見つけにくい小型哺乳類から高品質のDNAを得るために非侵襲ヘアサンプリング法

アメリカのナキウサギのために示されるように我々は、効率的にとらえどころのない小さな哺乳類から毛髪サンプルを収集するために非侵襲的サンプリングの手法を提示する。我々は、サンプリングされた髪の毛からDNAを抽出し、一般的に野生動物の生態と保全の研究で使用されている分子マーカーのいくつかのタイプを増幅することによってこの方法の有用性を実証する。

野生生物集団遺伝学者は、関心のある種からデータを取得するために、非侵襲的なサンプリングアプローチをますます使用しています。このようなアプローチは、特に希少でとらえどころのない動物において、動物の行動、個体数、人口統計学、遺伝学に関連する問題を調査するのに役立つことが証明されていますが、毛髪研究者などの生物学的材料を遠隔で収集することで、関心のある種を邪魔したり、傷つけたり、観察したりすることなく動物を研究できます。これらの技術は、主にハイイログマなどの中型から大型の肉食動物に適用されてきましたが、このギャップを埋めるための小型の草食性哺乳類にはあまり焦点が当てられていませんでした。

小型哺乳類のサンプルに対する斬新で革新的なアプローチが開発されています。このビデオ記事では、アメリカナキウサギと呼ばれる小さなウサギ目から目立たないように毛のサンプルを取得するための新しく革新的な方法について説明します。これらの小さな哺乳類は、ニューメキシコ州やカリフォルニアからブリティッシュコロンビア州中部まで、北米の山岳地帯全体で見られます。

彼らはタラスロープと呼ばれる岩だらけの滑り台に生息し、捕食からの避難所を提供するだけでなく、極端な環境からの保護を提供します。それらは通常、その範囲の南部の海抜2, 500メートルを超える標高で見られますが、分布の北部端の海面でも見られる場合があります。ナキウサギは冬眠しません。

彼らは夏の一日中活動していますが、朝と夕方に活動を集中させます。気温が下がると、タリの斜面に隣接する牧草地に足を踏み入れ、近隣の植生を掘ります。ピカの特徴の一つは、野外で食べ物を食べるだけではないことです。

タリスの領土に持ち帰り、干し草の山に保管します。この種は簡単に検出できますが、本質的に恥ずかしがり屋で、研究者が仕掛けた生きた罠を避けることがよくあります。さらに、ナキウサギは取り扱いに敏感であることがわかっているため、生態学的、行動的、進化的なさまざまな問題を研究するために、動物が死に

このとらえどころのない小型哺乳類で、影響を最小限に抑えながら、ブリティッシュコロンビア大学のオカナガンキャンパスの博士候補フィリップヘンリーは、種に適した非侵襲的なサンプリング技術を開発しました。罠を仕掛ける前に、彼はタリス斜面に活動的なPIKAの領土の証拠を探します。これには、動物が夏の終わりにウィッチャーの生存と新鮮なスキャットのために収集する植生のキャッシュである干し草の山が含まれます。

それは通常、特定のレアサイトで見つかります。tlu内で生息地の潜在的なピークが特定されると、ヘアスネアがその入り口に戦略的に配置されます。フィリップは、パッキングテープのロールを使用して、テープのストリップを巧みに巻き、それらをウェブ状に並べて包み

隠れ家トラップの入り口は、動物が入るには大きすぎたり小さすぎたりしない穴を提供する複雑なデザインで作られています。仮に、ナキウサギは罠を通過し、日常のタスクを続けながら毛のサンプルを残します。邪魔 されず。髪の毛自体は非常に細く、根元は小さな球根です。

分析のための適切なサンプルを得るためには、同じ個体に属する最低25本の毛髪が望まれます。また、インパクトの位置はテープに沿って明確である必要があります。独立してクラスター化されているものはすべて、別々の個体と見なされます。

クラスター化されたものは同一であると仮定されますが、収集された髪の毛は、サンプル、特に核DNAを最も濃度の高い根球の構造を乱すことなく、滅菌鉗子を使用してテープから慎重に取り除くことができます。その後、毛髪を2ミリリットルの極低温チューブに慎重に入れ、サンプルがさらなる分析のために実験室に到達するまで液体窒素処理器に保管します。実験室に入ると、髪の毛のサンプルは、髪の毛の損失を避けるためにマイクロ遠心分離機でスピンダウンされます チューブDNAは、Promega DNA IQシステムを使用して髪の毛のサンプルから抽出され、最初のステップは、インキュベーションバッファーの100マイクロリットル、プロテイナーゼKの1ミリリットルあたり1.8ミリグラム、およびDTTの0.1モルを含む溶液を準備することです。

次に100マイクロリットルのインキュベーション溶液を毛髪に加え、摂氏56度で1時間インキュベートします。次に、サンプルは、0.01モルのDTTと7マイクロリットルの再懸濁DNAのIQ樹脂を含む200マイクロリットルの溶解バッファーで処理されます。その後、サンプルを高速で3秒間ボルテックスし、室温で5〜10分間インキュベートします。

次に、分解されたサンプルを高速で2秒間ボルテックスし、磁気分離ステントに入れます。この時点で、DNA断片を含む磁性樹脂は溶液から瞬時に分離され、チューブの底でペレットに形成されます。その後、残りの溶液は除去され、廃棄されます。

次に、サンプルを100マイクロリットルの溶解バッファーボルテックスで再度処理し、分離が起こる磁気スタンドに戻します。ここでも、この同じステップを洗浄バッファーを使用してさらに3回繰り返します。最終洗浄後、サンプルを磁性砂中で15分間乾燥させます。

次に、100マイクロリットルの溶出バッファーをサンプルに加え、摂氏65度で5分間インキュベートしました。最後に、サンプルを2秒間ボルテックスし、磁気スタンドに入れます。次に、DNA溶液を1.5ミリリットルのeinorチューブに移し、摂氏マイナス20度で保存します。

さらなる分析まで、私の名前はピーター・ボヒです。私は、ブリティッシュコロンビア大学オカナガンキャンパスにあるマイケル・ロッソ博士の生態学および保全ゲノミクス研究室の博士課程の候補者です。今年の夏にサンプリングした髪の毛から抽出したDNAは、PCRに使用され、さまざまな種類の分子マーカーを増幅しました。

また、肝臓サンプルをポジティブコントロールおよびベースとして使用しました。私たちの方法の比較のために、私たちは、集団、私たちの動物の遺伝的構造を研究するために使用される核マイクロサテライト遺伝子座を増幅し、また、高度勾配に沿った遺伝的基礎適応を研究するために使用されるA FLPゲノムスキャンを増幅しました。また、ミトコンドリアDNA配列を最大800匹のベースベアまで増幅し、種の系統地理を研究するために使用でき、ジンクフィンガー配列とP-C-R-R-F-L-Pに基づく分子性解析ツールを適用して、集団内の個体の性別を特定しています。

すべてのマーカーで、髪の毛と肝臓のサンプルから抽出したDNAは、同等のレベルのDNA配列と遺伝子型の品質を示しました。このビデオでは、この非侵襲的なサンプリング法とDNA IQ抽出プロトコルが効果的であり、PCR増幅に十分な品質と量のDNAを生成する適切な量の毛髪が得られることを示しました。全体として、この方法は、研究対象種への影響を最小限に抑えながら、希少またはとらえどころのない小型哺乳類の個体群、遺伝学、行動研究を支援するデータ収集を促進するのに役立つと期待しています。