Name: 前臨床モデルにおける虚血性心不全のための遺伝子導入 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学ぶ虚血性心不全の遺伝子治療法。ブタモデルで心筋梗塞を誘導し、ウイルスベクターを冠動脈内に投与して遺伝子導入を行う簡便で再現性の高い手法です。心疾患治療の新たな戦略開発に貢献します。

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この作品は、NIH R01 HL093183、HL088434、HL071763、HL080498、HL083156、そしてP20HL100396（RJH）で、Caerusネットワーク（RJH）を通じてLeducq財団によってサポートされています。 DLは、ドイツ研究財団によってサポートされていました。我々はこのプロジェクトでは彼女の技術支援のためにローレンLeonardsonに感謝します。

1。心筋梗塞の作成<ol><li>アニマルバイオテクノロジー産業の女性ヨークシャーブタは（20キロ）（ドイルズタウン、PA）Telazol（tiletamine / zolazepam）（8.0 mg / kg体重）およびブプレノルフィン（0.6 mg）を使用してプリ薬用です。 </li><li>動物は挿管し、100％酸素で換気されています。全身麻酔は、プロシージャ全体でプロポフォール（5-8mg/kg/hr）で維持されます。 </li><li>大腿サイトはポビドンヨードに続く70％イソプロピルアルコールで用意されています。経皮的穿刺は、動脈へのアクセスとシースの配置のために用意されています。シース挿入後、ヘパリンの3000から5000 IUは、250〜300秒の活性化凝固時間を維持するためにIVを投与する。 </li><li>アミオダロン（75 mg）のボーラス投与は筋肉内に投与される。アミオダロン（75 mg）を、アトロピン（2mg）を、および酢酸カリウム（20 MEQ）で1000 ml生理食塩水バッグの静脈内注入が開始され、プロシージャ全体で150ミリリットル/時の速度を使用して維持されます。 </li><li> 7神父ホッケースティックのカテーテルは、（コーディス、マイアミ、フロリダ州）左冠状動脈に高度であり、冠動脈造影が行われます。 0.014インチのガイドワイヤー（アボット、パーク、イリノイ州）は冠状動脈（LAD）を左前に進んでいる。 8 mmの長、4.0 mmのVOYAGERオーバーザワイヤーバルーン（アボット、パーク、イリノイ州）が進んでおり、位置付け近位LADで、冠動脈バルーンは3気圧に膨張される。 LADの閉塞が血管造影によって確認されます。 </li><li>連続的な心電図と血行動態モニタリングで、閉塞は90分間維持されます。悪性心室性不整脈は、時折投与される場合200 Jから300 Jまで直流ショックの即時配信をで、最初の40分以内に発生する可能性があります。通常、不整脈の二つのピークの時間枠、1つの2〜10分、バルーン拡張後に25〜35分の間に他のがあります。フレームが示された時間内に心室細動の入力の95％以上の発生率があるので、入念に監視し、即座に除細動は、成功した心筋梗塞の創造への鍵です。迅速かつ適切な除細動が行われている場合、生存率は非常に高いです。血圧が80 mmHgの下に低下した場合、容積負荷は、急速な静脈内生理食塩水注入で実現されます。 </li><li>バルーンが収縮され、すべてのデバイスが削除されます。 </li><li>シースは、麻酔が源泉徴収され、大腿動脈から削除され、そして動物は、リカバリ中に監視されます。アミオダロン、アトロピンと酢酸カリウムの点滴と静脈内生理食塩水を50ml /時間で減少し、一晩与えられます。 NitroglycerlineとFuroscemideの筋肉内注射が投与される。その後、動物を回復されており、慎重な心電図モニタリングは少なくとも3時間続ける。 </li><li>アスピリン（200mg）をPOは5日間が与えられます。 </li></ol>心筋梗塞の作成手順の実行中および終了後は一般的な合併症は、冠動脈解離、穿刺部位の血腫、不整脈、および心不全です。技術を洗練し、徹底的な監視は、これらの合併症を予防して管理するために必要です。 2。ウイルスのインジェクション<ol><li>上記の心筋梗塞の作成steps1 - 3で示されているように動物が用意されています。ヘパリンの同一投与量は、ウイルスの注入中に血栓症を防ぐために与えられるべきである。 </li><li> 5Frホッケースティックのカテーテル（コーディス、マイアミ、FL）は左冠状動脈に進められます。血管造影後、0.014インチのガイドワイヤーの二人は、LADおよびカテーテルの位置を修正するために、左冠動脈回旋枝（LCX）への1つへの1つ進んでいます。 </li><li>動脈血（-20 ml）をカテーテルから引き出される。注入時の虚血を防ぐために、ハーフ希釈した血液は、ソリューションに使用されます。ウイルスは、10 mlの血液と混合し、生理食塩水で20mlに希釈される。残りの10 mlを、20 mlに希釈し、カテーテルの内腔内残存ウイルスを提供するために使用されます。 </li><li>静脈注射用ニトログリセリン（20μgを/分）は耳静脈を介して開始されます。 </li><li>カテーテルの先端は、近位左主管に配置されます。カテーテルを介して圧力は、カテーテルが楔されていないことを保証するために監視されます。 </li><li>ウイルス混合血液（15ml）を、左冠状動脈に注入ポンプを使用して、15分にわたってカテーテルを介して注入される。 15分後、注射器は、フラッシュに交換され、そして注入は10分間継続しています。 </li><li>ワイヤとカテーテルが右冠動脈に左冠状動脈と同じ方法で固定されている。 </li><li>ウイルスと混合血液の残りの5mlをフラッシュの10分に続いて5分間右冠動脈に注入されます。 </li></ol> 3。代表的なケース図1は、心筋梗塞の作成後1ヶ月で左室造影を示しています。左心室壁運動が有意の駆出率（EF）と低下している31％であった。図2は、1ヶ月での左心室の断面を示しています。ベースから前壁の頂部に大きな傷が見られます。このモデルでは、心筋梗塞後1ヶ月での平均EFは36％であり、心筋梗塞のない同じサイズの動物のそれらの平均はそれぞれ、68％、42ミリリットルであるのに対し、平均的な拡張末期容積は、83ミリリットルです。図3は、左心室の境界ゾーンの領域におけるβ- galの発現アデノ随伴ウイルス（rAAV1 CMVラック- Zの2 × 10 12 DNアーゼresitant粒子）の注入後1ヶ月を示しています。増強された発現は、ウイルスの注入領域で発見された。 <img src="/files/ftp_upload/2778/2778fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。駆出率は心筋梗塞の作成 ​​後1ヶ月左室造影から測定。左心室は92.5ミリリットルに瞳孔が開いていると前壁の動きが大幅に低下します。 <img src="/files/ftp_upload/2778/2778fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 瘢痕領域の輪郭を描くためにトリフェニルテトラゾリウムクロライドで染色した心筋梗塞の作成 ​​後1ヶ月での左心室の2断面、 図 。ベースから前壁の頂部に大きな傷が見られます。 <img src="/files/ftp_upload/2778/2778fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。アデノ随伴ウイルス（rAAV1 CMVラック- Zの2 × 10 12 DNアーゼ性粒子）により誘導されるβ- gal発現。増強された発現は梗塞及び正常組織、冠動脈内のウイルス注入後1ヶ月の間の国境地帯の領域で発見されています。右下の写真は、生理食塩水は、同じプロトコルを使用して冠状動脈に注入したネガティブコントロールを示しています。

<ol><li>Perez de Prado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed-chest+experimental+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).</li>
<li>Angeli, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+ventricular+remodeling+after+myocardial+infarction%3A+characterization+of+a+swine+model+on+beta-blocker+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Left ventricular remodeling after myocardial infarction: characterization of a swine model on beta-blocker therapy.</a> Comp Med. 59, 272-279 (2009).</li>
<li>Urdaneta, F., Lobato, E. B., Kirby, D. S. &amp, Sidi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+myocardial+stunning+randomly%2C+with+either+propofol+or+isoflurane+following+transient+coronary+occlusion+and+reperfusion+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Card+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Treating myocardial stunning randomly, with either propofol or isoflurane following transient coronary occlusion and reperfusion in pigs.</a> Ann Card Anaesth. 12, 113-121 (2009).</li>
<li>Jaski, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+upregulation+by+percutaneous+administration+of+gene+therapy+in+cardiac+disease+%28CUPID+Trial%29%2C+a+first-in-human+phase+1%2F2+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Card+Fail%22%5BJournal%5D)">Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease (CUPID Trial), a first-in-human phase 1/2 clinical trial.</a> J Card Fail. 15, 171-181 (2009).</li>
</ol>

すべての著者は原稿に関連して利害の対立としてもたらす可能性は商業的関連を持っていません。

心不全の様々な原因の中で、虚血は、これまでで最も頻繁に病因にすることです。この深刻な病気を克服するために、様々な治療アプローチが開発されている。これらの有望な治療法が診療所に適用することができるされる前に治療法の慎重な評価が必要です。したがって、患者の臨床状態を表す虚血性心不全モデルの確立は、心不全治療薬の開発にとって非常に重要です。私たちの豚心筋梗塞モデルでは、これらの翻訳要件を満たしています。 心筋梗塞を作成することにより、心不全を誘発するために、梗塞領域の大きさでなければなりません。我々のモデルはまた、血管内治療心筋梗塞モデル1を使用する以前の研究に比べて大きな傷を持っています。我々はアミオダロンを投与し、冠動脈閉塞に80 mmHgの上の血圧の維持は生存率と梗塞領域の両方を高めるために不可欠であることを見出した。イソフルランは、この手順1-2の効果的な麻酔薬である一方、我々はプロポフォールと、高い血圧が維持できることがわかった。さらに、イソフルランはプロポフォール3に比べてより多くの心臓保護効果を有することが報...

<table><tbody><tr><td>Telazol</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>0856-9050-49</td><td></td></tr><tr><td>プロポフォール</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>63323-270-20</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>63323-540-11</td><td></td></tr><tr><td>アミオダロン</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>63323-616-03</td><td></td></tr><tr><td>硫酸アトロピン</td><td>Med-Pharmex</td><td>54925-063-10</td><td></td></tr><tr><td>酢酸カリウム</td><td>American Regent Inc.</td><td>2053-25</td><td></td></tr><tr><td>ニトログリセリン</td><td>American Regent Inc.</td><td>4810-25</td><td></td></tr><tr><td>Salix (フロセミド)</td><td>Intervet Inc.</td><td>710461</td><td></td></tr><tr><td>5 Fr ホッキースティックカテーテル</td><td>Cordis</td><td>556-278-0L</td><td></td></tr><tr><td>7 Fr ホッキースティックカテーテル</td><td>Cordis</td><td>778-278-00</td><td></td></tr><tr><td>冠動脈用ガイドワイヤー</td><td>Abbott Laboratories</td><td>1044588</td><td></td></tr><tr><td>冠動脈用バルーン</td><td>Abbott Laboratories</td><td>1009447-08</td><td></td></tr><tr><td>8Fr シース</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>RSS801</td><td></td></tr></tbody></table>

前臨床モデルにおける虚血性心不全のための遺伝子導入

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

様々な新技術は、心不全患者のために開発されている。十分に確立された前臨床評価は、その有効性と安全性を判断する必要があります。 ウイルスベクターを用いた遺伝子治療は、心臓疾患を治療するための最も有望なアプローチの一つです。キャリアの遺伝子を変えることによりさまざまな遺伝子のウイルス送達は、計り知れない治療能力を持っています。 このビデオでは、遺伝子導入に続いて心不全の作成の動物モデルの完全なプロセスは、豚モデルを使用して表示されます。最初に、心筋梗塞は冠動脈の降順近左前を閉塞することによって作成されます。慢性心不全における心臓リモデリングの結果。我々のモデルに固有の、真に肯定的な成果のための積極的な治療を必要とする重症心不全患者を反映してかなり大きな傷跡です。瘢痕組織の心筋梗塞の創造と発展を経て、ウイルスの冠動脈内注入は、同時ニトログリセリン注入で示されています。私たちの注入法は、強化された遺伝子発現でシンプルかつ効率的な遺伝子導入を提供します。冠動脈内のウイルスの配信と心筋梗塞豚モデルのこの組み合わせは、個々の遺伝子の効果をテストするだけでなく、支援の一貫性と再現性のある方法論、であることが証明さだけでなく、治療薬候補として多くの遺伝子の有効性を比較しました。

虚血性心不全の治療のための遺伝子導入法は、心筋梗塞の豚モデルを使用して記述されます。私たちのシンプルで再現性のある方法は、私たちは容易に非常にシンプルかつ再現可能な方法で様々な遺伝子の転送の有効性を評価することができます。

心不全患者に向けて、さまざまな新興技術の開発が進められています。……を決定するためには、十分に確立された前臨床評価が必要です。

遺伝子治療。ウイルスベクターの使用は、心疾患治療において最も有望なアプローチの一つです。本ビデオでは、虚血性心不全モデルの作製およびウイルスベクターによる遺伝子導入の手順について解説します。最初のステップは、ブタモデルにおいて心筋梗塞を作製することです。まず、冠動脈ワイヤーを冠動脈内に挿入し、続いて閉塞バルーンを挿入します。血管内アクセントを用いてバルーンを膨張させ、冠動脈を完全に閉塞させます。その結果、前方領域に大きな心筋梗塞が形成され、豚に慢性心不全が発症します。次のステップはウイルスの注入です。ウイルスベクターを冠状動脈にゆっくりと注入します。それは血流に乗って心筋へと分布します。ウイルスは心筋細胞内に進入し、その後核へと入り込み、タンパク質を合成するための信号を送ります。発現したタンパク質は心機能を強化し、全体的な機能を向上させます。このビデオでは、ブタモデルを用いた虚血性心不全に対する遺伝子治療の手順を紹介します。まず、心筋梗塞を誘発する方法を示し、次に、ウイルスベクターの冠動脈内投与について実演します。この手順を用いて、さまざまな遺伝子導入の有効性と安全性を検証します。それでは始めましょう。まず、テラゾールを用いて豚に麻酔を導入します。耳静脈に静脈ラインを確保し、その後、豚に気管挿管を行います。豚を背臥位にしてください。実験中の全身麻酔にはプロポフォールを使用します。血圧を維持するため、鼠径部をアルコールで清浄し、続いてヨードで消毒します。滅菌シートで部位を覆い、すべてを無菌的に準備します。セルジンガー法を用い、18ゲージの針で大腿動脈を穿刺します。拍動性の逆流が確認できたらガイドワイヤーを挿入し、続いてシースを留置します。シース挿入後、実験中の血栓形成を防ぐためにヘパリンを注入します。次に、アミオダロン 75 mg、カリウム 20 mEq、およびアトロピン 20 mgを含む生理食塩水バッグを準備し、150 mL/hの速度で投与します。このとき、アミオダロン 75 mgを筋肉内注射します。ガイドカテーテルを左冠動脈口まで進め、血管造影を行って冠動脈の解剖学的構造を確認します。左前下行枝にガイドワイヤーを慎重に挿入します。次に、ワイヤーに沿ってバルーンを冠動脈内へ進めます。血管造影を行い、バルーンの位置を確認してください。バルーンの位置を確認するため、別の角度から再度アンギオグラフィを撮影します。その後、バルーンを3 ATMまで徐々に膨らませます。さらにアンギオグラフィを撮影し、動脈の閉塞を確認します。動脈圧および心電図を用いてブタをモニターします。時折、ブタが心室細動に陥ることがあります。その場合は、速やかに直流電気ショックによる除細動を行ってください。処置が失敗した場合は、除細動器が充電されるまで胸部を圧迫し、再度電気ショックを与えます。90分間観察した後、バルーンを脱気します。血圧と不整脈が安定したことを確認し、シースを抜去して豚を回復させます。ニトログリセリンとフロセミドを筋肉内注射し、アミオダロンを含む輸液を夜間に投与します。キャップマスク、ゴーグル、ガウン、手袋を着用して準備してください。豚の準備は、心筋梗塞作成時と同様の手順で行います。左前下降枝および左回旋枝に、それぞれ冠動脈用ワイヤーを1本ずつ挿入します。カテーテルを開口部に配置します。動脈血を20 milliliters採取し、そのうち10 millilitersをウイルス注入用に、残りをフラッシュに使用します。ウイルスを10 millilitersの血液と混合し、生理食塩水で20 millilitersに希釈します。次に、残りの血液を生理食塩水で20 millilitersに希釈し、2本のシリンジに等分します。ウイルスを混合した血液が入ったシリンジをカテーテルに接続し、注入の準備をします。耳静脈からニトログリセリンを20 µg/minで静脈注射し、血管造影を行ってカテーテルの位置を確認します。その後、左冠動脈に15 mLが注入された時点で、1 mL/minの速度でウイルス注入を開始します。シリンジをフラッシュ用に交換し、同じ注入速度を維持します。左冠動脈への注入後、残りのウイルス含有血5 mLを用いて、右冠動脈に対しても同様の手順を行います。心筋梗塞を作製して1か月後、Pは壁運動の低下と心拡大を伴う心不全を発症します。このモデルにおける心筋梗塞後1か月の平均駆出率は36%であり、心筋梗塞のない同サイズの豚よりも有意に低くなります。平均左室終末拡張期容量は83 millilitersであるのに対し、対照群の平均は42 millilitersです。心筋梗塞を起こした豚では、DP DTも有意に低下していました。これらは左心室の横断面です。心筋梗塞から1ヶ月後、内壁の基部から心尖部にかけて大きな瘢痕が認められます。この写真はgaleの発現を示しています。デンタル関連ウイルスを用いた遺伝子導入から1ヶ月後、ウイルス注入領域に有意な発現が認められました。以上で、コロナウイルス注入およびブタにおける心筋効果の作成方法について説明しました。この虚血性不全モデルと遺伝子導入の組み合わせは、軌道疾患における様々な種類の遺伝子治療を試験するための、簡便で再現性の高い手法です。ご視聴ありがとうございました。皆様の今後の研究にぜひお役立てください。

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