すべてのインフルエンザA型の定量的な分析シンプルなスロットブロットアッセイでユニバーサル抗体を用いたウイルスHemagglutininsとノイラミニダーゼ

この手順の全体的な目標は、保存されたエピトープを標的とする抗体を使用して、ワクチン中のインフルエンザウイルスのヘマグルチニンとノイラミニダーゼの含有量を定量的に決定することです。これは、最初に保存されたエピトープを特定することによって達成されます。手順の2番目のステップは、参照サンプルとワクチンサンプルを希釈して検出感度を向上させることです。

3番目のステップは、スロットブロット装置を組み立て、サンプルをスロットにロードすることです。手順の4番目のステップは、それぞれのユニバーサル抗体を使用してメンブレン上のHAまたはNAを検出することです。手順の最後のステップは、デンシトメトリーによってHAまたはNAの量を定量化することです。

最終的には、HAまたはNAがそれぞれの参照抗原に対して定量化されたことを示す結果を得ることができます。こんにちは、私の名前はアンワル・ハシェムです。私はDr.Sean Leeの研究室の博士課程の学生です。

こんにちは、私の名前はキャロライン・グラブで、カナダ保健省ワクチン評価センターのショーン・リー博士の研究室の技術者です。本日は、インフルエンザウイルスのHA抗原とNA抗原を定量するために使用されるスロットボット手順を実演します。この手法は、単一放射型免疫拡散SRIDや物理化学的方法などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、SRIDや物理化学的方法などの高度な機器に反する株やサブタイプ特異的な抗体を必要としないことです。

さらに、これらの抗体はRAの普遍的に保存された唯一のエピトープを標的とするため、関心のある研究者にとって基本的な研究ツールとして有用です。一般に、この方法に不慣れな人は、沈殿したワクチンサンプルのブロックの難しさ、スロット間のサンプルの漏れ、ブロッティングステップ中の真空の損失、免疫検出後に観察されるびまん性バンドの高いバックグラウンドなどの技術的な問題に遭遇する可能性があるため、苦労するでしょう。ただし、いくつかの重要なステップに注意を払うことで、これらの問題を解決することができます。

今日は手順をデモンストレーションします。それでは始めましょう。保存された領域を特定するために、クラスターWのアラインメントを使用して、NCBIから合計6,000を超えるインフルエンザA HA配列を分析し、HA 2サブユニットのN末端を高度に保存された領域として見つけました。

同定されたコンセンサス配列のアミノ酸の各位置のシャノンエントロピーと保存率を計算しました。赤で示されているUNI Oneエピトープは、スロットブロットアッセイ用のHAに対するユニバーサル抗体を開発するために選択されました。同様のアプローチを用いて、すべてのインフルエンザにおいて、2つの普遍的に保存された配列が同定され、1つは酵素活性部位に近く、もう1つはこれらのアミノ酸配列を持つ末端末端ペプチドを抗原として使用して、スロットブロットアッセイのためのNAに対する普遍的な抗体を作製した。

スロットブロットの手順を開始する前に、ヘマグルチニンまたはHAスロットブロット用にTBS中の4つのMO尿素溶液を20ミリリットル、ノイラミニダーゼまたはNAスロットブロット用にTBS中の0.01%エルゲン溶液を20ミリリットル調製し、TBS溶液に20リットルを添加して最終濃度0.1%にすることにより、2リットルの洗浄緩衝液を調製します。 スキムミルクパウダーを最終濃度5%に溶解することにより、洗浄バッファーの体積に対して80ミリリットルのブロッキングバッファーを調製します。PDFメンブレンとメタノールを15秒間活性化した後、二重蒸留水で2分間すすぎます。TBSで3枚のTブロットSF濾紙をプレウェットするまで、試験するワクチン株に対応する所定のHA含有量のインフルエンザワクチン参照標準を使用するまで、メンブレンをTBS

米国のCenter for Biologics Evaluation and Researchまたは英国のNational Institute for Biological Standard and Controlから入手し、HA参照抗原および試験ワクチンサンプルのスロットブロットによるHAまたはNA定量に使用しました。650 μLの希釈HA参照抗原ストックを、記載されている濃度の4 molo urea TBSに調製します。次に、10 x、20 x、40 xなどの3つの異なる希釈で4 mo尿素TBSに650マイクロリットルの試験ワクチンサンプルを調製して、2倍の差を達成し、サンプル濃度がNA参照抗原と試験ワクチンサンプルの標準曲線内に収まるようにします。

NA抗原標準液を0.01%sugen TBSに各650μLずつ調製し、記載の濃度で、SDSページと高密度サイトメトリー解析を併用して抗原標準液を社内で作成しました。次に、0.01%sugen TBSに650マイクロリットルの試験ワクチンサンプルを10 x、20 x、40 xなどの3つの異なる希釈で調製して、2倍の差を達成し、サンプル濃度が標準曲線内に収まるようにします。ガスケット支持板を真空マニホールドに、天井ガスケットを上に配置して、事前に洗浄および乾燥させたバイオSF精密ろ過装置を組み立てます。

3枚の湿ったBIOSFフィルターペーパーをガスケットの上に置きます。次に、事前に浸したPVDF膜。次に、サンプルテンプレートをメンブレンの上に置き、斜めの交差パターンを使用して4本のネジを指で締めて、メンブレン表面に圧力が均一に適用されることを確認します装置を接続する前に、三方弁が真空マニホールドを真空源にさらすように設定されていることを確認してください。

ポンプの電源を入れ、バイオドット装置を接続します。フローバルブがサンプルウェルの下のレベルに配置されていることを確認して、次の手順でサンプルを迅速かつ適切に排出します。斜めの交差パターンを使用してネジの締め付け手順を繰り返します。

バキュームがかかっている間にネジを締めると、密閉性が向上し、ウェル間のクロスコンタミネーションを防ぐことができます。次に、フローバルブを交換して真空マニホールドを空気にさらし、ポンプをオフにします。次に、マルチチャンネルピペッターを使用して100マイクロリットルのTBSをすべてのウェルに塗布し、メンブレンを再水和します。

スロットを均等に覆うために、できるだけ底に近いウェルの中央に溶液を塗布します。清潔なピペッターチップを使用して、導入された気泡を取り除きます。フローバルブを交換して、マニホールドを空気と真空の両方にさらします。

ポンプの電源を入れ、空気にさらされた細孔に指を当てて真空の量を調整し、ウェルからバッファーを静かに排出します。次に、フローバルブを交換して、マニホールドを空気にさらします。バッファーがすべてのウェルから完全に排出されるとすぐに。

ポンプの電源を切るか、掃除機を外してください。ウェルごとに各標準試料またはワクチンサンプル希釈液を200マイクロリットルずつ適用します。サンプルをピペットで、各ウェルの中央に1つずつ、できるだけ底に近づけます。

エアラブルを避けて取り外すように注意しました。未使用のウェルに200マイクロリットルのサンプル希釈バッファーを入れて、使用中のウェルに適切な真空を確保します。フローバルブを調整して、マニホールドを空気と真空の両方にさらします。

真空ポンプをオンにし、空気にさらされた細孔に指1本で真空の量を制御して、サンプルがウェルから完全に排出されるようにします。ポートから指を離して、掃除機を解放します。すべてのサンプルがすぐに排出されるとすぐに。

各ウェルに200マイクロリットルのTBSを追加します。マルチチャンネルピペッターを使用して、空気にさらされたポートに指1本で真空量を制御することにより、穏やかな真空を適用してウェルを排出および洗浄します。ウェルが完全に排出されたらすぐに洗浄手順を1回繰り返し、サンプルテンプレートのネジを緩め、真空をオフにして、過度の乾燥を防ぎます。

ウェルはすぐにメンブレンを除去し、ブロッキングバッファーに入れます。メンブレンを完全に覆うのに十分なバッファーを使用します。摂氏4度で一晩インキュベートし、穏やかに揺らします。

一晩のインキュベーションとブロッキングバッファーの後。記載されているようにメンブレンを2回洗浄し、その後、すべての洗浄とインキュベーションで揺さぶります。メンブレンが溶液で完全に覆われていることを確認してください。

次に、HAに対するuni oneユニバーサルウサギ抗体またはユニバーサル抗体HCA dash 2またはHCA dash 3とメンブレンをインキュベートし、室温で1時間、洗浄バッファーで容量BSAに5%重量で希釈したNAに対して、ウサギ抗血清の1〜4,000の希釈により、これらの抗体に最適な結果が得られました。その後、メンブレンを室温で3回、毎回15分間穏やかに揺らしながら洗浄します。次に、ヤギの抗IgG、IgGペルオキシダーゼ標識抗体およびブロッキングバッファーの1〜50,000希釈でメンブレンをインキュベートし、インキュベーション後に穏やかに揺さぶって室温で30分間インキュベートし、メンブレンと洗浄バッファーを室温で3回洗浄します。

次に、メンブレンをTBSで5分間静かに揺らしながら洗浄し、メンブレン表面に残っているtween20洗剤を取り除きます。次に、Super Signal West Dura Extending Duration Substrate Kitから各試薬3ミリリットルを用いて現像基質を調製し、混合します。乾燥したティッシュペーパーの上にメンブレンをしっかりと置き、余分なTBSバッファーを穏やかに除去してから、乾燥容器に移し、基質を塗布し、室温で5分間静かに揺さぶりながらインキュベートし、ブロッティングで余分な基質を取り除きます。

終了したら、メンブレンを化学発光フィルムにさらします。露出の長さは、信号の飽和を避けるために最適化する必要がありますが、通常は10秒から10分の範囲です。開発したフィルムの高密度サイトメトリー解析は、製造元の指示に従って、flora chem gel ドキュメンテーションシステムを使用して行いました。

参照抗原の複製と試験ワクチンサンプルの各セットの密度値を平均化します。トリプルキットは、有意性検定や実験誤差の評価に必要です。平均密度値と各スロットのHA抗原またはNA抗原の量をプロットします。

参照標準から取得。ここでは、参照ワクチンの濃度と密度を使用して、可変勾配の非線形回帰曲線フィッティングアプローチを使用してテストサンプルワクチンの密度からサンプル濃度を推定するイムノアッセイの4パラメータロジスティックモデルを示しています。グラフPRISMは、ここに示すように、標準曲線をプロットし、得られた密度データから濃度を求めるために使用されます。

HA万能抗体UNI oneは、ウイルス配列に対して顕著な特異性を示し、インフルエンザの13の異なるサブタイプに結合することができる。ウイルスに感染した胚鶏卵の耳鼻咽喉科トイック液から抽出したHAです。NPタンパク質はローディングコントロールです。

ネガティブコントロールは未感染の卵からの耳鼻咽喉科トイック液であり、ポジティブコントロールはN-I-B-S-C由来のH oneの参照標準です。HAタンパク質の移動性に観察される違いは、そのサイズや処理段階の違いによるものと考えられます。ここに示すように、NAの両方の保存されたエピトープに対する抗体HCA dash 2およびHCA dash 3は、NAの9つのサブタイプすべてに結合することができ、Alan Toicまたは細胞タンパク質に対する交差反応性はほとんど示されず、Pタンパク質制御はパネルCに示されている。antisera NPタンパク質コントロールは下部に示されています。

この画像は、定量のHAと同様の代表的な結果を示しており、インフルエンザワクチン参照標準品およびワクチンサンプル中のNA抗原。密度分析により、スロットブロットによりワクチン標準試料の様々な希釈液中のNA抗原を検出することによって得られるシグナルの強度は、naの濃度に比例することが示されました。この手順を試みる際には、ワクチンサンプルを前処理して沈殿物を溶解し、スロットからの適切な排水を確保することを忘れないでください。

また、ウェル間でのサンプルの漏れを防ぐために、ロットの注意も必要です。抗体の希釈とインキュベーション時間の最適化は、検出に使用される新しい抗体が、開発後のバックグラウンドを最小限に抑えながら理想的な強度のシャープなシグナルを得るために必要になる場合があります。この技術は、インフルエンザワクチン研究の分野の科学者に道を開きました。

HAおよびNA抗原のさらなる将来の定量分析。このビデオを見れば、株特異的抗体を使用せずに簡単なアッセイでインフルエンザウイルスの重要な表面タンパク質を定量する方法を十分に理解できるはずです。