウスの脊髄における高密度小グリア細胞および血管のin vivoイメージング。の投影が、非整列Z -スタック（A）の血管に近接してCX3CR1 GFP / +マウス（赤、ローダミンデキストランの静脈注射で標識）の脊髄における高密度GFP陽性ミクログリア（緑）。容器の周りに拡張プロセスとし、脊髄実質に向かって血管の壁に接続された単一のミクログリア細胞の（）内のラベル（B）の高倍率画像。スケールバーは、10μmの。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。彼らは別の日に移転し、麻酔したマウスの脊髄でイメージを再作成されたのと同じ軸索のセグメントとミクログリアのin vivoイメージングの繰り返し。 （A）YFP -ラボ 0日目と5日のeled軸索。 （B）。それらの周りに同じ血管構造とミクログリア細胞は、日0と1のCX3CR1 GFP / +マウスの脊髄でのin vivoで画像化。スケールバーは、10μmの。 ムービー1。マウス脊髄から生体内で取得した代表的なタイムラプスシーケンス。このシーケンスは、密に蛍光構造を移入組織内で時間をかけて（赤、ローダミンデキストランの静脈注射で標識）を詳細に細かいミクログリアプロセスダイナミクス（緑）と血管との相互作用を示しています。 RAW画像は、バックグラウンドノイズ、明るさやコントラストを補正したとタイムラプスムービーは、画像の位置合わせ、平均または個々の平面のzを選択することなく、連続して取得した画像スタックをzは、投影することにより構築した。血管は、ミクログリアの画像は、z平面の類似の範囲を通過。 Z面の深さ：38μmの。oad/2760/Davalos_Movie_1.movは"&gt;映画を鑑賞するためにはここをクリックしてください。 映画（2）タイムラプスシーケンスは、単一のz -平面のレベルでのイメージング法の生の安定性を実証。 KXA麻酔下で脊髄の安定化デバイス上に配置CX3CR1 GFP / +マウスの脊髄内の同じ単一のz -平面の高速アクイジションでは、より高速な1フレーム/秒のスキャン速度で連続したフレーム間の最小の画像の変位を示していますマウスの呼吸速度。マイナー残留変位は、おそらくビートによるものです。 <a alt="Movie 2" href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2760/Davalos_Movie_2.mov">映画を見て、ここをクリックしてください。</a>

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<li>Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+astrocytic+Ca2%2B+signaling+and+the+microvasculature+in+experimental+mice+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).</li>
<li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Fractalkine+Receptor+CX3CR1+Function+by+Targeted+Deletion+and+Green+Fluorescent+Protein+Reporter+Gene+Insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li>
<li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat. Med. 11, 572-577 (2005).</li>
<li>Kim, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).</li>
<li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li>
<li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4%2B+T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 203, 505-511 (2006).</li>
<li>Lindquist, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).</li>
<li>Schwickert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((vivo+imaging+of+germinal+centres+reveals+a+dynamic+open+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure.</a> Nature. 446, 83-87 (2007).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もない。

方法は2つの光子顕微鏡を用いて麻酔したマウスの脊髄における人口密度の高い蛍光細胞構造の安定及びin vivoでの反復的なイメージングを可能にするここで説明する。実現性はカスタムメイドの脊椎安定化装置や呼吸器誘発性運動のアーチファクトを減少させる麻酔療法の結果です。脊椎安定化装置は、マウス本体の下に呼吸スペースを可能にし、市販の脊髄クランプとヘッド取付部分（図1）を使用して構築することができます。法は低侵襲、高い再現性で、一貫して大規模な画像後処理（図2とビデオ1）することなく実験的な解析に用いることができる生のデータを生成します。この手法は、したがって、市販の蛍光マウス系統（図1-3およびビデオ1）の存在量の細胞間相互作用の研究にも使用できます。このメソッドは、人口密度の高い細胞構造だけではなく、解決することができますLSOは、急速に細胞機能または応答（ビデオ1、2）を発生。例えば、それを定量的に時間の経過だけでなく、距離が走化性行動の間に旅したミクログリアのプロセスのダイナミクスを測定するために使用することができます。我々は以前に生きている脳8でイメージングミクログリアの応答について説明したよう...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ローダミンBデキストラン</td><td>インビトロジェン</td><td> D1841 </td><td>で希釈した70kDaの、 ACSF（3％w / v）の</td></tr><tr><td>ケタミン塩酸</td><td> Bionichepharma </td><td> NDC番号：67457-001-10 </td><td> 50mg/ml、注射</td></tr><tr><td> Anased </td><td>ロイド研究所</td><td> NADA番号：139から236 </td><td>キシラジン注射液、 20mg/ml </td></tr><tr><td>アセプロマジン</td><td> Vedco </td><td> NADA番号：117から531 </td><td> 10mg/ml、注射</td></tr><tr><td>人工涙液 軟膏</td><td>フェニックス 製薬</td><td> NDC番号：57319-760 - 25 </td><td>潤滑油</td></tr><tr><td> Betadine </td><td>フィッシャー</td><td> 19-061617 </td><td></td></tr><tr><td>マクファーソン、ウェストコット はさみ</td><td>世界の精密 楽器</td><td> 555500S </td><td>湾曲した、鈍チップ はさみ</td></tr><tr><td>ストレートピンセット</td><td>世界の精密 楽器</td><td> 555047FT </td><td>歯先端の鉗子</td></tr><tr><td>小血管は焼灼する</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 18000〜00 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td>ファルマシア、ファイザー社</td><td>ミキサーミルMM400 </td><td></td></tr><tr><td>コンパクト脊髄 クランプ</td><td>ナリシゲ</td><td> STS - </td><td></td></tr><tr><td>頭部保持アダプタ</td><td>ナリシゲ</td><td> MA - 6N </td><td></td></tr><tr><td> Gelseal </td><td>アマシャム バイオサイエンス（株） </td><td> 80-6421-43 </td><td></td></tr><tr><td>乳酸リンゲル</td><td>バクスターヘルスケア&lt;/ TD&gt; <td> 2B8609 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenex </td><td> Reckitキットベンキーザー ティカルズ社</td><td> NDC番号：12496 - 6757から1 </td><td>ブプレノルフィン、 注射可能な</td></tr><tr><td> Baytril </td><td>バイエル</td><td> NADA 140から913 </td><td>エンロフロキサシン、 抗菌性注射剤 2.27パーセント（20ミリリットル） </td></tr><tr><td>加熱パッド - 大</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 21060〜10 </td><td></td></tr></tbody></table>

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

in vivoで遺伝的に特定の細胞型2-3に蛍光タンパク質を発現するように設計されているマウスでは、二光子顕微鏡1を用いたイメージングでは、大幅にin vivoで 4-7 の多くの組織で生理的および病理学的プロセスの知識を広げている。中枢神経系（CNS）の研究では、小説などの下でニューロン、アストロサイト、ミクログリア、などの細胞の挙動について、しばしば予想外の所見の茄多を生産している脳内のin vivoイメージングの幅広い応用がなされている生理学的または病理学的条件8月17日 。しかし、主に技術的な合併症は、生きているマウスの脊髄の研究ではin vivoイメージングの実装を制限してきた。特に、肺と心臓への脊髄の解剖学的接近は、イメージング生体脊髄やりがいのある仕事になる重要な動きのアーティファクトを生成します。 </P&gt; 我々は、脊柱を安定させる呼吸器誘発性の動きを減らし、それによってin vivoで画像にマウス脊髄をする二光子顕微鏡の使用を容易にすることによって脊髄のイメージングの固有の限界を克服する新しい方法を開発した。これは、呼吸器誘発性運動の有意な減少をもたらす、深い麻酔の方法でカスタマイズされた脊椎安定化装置を組み合わせることによって実現されます。このビデオプロトコルは、組織の損傷を維持して最小限に出血が長期間にわたって安定した生理的条件下で維持することができる生きている脊髄の小さな領域を公開する方法を示しています。高分解能in vivo で詳細にミクログリアと血管の間の密接な関係を取得した代表的な生のイメージ。タイムラプスシーケンスは、生きたマウスの脊髄でのミクログリアのプロセスの動的な挙動を示しています。また、同じz -フレームの連続スキャンが示すのこのメソッドは画像の位置合わせ後の取得を必要としない画像および/またはタイムラプスムービーのスタックを生成するために達成することができる卓越した安定性。最後に、我々は生体内で進行中の生理学的または病理学的プロセスの縦断的研究を可能にする、このメソッドは、後でタイムポイントでの脊髄の同じ領域を再検討し、再イメージングするために使用できる方法を示します。

マウス脊柱を安定させ、繰り返し実行するために低侵襲プロトコル<em&gt; in vivoで</em二光子顕微鏡を使用して&gt;脊髄の画像が記載されている。このメソッドは、呼吸器誘発性の動きを最小限にしてもアライメントや後処理他を必要としない生の画像データを生成するために脊椎安定化装置と麻酔薬の処方を組み合わせたもの。

特定の細胞型で蛍光タンパク質を発現するように遺伝子操作されたマウス 2-3 における、二光子顕微鏡 1 を用いた生体内イメージングは、...

本手順の目的は、2光子顕微鏡を用いてマウスの脊髄における安定したin vivoイメージングを行うことです。まず、安定かつ穏やかな呼吸リズムを維持できる麻酔剤混合液を用いて動物を麻酔します。次に、目的の部位で脊柱を露出し、椎弓切除術を行うことで下層の脊髄を露出させ、in vivoでのイメージングを可能にします。第3の手順は、動物を脊髄固定装置に設置することです。最終ステップは、露出した脊髄セグメントの単離です。in vivoイメージングの準備を整えることで、最終的に、2光子顕微鏡を用いたタイムラプスin vivoイメージングを通じて、生体脊髄内における細胞の動的な挙動や、他の細胞種または構造との相互作用に関する詳細な結果を得ることができます。この手法の、脊髄のin vivoイメージングに対する従来の手法と比較した最大の利点は、後処理を必要とせず、即座に評価し、さらなる解析に利用できるin vivoイメージングデータを生成できる点にあります。この手法の意義は、脊髄損傷や疾患後の治療にまで及びます。例えば、脊髄損傷後の軸索変性や再生の進行をリアルタイムで研究することが可能になります。また、多発性硬化症や筋萎縮性側索硬化症など、脊髄に顕著な病理学的変化が見られる疾患の動物モデルにおいて、炎症性または神経変性プロセスの進行を研究するためにも、本手法を利用することができます。まず、動物の体重を測定します。次に、麻酔薬混合液を腹腔内投与して動物を麻酔します。実験中、動物が深い麻酔状態にあることを確認するために定期的に足指をつまみ、必要に応じて、または1時間ごとに、初回投与量の半分を補充投与してください。次に、角膜の脱水および損傷を防ぐため、人工涙液軟膏を眼に塗布します。トリミング器具で動物の背中の被毛を整え、残った被毛を鋭利な刃で剃毛します。剃毛部位を消毒した後、動物を顕微鏡下に配置し、目的の脊髄レベル上の約1.5センチメートルに小さな縦切開を入れて処置を開始します。皮下結合組織を慎重に牽引して、背部の筋肉を露出させます。次に、目的のレベルで脊柱から傍脊柱筋を慎重に分離します。各棘突起の両側から筋肉を切り離す際は、切開回数をできるだけ少なくしてください。その後、剥離させた筋肉をラミネート表面から掻き出します。必要に応じて、小型の電気凝固器を用いて微小な出血を制御してください。下層のラミネートが十分に露出し、除去する対象を明確に識別できるまで、筋肉の掻き出しを続けます。脊柱の両側に脊髄クランプを挿入する部位を準備するため、曲型剪刀の先端を脊柱起立筋の間に挿入し、筋肉組織を慎重に押し広げて、クランプを挿入するための4つのポケットを作成します。脊髄に触れないように、直歯鉗子で脊柱を持ち上げ、曲型鈍端剪刀を椎弓板の下に安全に挿入できるようにします。次に、片側の骨をゆっくりと切断し、その後もう一方側を切断して椎弓切除術を行います。この際、綿棒を使用するか、切開部の隣に予め小さく切った吸収性ゼラチンスポンジを挿入し、軽微な出血を抑制してください。その後、あらかじめ温めておいた滅菌済み人工脳脊髄液を用いて組織を洗浄します。脊髄固定装置は、Nagate STSA 複合脊髄クランプおよび Nagate MA 6 N 頭部保持アダプターを主要構成部品としてカスタム設計しました。動物の頭部を支持し、脊柱と尾部をクランプできるよう、2つの Nagate 部品を一直線に保持するためのステンレス製ベースプレートを作製しました。動物を安定させるため、装置全体が、ステージを下げた顕微鏡の対物レンズ下に収まるように注意してください。まず、脊髄固定装置のベースプレート上にあるエレベーションパッドに動物を配置します。ヘッドホルダーアダプターで頭部を固定した後、SDSA装置の脊髄クランプを、椎弓切除術部位の両脇にあるあらかじめ用意したポケットに沿って、動物の前後の軸に合わせて配置します。動物の脊髄正中軸に対して約45度の角度で2つのクランプを配置し、露出した脊髄の上に水浸レンズを降ろすための十分なスペースを確保します。次に、イメージング実験で elevations pad（挙上パッド）を外した後に動物の体を吊り下げられるよう、尾の付け根に3つ目のクランプを配置します。続いて、脊髄を人工脳脊髄液（A CSF）内に維持しやすくするため、露出した脊髄の周囲にゲルシールで小さなウェルを作成します。次に、In vivoイメージングを開始する準備が整ったら、エレベーションパッドを取り除き、固定デバイスを予熱した顕微鏡チャンバーへ運び、下げた状態の顕微鏡ステージ上に配置します。椎弓切除部位がレンズと一直線になるように調整してください。水浸レンズをA CSF溶液の中に慎重に下ろし、脊髄クランプやゲルスシールに接触しないように注意してください。エピ蛍光を用いて関心領域を特定し、その後そこに焦点を合わせます。レーザースキャンモードに切り替え、組織内に存在する蛍光物質に適した2光子レーザー励起、波長、ダイクロイックミラー、およびバンドパスフィルターを使用してin vivoイメージングを行います。イメージング実験の終了後、脊髄固定装置から動物を取り出します。椎弓切除術の周囲からゲルシールを慎重に拭き取り、洗浄します。椎弓切除部位の上から背筋を十分に縫合します。その後、皮膚切開部を縫合し、ベタジンでスワブします。ここでは、in vivoで必要とされたZack画像を、画像アライメントを行わずにZ軸に沿って投影して示しています。画像は、脊髄において、赤色で示される血管に近接して密集している緑色のGFP陽性ミクログリア細胞を示しています。こちらは、血管壁に付着した単一のミクログリア細胞の高倍率画像であり、血管周囲に伸びる突起と、脊髄実質に向かって伸びる突起の詳細が示されています。ここでは、同じYFPラインマウスの脊髄において、5日間の間隔を空けて2回にわたり、同一のYFP標識軸索セグメントが再配置され、繰り返しin vivoイメージングが行われた例を示しています。これは繰り返しイメージングのもう一つの例であり、脊髄において2日連続でin vivoイメージングされた同一の血管構造とミクログリア細胞を示しています。以下は、脊髄からin vivoで取得した代表的なタイムラプスシーケンスです。このシーケンスでは、緑色で示されたミクログリア細胞の微細な突起の動的挙動と、赤色で示された血管系との相互作用が詳細に示されています。時系列に沿って、生画像に対して背景ノイズ、輝度、およびコントラストの補正のみを行い、画像の整合（アライメント）を行わずに連続的なイメージスタックを統合してタイムラプス動画を作成しました。個々の平面の平均的な選択において、血管はミクログリアの画像と同様のZ平面の範囲を通過します。画像ボリュームの深さは38 micronsです。これは、単一のZ平面レベルにおけるイメージング手法の安定性を示すタイムラプスシーケンスです。KXAミックスで麻酔をかけ、脊髄安定化装置に固定したCx3cr1-GFPヘテロ接合体マウスの脊髄において、同一の単一Z平面を高速で取得したところ、連続するフレーム間の画像変位は最小限であることが示されました。特筆すべきは、このシーケンスの速度が1秒間に1フレームであり、これはマウスの呼吸速度よりも速いことです。わずかに残存している変位は、おそらく動物の心拍によるものと考えられます。この手順を行う際は、切開回数を最小限に抑え、微量な出血が生じた場合は直ちに止血に努めることが重要です。このビデオを視聴することで、2光子顕微鏡を用いたマウス視神経における安定したin vivoイメージングの実施方法について、十分に理解できたはずです。

in-vivo-imaging-of-the-mouse-spinal-cord-using-two-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

Source: Nishimura, C. ら。 HIV誘発性神経炎症のマウスモデルにおける2光子顕微鏡を用いた脳血管構造の定量化。 J. Vis. Exp. (2016).

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二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

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