Name: 培養中枢神経系ニューロンの樹状突起スパイン形態の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 学ぶ 一次培養大脳皮質ニューロンの樹状突起スパイン形態と可動性の解析法。GFPトランスフェクションと薬理学的操作により、シナプス可塑性と神経構造の動態を可視化し、神経疾患におけるシナプス機能異常の理解に貢献します。

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我々は慎重に編集するためのケリージョーンズに感謝。この作品は、NIHの助成金R01MH 071316、アルツハイマー病協会、統合失調症とうつ病に関する研究のための国民の同盟（NARSAD）、および自閉症研究のための国民の同盟（ナー）（PP）によって支えられて、アメリカ心臓協会特別研究員（DPS）、アメリカン心臓協会博士号を取得する前のフェローシップ（KMW）。

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336, 185-186 (1988).</li>
<li>Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kalirin-7+controls+activity-dependent+structural+and+functional+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines.</a> Neuron. 56, 640-656 (2007).</li>
<li>Spear, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+adolescent+development+and+alcohol+use+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Res+Health%22%5BJournal%5D)">Modeling adolescent development and alcohol use in animals.</a> Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).</li>
<li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+ss+activity+modulates+synaptic+signaling+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure.</a> J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).</li>
<li>Srivastava, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enhancement+of+two-step+wiring+plasticity+by+estrogen+and+NMDA+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).</li>
<li>Woolfrey, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epac2+induces+synapse+remodeling+and+depression+and+its+disease-associated+forms+alter+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines.</a> Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-specific+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+composition+by+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity.</a> J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).</li>
<li>Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+spine+structural+plasticity+is+regulated+by+small+GTPase+Rap1+and+its+target+AF-6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6.</a> Neuron. 48, 605-618 (2005).</li>
<li>Jones, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modulation+of+spine+morphology+by+the+5-HT2A+serotonin+receptor+through+kalirin-7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).</li>
<li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2, 910-919 (2005).</li>
<li>Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+spines+and+dendrites+distribute+dye+evenly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Do spines and dendrites distribute dye evenly.</a> Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).</li>
</ol>

この作業の生産はMetaMorph（Molecular Devices社、（株））によってサポートされていました。

技術が樹状突起スパインの形態の詳細な定量分析のために上記の、固定またはライブ一次皮質ニューロンにおける線密度と運動性がneuropathologiesに貢献するかもしれないポストシナプスメカニズムの効果を理解することに重点を置いています。同様のアプローチは、海馬錐体、プルキンエ、または中型有棘ニューロンを含むいずれかの有棘ニューロンのスパイン形態や運動性を、定量化するために使用することができます。 ここで説明するプロトコルは、シナプスのタンパク質及び/または樹状突起棘上薬理学的治療の効果の基本的な性質を調べるために適合させることができます。さらに、受容体にグルタミン酸に足場タンパク質に至るまで内因性シナプスタンパク質の局在の変化を評価するために使用することができます。さらに、それだけでなく、詳細な形態学的固定棘の分析だけでなく、樹状突起棘の運動性に対するシナプスタンパク質または薬理学的治療の効果を測定することができます。これらのタイムラプスイメージング技術も、あるいは同時に樹状突起スパインの形態を調べることなく、タンパク質の人身売買を検討するように変更することができます。 ...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> 18mmの円形のカバーガラス第1.5 </td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> 64〜0714（CS - 18R15） </td><td></td></tr><tr><td> 22ミリメートルの正方形カバーガラス第1.5 </td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> 64〜0721（CS - 22S15） </td><td></td></tr><tr><td>ポリ- D -リジン</td><td>シグマ</td><td> P - 0899 </td><td> MW 70〜150kDaの</td></tr><tr><td> Neurobasalメディア</td><td>インビトロジェン</td><td> 21103049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td>インビトロジェン</td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>インビトロジェン</td><td> 21051024 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15140148 </td><td></td></tr><tr><td> D、L - APV（AP - 5） </td><td>アセントサイエンティフィック</td><td> ASC - 004 </td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン2000 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11668019 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> MediaTech Cellgro </td><td> 25から060 - C 1 </td><td> 1M、pH7の</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液</td><td> EMDケミカルズ</td><td> FX0415 - 5 </td><td> 36％、組織学グレード</td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td> VWR </td><td> 100188-514 </td><td>ジャクソンイムノ研究所</td></tr><tr><td>トリトンX - 100 </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> AC21568 - 2500 </td><td>アクロスオーガニック</td></tr><tr><td>のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗マウスIgG（H + L）は高度に架橋吸着</td><td>インビトロジェン</td><td> - 11029 </td><td></td></tr><tr><td>のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗ウサギIgG（H + L）*高度に架橋吸着* </td><td>インビトロジェン</td><td> - 11034 </td><td></td></tr><tr><td>ゴールド褪色防止試薬を延長</td><td>インビトロジェン</td><td> P36934 </td><td>特別包装</td></tr><tr><td>同封のイメージングステージ室</td><td>ワーナー</td><td> RC - 30HV </td><td></td></tr><tr><td>温度コントローラユニット</td><td>ワーナー</td><td> TC - 344B </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph </td><td>ユニバーサルイメージング</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

培養中枢神経系ニューロンの樹状突起スパイン形態の解析

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

樹状突起スパインは脳内の興奮性の接続の大部分の部位であり、シナプスのシナプス後コンパートメントを形成する。これらの構造は、アクチンに富み、非常に動的であることが示されている。古典的なヘブ可塑性だけでなく、神経調節の信号に応答して、樹状突起は、神経回路と脳内の情報の処理と貯蔵の改良に重要であると考えられる形状と数を、変更することができます。樹状突起棘内で、タンパク質の複雑なネットワークでは、樹状突起スパイン形態と数の制御を可能にアクチンcyctoskeletonと細胞外シグナルにリンクします。神経病理学的研究は、統合失調症から、自閉症スペクトラム障害に至るまで、病気の状態の数は、、異常な樹状突起スパインの形態や数字を表示することが実証されている。また、最近の遺伝学的研究は、これらのタンパク質は、部分的に、これらの疾患の病態の根底にある異常な背骨の可塑性に寄与することが提案につながる、シナプスタンパク質をコードする多数の遺伝子の変異を同定した。樹状突起スパインの形態/数を制御することでこれらのタンパク質の潜在的な役割を研究するために、培養皮質ニューロンの使用は、いくつかの利点があります。まず、このシステムは、固定された細胞の樹状突起の高分解能イメージングだけでなく、生細胞のタイムラプスイメージングが可能になります。第二に、in vitroの系で、これは変異体タンパク質、shRNAコンストラクトによるノックダウン、または薬理学的治療の発現による蛋白質の機能を簡単に操作することができます。これらの技術は、研究者が疾患関連タンパク質の役割を分析すると、これらのタンパク質の変異が生体内で機能することができるかを予測し始めることができます。

数々の最近の研究では、脳の病理学に関連したシナプス蛋白の変異を同定した。初代培養皮質ニューロンは樹状突起スパイン形態と運動性にこれらの疾患関連タンパク質の影響を調べることで最大限の柔軟性を提供します。

樹状突起スパインは、脳内における興奮性接続の大部分を担う部位であり、シナプスのポストシナプス側（後シナプス側）のコンパートメントを形成しています。これらは...

本実験の全体的な目的は、さまざまな分子生物学的および薬理学的操作が樹状突起スパインの形態と動態に及ぼす影響を評価することです。これは、GFPを発現させた初代培養皮質ニューロンを用い、必要に応じてDNAプラスミドを外来的に発現させることで、ニューロンの形態を可視化し、内因性タンパク質の発現および機能を操作することで達成されます。第2のステップとして、細胞に薬理学的処理を施し、その後、免疫染色のために固定するか、タイムラプスイメージングのための準備を行います。その後、薬理学的処理を行うことで、樹状突起スパインの可視化、および誘導された樹状突起スパインの形態と運動性の変化の観察が可能になります。次に、共焦点顕微鏡を用いて、固定細胞のZスタック画像、または特定のタイムポイントで撮影した生細胞の画像を取得します。樹状突起スパイン形態の詳細な測定は、Zスタック画像の2D投影図から行うことができます。得られた結果は、樹状突起スパインの形状または運動性の定量的な形態解析に基づき、分子レベルまたは薬理学的な操作が樹状突起スパインの形態や運動性に及ぼす影響を示しています。この手法は、「シナプス可塑性はどのように調節されているか」、「興奮性シナプスはどのように発達するか」といった、神経科学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。シナプスはどのように維持され、あるいは除去されるのでしょうか。神経伝達物質や遺伝子などの分子は、どのようにシナプス構造を調節しているのでしょうか。本手法は、シナプス調節の根底にある基本メカニズムに関する知見を提供するだけでなく、自閉症、統合失調症、アルツハイマー病などの多くの精神疾患や神経疾患の特徴であるシナプス構造の変化に関与する、疾患関連遺伝子の寄与を調査することにも応用可能です。まず、DMEMのpHを10 millimolarの滅菌HEPESで調整し、H-D-M-E-Mを調製します。これを37 °Cに温めます。次に、細胞を播種した18 mmのカバーガラスを、37 °Cに予熱した抗生物質フリーの培地600 µLに移します。細胞を37°Cでインキュベートし、5%二酸化炭素を供給して30分間静置します。各カバースリップについて、指定量のDNAを50 µLのH-D-M-E-Mに加え、5分間静置します。次に、4 µLのlipo 2000を別の50 µLのH-D-M-E-Mに加え、同様に5分間静置します。2本のチューブを十分に混ぜ合わせ、5% carbon dioxideを補充した37 degree Celsiusの加湿インキュベーター内で少なくとも20分間保持します。次に、この混合液を細胞に滴下します。同じ条件下でさらに4時間細胞をインキュベートし、あらかじめ調製したフィーディング培地300 microlitersを、37 degrees Celsiusに温

analysis-of-dendritic-spine-morphology-in-cultured-cns-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典:Pekarek, B. T., et.al., CLARITY Tissue Clearingによる無傷のニューロン樹状突起のイメージングと定量化。J. Vis. Exp.

透明化マウス脳における無傷の樹状突起アーバーとスパイン形態の共焦点顕微鏡イメージング

出典: Gouder, et. al.ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量化J. Vis. 経験。(2015)。このビデオでは、共焦点顕微鏡を使用した形質導入された免疫標識錐体ニューロンにおける樹状突起棘のイメージングと分析を示します。バックグラウンドノイズが低減され、樹状突起の直径と長さを推定することで樹状突起がトレースされます。自動スパインセグメンテーションには、樹状突起とスパインの寸法のパラメータの設定とスパインの分類が含まれます。3D...

共焦点顕微鏡イメージングを用いた樹状突起棘の定量化

この記事では、構造化照明顕微鏡（SIM）を使用してインビトロで海馬ニューロンからイメージ樹状突起棘にワーキングプロトコルについて説明します。 SIMを使用して超解像顕微鏡法は、改善されたディテール個体樹状突起棘の画像化を可能にする、有意にすべての3つの空間次元における光の回折限界を超えて画像解像度を提供する。...

構造化照明顕微鏡を用いてラット初代海馬ニューロンの樹状突起棘を画像化

私たちは、マウスモデルの海馬における樹状突起形成の可視化と定量化のための2つの方法、すなわちリアルタイムイメージングと拡張被写界深度イメージングについて説明します。前者の手法では、高度な地形トレースや分岐範囲の定量化が可能になるのに対し、後者では樹状突起樹のスピーディーな可視化が可能です。...

マウスの海馬領域の歯状回における樹状樹枝状分岐の評価

錐体ニューロンの樹状突起棘は、哺乳類の脳皮質の中で最も興奮性シナプスのサイトです。この方法は、人工多能性幹細胞由来のヒト皮質錐体グルタミン酸作動性ニューロンにおける脊椎形態の3次元定量分析を記載します。...

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

ここでは、Golgi-Coxプロトコルを詳細に紹介します。この信頼性の高い組織染色法は、最小のトラブルシューティングで、海馬の脳構造の全面的な評価を可能にします。...

Golgi-Cox法を用いた老齢マウスにおける海馬の樹状突起の複雑さの評価

神経化学的および行動異常の根本にある可能性のあるニューロンおよび樹状脊椎の形態変化の可能性を評価するために重要な錐体ニューロンを標識し、分析するプロトコルを提示する。...

脳スライスと一次細胞培養における錐体ニューロンの弾道標識

樹状突起棘は神経系の重要な細胞の特徴です。ここでは、 C.

カエノラブディティス・エレガンスにおける樹状突起棘のイメージング

プロトコルは、ラットの海馬および内側前頭前野のニューロンを染色するための、神経系の任意の部分に適合させることができる迅速ゴルジ法の改変を記載している。...

海馬および前頭前野における樹状突起脊椎の可視化のための迅速なゴルジ染色

樹状突起棘は、ほとんどの興奮性シナプスのシナプス後コンパートメントです。樹状突起スパインの形態の変化は、神経発達、老化、学習、および多くの神経学的および精神医学的障害の間に起こり、信頼性の高い樹状突起スパイン解析の重要性が強調されています。このプロトコルでは、自動 3 次元ニューロン再構成ソフトウェアを使用して、樹状突起スパインの形態を正確かつ再現性よく定量化する方法について説明します。...

自動三次元ニューロン再構成ソフトウェアによる樹状突起スパインの定量化

学ぶ 一次培養大脳皮質ニューロンの樹状突起スパイン形態と可動性の解析法。GFPトランスフェクションと薬理学的操作により、シナプス可塑性と神経構造の動態を可視化し、神経疾患におけるシナプス機能異常の理解に貢献します。

培養中枢神経系ニューロンの樹状突起スパイン形態の解析

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