二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで
January 5th, 2012
マウス脊柱を安定させ、繰り返し実行するために低侵襲プロトコル in vivoで脊髄の画像が記載されている。このメソッドは、呼吸器誘発性の動きを最小限にしてもアライメントや後処理他を必要としない生の画像データを生成するために脊椎安定化装置と麻酔薬の処方を組み合わせたもの。
この手順の目標は、2光子顕微鏡を使用してマウス脊髄の安定したin vivoイメージングを行うことです。これは、最初に動物に麻酔薬を混合して麻酔をかけ、安定しながらも穏やかな呼吸リズムを実現することによって達成されます。手順の2番目のステップは、脊柱を目的のレベルで露出させ、次に椎弓切除術を実行して下にある脊髄を露出させ、生体内で画像化できるようにすることです。
3番目のステップは、動物を脊椎安定化装置の上に置くことです。最後のステップは、露出した脊髄セグメントの分離です。in vivoイメージングの準備として、最終的には、2光子顕微鏡を用いたタイムラプスin vivoイメージングを通じて、細胞の動的挙動や、生体脊髄内の他の細胞タイプや構造との相互作用を詳細に把握する結果を得ることができます。
この手法は、in vivoで脊髄をイメージングする従来の試みと比較した場合の主な利点は、後処理を必要とせず、すぐに評価してさらなる分析に使用できる道路in vivoイメージングデータを生成することです。この手法は、例えば、脊髄損傷以外の損傷後の軸索変性や再生の進行をリアルタイムで研究することができるため、脊髄損傷や疾患後の治療にも応用できます。この手法は、多発性硬化症や筋萎縮性側索硬化症など、疾患の病理が脊髄で顕著である疾患の動物モデルにおける炎症性または神経変性のプロセスの進行を研究するために使用できます。
動物の体重を量ることから手順を開始します。次に、麻酔薬ミックスを腹腔内に注入することにより動物に麻酔をかける。実験全体を通して動物の深い麻酔を確保するために、定期的につま先をつまむことを行い、元の用量の半分の麻酔薬を、毎時、または必要に応じて補充します。
次に、角膜の脱水と損傷を防ぐために、目の上に人工涙液軟膏を塗ります。動物の背中の毛をトリミング器具でトリミングし、残りの毛を鋭利な刃で剃ります。剃った部分を消毒した後、動物を顕微鏡下に置き、目的の脊椎レベルに約1.5センチメートルの小さな縦切開を行うことから手順を開始します。
皮下結合組織を慎重に引っ込めて、背中の筋肉組織を露出させます。次に、傍脊椎筋を脊柱から目的のレベルで慎重に分離します。各棘突起の両側から筋肉を切り離すために、切開をできるだけ少なくします。
その後、剥離した筋肉をラミネート表面からこすり落とします。必要に応じて、小さな血管焼灼器を使用して軽度の出血を抑えます。下にあるラミネートが十分に露出するまで筋肉をこすり続け、取り除くものを明確に識別できます。
脊柱の両側に脊椎クランプの侵入部位を準備するには、傍脊椎筋の間に湾曲したハサミの先端を挿入し、筋肉組織を慎重に変位させて、クランプが挿入される4つのポケットを作成します。まっすぐな歯先鉗子で脊柱を持ち上げると、脊髄に触れることなく、湾曲した鈍い先端はさみを椎弓の下に安全に挿入できます。次に、片側と反対側の骨をゆっくりと切断して椎弓切除術を行い、綿棒を使用するか、切開部の隣に事前にカットされた小さなジェルフォーム吸収性ゼラチンスポンジピースを挿入して、軽度の出血を制限します。
その後、予熱した滅菌人工脳脊髄液を使用して組織を洗浄します。脊椎安定化装置は、Nagate STSA複合脊髄クランプの主要コンポーネントとNagate MA six Nヘッド保持アダプターを使用してカスタム設計されました。ステンレス製のベースプレートは、動物の頭が支えられ、脊柱と尾が固定されている間、2つのナーガパーツを整列させて保持するために作られました。
動物を安定させるために、デバイス全体が下がった顕微鏡ステージの顕微鏡レンズの下に収まる必要があることに注意してください。まず、脊椎安定化装置のベースプレートの昇降パッドに置きます。頭部を頭部保持アダプターに固定した後、SDSA装置の脊椎クランプを動物の前後軸に沿って、椎弓切除術に隣接する事前に準備されたポケットに入れます。
2つのクランプを動物のROS索軸に対して約45度の角度で配置し、露出した脊髄の上に水浸レンズを下げるのに十分なスペースを確保します。次に、イメージング実験で昇降パッドを取り外した後、動物の体を吊り下げることができるように、3番目のクランプを尾の付け根に配置します。次に、露出した脊髄の周りにゲルシールの小さなウェルを構築して、CSFの脊髄の維持を容易にします。
次に、In vivoイメージングを開始する準備ができたら、昇降パッドを取り外し、安定化装置を予熱した顕微鏡チャンバーに持って行き、下げた顕微鏡ステージに置きます。椎弓切除術をレンズに合わせてください。水浸レンズをACSF溶液に慎重に下げ、脊椎クランプやゲルシールに触れないようにします。
エピ蛍光を使用して関心領域を特定し、その後でそれに焦点を当てます。レーザースキャンモードに切り替えて、画像組織中に存在する蛍光色素に対して、適切な2つの光子レーザー励起フィルター、波長フィルター、二色性フィルター、およびバンドパスフィルターを使用してin vivoイメージングを行います。イメージング実験の最後に、動物を脊椎安定化装置から取り出します。
椎弓切除術の周囲のゲルシールを慎重に拭き取り、清掃します。椎弓切除術で背中の筋肉をしっかりと縫合します。次に、皮膚切開部を縫合し、ここに示されているベタジンで綿棒で拭き取ります。これは、生体内で必要とされ、その後、画像の位置合わせなしでZ軸に沿って投影されたザック画像の投影です。
この画像は、高密度のGFP陽性ミクログリア細胞を緑色で示し、脊髄の血管を赤色で囲んだ近接性を示しています。これは、血管の壁に付着した単一のミクログリア細胞の高倍率画像であり、血管の周囲に広がるそのプロセスの一部と脊髄実質に向かって詳細に示されています これは、同じYFP標識軸索セグメントの反復in vivoイメージングの例であり、それらは2つの異なるセッションで同じYFPHラインマウスの脊髄に再配置され、再画像化された5日違いです。これは、脊髄内のin vivoで2日間連続して画像化された同じ血管構造とミクログリア細胞を示す反復イメージングの別の例です。
これは、脊髄からin vivoで取得した代表的なタイムラプスシーケンスです。この配列は、ミクログリア細胞の微細なプロセスの動的な挙動を緑色で、血管系との相互作用を赤色で詳細に示しています。時間の経過とともに、生の画像はバックグラウンドノイズ、明るさ、コントラストのみを補正され、タイムラプスムービーは、画像の位置合わせなしで画像スタックを順次拒否することによって構築されました。
オーストラリアで選択した個々の平面を平均すると、血管はミクログリアの画像と同様の範囲のZ平面を通過します。画像ボリュームの深さは38ミクロンです。これは、単一のZ平面レベルでのイメージング方法の安定性を示すタイムラプスシーケンスです。
CX three, CR one GFPヘテロ接合マウスをKXAミックスで麻酔し、脊椎安定化装置に配置した脊髄内の同じ単一のZ平面を高速に取得すると、連続するフレーム間の画像変位が最小限に抑えられることが示されています。注目すべきは、このシーケンスの速度が1秒あたり1フレームであり、マウスの呼吸速度よりも速いことです。わずかな残留変位は、おそらく動物の心拍によるものです。
この手順を試みるときは、切開の数を最小限に抑え、軽度の出血が発生したらすぐに制限するように努めることが重要です。このビデオを見た後、2つの写真顕微鏡を使用してマウスの電源コードで安定したin vivoイメージングを行う方法について十分に理解できるはずです。
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概要
この記事では、マウスの脊椎を安定化させ、2光子顕微鏡を用いた反復的な生体脊髄イメージングを行うための最小侵襲プロトコルについて説明します。この方法は、特定の麻酔レジメンを通じて呼吸誘発運動を最小限に抑えることを目的としています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- イメージング技術
- 脊髄研究
背景
- 安定した生体イメージングは、細胞の動態を観察するために重要です。
- 2光子顕微鏡は、生きた組織の詳細なイメージングを可能にします。
- 呼吸運動がイメージングの品質を妨げる可能性があります。
- 脊髄安定化装置は、イメージングの安定性を高めることができます。
研究目的
- マウスの脊髄の安定した生体イメージングを達成すること。
- 脊髄内の細胞の動的挙動を詳細に把握すること。
- 細胞間相互作用のタイムラプスイメージングを容易にすること。
使用された方法
- 安定した呼吸のためにマウスを麻酔します。
- 脊髄を露出させるために椎板切除術を行います。
- イメージングのために脊髄安定化装置を使用します。
- 観察のために露出した脊髄セグメントを分離します。
主要な結果
- イメージングのための脊椎の安定化に成功しました。
- 後処理を必要としない高品質のイメージングデータを取得しました。
- 脊髄内の細胞動態の詳細な観察が可能です。
- 生体内での細胞間相互作用の理解が深まりました。
結論
- このプロトコルにより、脊髄の効果的な生体イメージングが可能になります。
- 呼吸運動を最小限に抑えることが、明瞭な画像を得るために重要です。
- この方法は脊髄の動態に関する研究を進展させる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Stable in vivo two-photon imaging of the mouse spinal cord enables direct visualization of cellular dynamics in disease-relevant CNS tissue, overcoming longstanding technical barriers to spinal cord research. This capability enhances predictive confidence in preclinical neuroinflammation and neurodegeneration models, supporting translational continuity from discovery through preclinical validation. The method's longitudinal imaging potential informs mechanistic de-risking and target validation for CNS drug discovery portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of microglia-vasculature interactions in living CNS tissue.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing cellular responses to injury or disease in real time.
- Facilitates functional target validation in neuroinflammatory and neurodegenerative models.
Screening & Assay Development
- Provides validated, reproducible imaging outputs for quantitative assessment of cellular dynamics.
- Reduces post-processing requirements, streamlining assay standardization and scalability.
- Enables preparation of robust biological systems for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant CNS models, supporting translational biomarker development.
- Enables longitudinal studies of axonal degeneration, regeneration, and neuroinflammation in vivo.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing high-resolution, time-lapse data across disease progression.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and longitudinal analysis in CNS models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of cellular mechanisms in the spinal cord.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs suitable for comparative analysis.
- Analytics: Provides high-resolution, time-lapse data for robust statistical evaluation of cellular dynamics.
- Translational Research: Facilitates continuity from mechanistic discovery to preclinical validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal CNS imaging across multiple disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and minimizes post-acquisition processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in neurobiology portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS programs based on direct, longitudinal evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surgical exposure and stabilization of the mouse spinal cord.
- Demands access to two-photon microscopy and custom stabilization instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis.
- Adaptation may be needed for different fluorescent reporter lines or disease models.
- Residual movement from cardiac activity may limit imaging at the finest spatial resolution.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:01
Spinal Cord Surgery
4:36
Stabilization of the Spinal Column and Preparation for in vivo Imaging
6:10
In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord with Two-photon Microscopy
7:16
Representative Results for in vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord
9:54
Conclusion
