黄熱病の蚊から血球を収集し、染色のためのプロトコルネッタイシマカ

この手順の全体的な目的は、蚊から血球を採取し、染色することです。まず、冷却した蚊に少量の抗凝固希釈液を注入し、血球を緩めて溶液中にすべての血球を分散させることでこれを達成します。

手順の第2ステップでは、蚊の脚、翅、および腹端を除去します。次に、灌流プロセスを開始するために、蚊の別の部位に新鮮な希釈液を注入します。最終ステップとして、希釈された血リンパを準備したスライド上に滴下し、回収した血球を固定および染色します。

最終的に、基本的なグライド顕微鏡観察を通じて、目的の蚊の種に見られる血球サイトの主要な種類と数を示す結果を得ることができます。浸潤法のような既存の手法に対するこの技術の主な利点は、浸潤法の簡便さと高圧注入法による精度の高さを兼ね備えつつ、最終目的に至るまでのステップ数が少ないことです。私たちの目的は、免疫刺激に応答して、血球のタイプとその存在量を特定することです。

この手法を実演するのは、私の研究室の学部生であるAmina Abdul Kumです。プロトコルを開始する前に、血リンパ希釈液を1 mLずつ分注して準備してください。これらを−20 °Cで保存し、分注した液の未使用分を再凍結させないでください。

厚さ1mmの顕微鏡スライドガラスに、直径1cmの円を描きます。蚊1匹につきスライドガラス1枚が必要です。引き伸ばし針を準備します。

各プルドニードルの先端を破断させ、ニードルの開口部を作ります。マイクロインジェクターのチューブおよびシリンジ構成部品に取り付けられたホルダーに、1本のニードルを装着します。次に、ミネラルオイルを用いて、チューブとニードルホルダーの組立体から気泡を除去します。

このハンドヘルドシリンジにミネラルオイルを吸い込み、気泡が入らないように注意します。針の下に、滴り落ちるオイルを受け止めるものを配置します。マイクロインジェクターのこの部分を開き、ここにオイルを入れて気泡を取り除きます。

これを、もう一方のチップと同様に、ハンドヘルドシリンジにクリップで固定します。ミネラルオイルをゆっくりと注入し、プラスチックチューブを通過させて、内部にある気泡をすべて取り除きます。その後、再び上部からミネラルオイルを滴り落ちるまで過剰に充填します。

次に、気泡が入らないように、これをガラスシリンジに再び接続します。その後、すべての針、チューブ、およびシリンジが満たされるまで、組み立てたコンポーネントにミネラルオイルを逆充填します。これで、マイクロインジェクターを希釈液の注入に使用する準備が整いました。

次に、動物の準備を行います。まず、氷の中に完全に浸す小型の固形ケージ容器に、成虫の雌15匹を吸引して入れます。蚊は寒さによって不動状態となり、通常8分以内に麻酔がかかります。マイクロインジェクションを行う凹み付きスライドグラスの上に、麻酔状態の蚊を1匹ずつ置きます。

顕微鏡下で、マイクロインジェクターを用いて血リンパ希釈液を12 µL採取します。ピンセットで蚊を顕微鏡上でそっと固定し、希釈液を3〜3.5 µL注入します。第7腹節と第8腹節の間で、腹部が膨らみます。

希釈液を注入する際、3匹の蚊に注入することができます。マイクロインジェクターをリロードする前に、注入済みのすべての蚊を氷上の清潔なプラスチックカップに入れ、約5分間回復させます。このインキュベーション中に、抗凝固希釈液が内部組織に付着している血球を剥離させます。

最初の動物群がインキュベーション中に回復している間に、通常、さらに3〜5匹の蚊に注入を行うことができます。カップに入れたまま5分経過した後、マイクロシザースを用いて、注入済みの蚊の肢、翅、および腹部の第8節の先端を切り取り、準備します。肢や翅を胸部や血腔に近すぎない位置で切断するように注意してください。

肢が外れる可能性があります。次に、エッチングスライドを70% ethanolで洗浄し、キムワイプで乾燥させます。顕微鏡下で、解剖した蚊を1匹、エッチングされた円の外縁に配置します。

マイクロインジェクターに12 µLの新鮮な希釈液を充填します。ピンセットで蚊を固定し、中胸の側面から8〜10 µLを注入します。この注入後、ミネラルオイルが注入されないよう注意してください。

血リンパを腹部からエッチングサークル内に採取します。ピンセットで腹部を優しく圧迫し、血リンパの流れを誘導・促進させてください。その後、スライド上に採取した血リンパを乾燥させます。これには約10分かかります。

これで染色の準備が整いました。各スライドをHema threeで個別に染色します。各スライドを固定液に5回浸し、1回につき1秒間だけ浸してください。

続いて、溶液1に1秒間ずつ3回浸し、同様に溶液2に浸します。次に、スライドの背面のみを脱イオン水で洗浄してください。表面は洗わないでください。表面を乾燥させ、封入剤を用いてカバーガラスを載せます。封入剤が染色された組織全体に完全に広がるよう、カバーガラスを軽く押さえてください。

最適な結果を得るため、スライドを最低3時間乾燥させます。染色した血球は、この調製から2週間以内に観察および撮影してください。成体雌から得られたこれらの細胞は、本プロトコルを用いて同定されました。

最初の画像は、その形状と高い核細胞質比に基づいた前赤芽球系造血細胞を示しています。この画像は、その形状と細胞質対核比に基づいた赤芽球系細胞です。最後は、顆粒球系の造血細胞です。

従来の高注入法と比較して、組織の質感がより顆粒状であり、形状はより卵形（OID）になります。このプロトコルでは、習得後、同様の総血球数が得られ、同様に顆粒部位が最も一般的な細胞型として同定されました。適切に実施すれば、この手法を用いて15から20匹の蚊を1時間で処理することが可能です。

このビデオを視聴することで、蚊へのdextranの適切な注入方法、血リンパ（hemolymph）の採取方法、そして可視化およびイメージングのための血リンパの調製方法について十分に理解することができます。