Name: 全体のマウント上皮内ハイブリダイゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: 学ぶ マウス胚の全体マウントin situハイブリダイゼーション法で遺伝子発現パターンを可視化する技術。E8.5-E11.5期のマウス胚を用いて、発生生物学における遺伝子機能を解明する再現性の高いプロトコルを提供します。

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この作品は、NIHの助成R21MH082360（BGC）とR01HD056315（NRM）と同様にジョージア大学によってサポートされていました。

<ol><li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues%3A+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li>
<li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li>
<li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li>
<li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pax%5Bzf-a%5D%3A+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis%2FTWis+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li>
<li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li>
<li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li>
<li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo%3A+gene+expression+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li>
<li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li>
<li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis%2C+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li>
<li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

このプロトコルで説明する方法は、さまざまなソースから適応し、ホールマウントE8.5-E11.5日齢のマウスの胚に最適化されています。脊椎動物の胚のin situハイブリダイゼーションホールマウントするための方法は、まず、1990年代初頭2,5-12で登場しました。このプロトコルは、主にアフリカツメガエル胚7,8と同様にマウス2,11のために開発された方法から脚色したものです。我々のプロトコルに重点の大部分はプローブの慎重な品質評価に配置されます。高品質を生成し、このプロトコルでは最古のステップによって決定高比活性RNAプローブが大幅にデータの質を向上させ、長期的には時間と労力のかなりの量を節約するには十分注意。我々のプロトコルはまた、ファージRNAポリメラーゼ転写のためのPCR生成されたDNAテンプレートの使用を含む。このアプローチでは、迅速かつ非常にスケーラブルです。それは、RNAプローブfoの多数の生成を有効にすることができますin situハイブリダイゼーション画面13から15 のr...

<table border="1"><tbody><tr><th>名前</th><th>タイプ</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>注釈</th></tr><tr><td>ジゴキシゲニン-11-ウリジン-5&#39;-三リン酸</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 11209256910 </td><td></td></tr><tr><td>リボヌクレオシド三リン酸セット</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 11277057001 </td><td></td></tr><tr><td>放射性標識RNA精製用のクイックスピンカラム</td><td>供給</td><td>ロッシュ</td><td> 11274015001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNAポリメラーゼ</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNAポリメラーゼ</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 10810274001 </td><td></td></tr><tr><td> T3 RNAポリメラーゼ</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> CTPは、[α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml、250μCiの</td><td>試薬</td><td>パーキンエルマー</td><td> BLU008X250UC </td><td></td></tr><tr><td> DNase Iを換え、RNaseフリー</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 4716728001 </td><td></td></tr><tr><td>尿素、無色から白色の結晶又は結晶性の粉末</td><td>試薬</td><td>フィッシャー</td><td> BP169-500 </td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディングバッファー</td><td>試薬</td><td>アンビオン</td><td> AM8547 </td><td></td></tr><tr><td>ハイボンド-N +、アマシャム</td><td>供給</td><td> GEヘルスケア</td><td> RPN82B </td><td></td></tr><tr><td>紫外線Stratalinker 2400 </td><td>機器</td><td>ストラタジーン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピロ炭酸ジエチル</td><td>試薬</td><td>シグマ</td><td> D5758-100ML </td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム</td><tD&gt;試薬</td><td>アクロス</td><td> 41121-0010 </td><td></td></tr><tr><td>水中での過酸化水素30パーセント</td><td>試薬</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP2633-500 </td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド、8％のEMグレード</td><td>試薬</td><td>ポリサイエンス</td><td> 0/710 </td><td>製造者の指示に従って、注意して使用すること</td></tr><tr><td>ブロッキング試薬</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 11096176001 </td><td> -20℃で、5％の株式と店に確認します</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK </td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 3115852001 </td><td></td></tr><tr><td> RNアーゼ</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 10109142001 </td><td>作るとして-20℃で10 mg / mlの株式や店舗</td></tr><tr><td>リボヌクレアーゼT1 </td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 10109193001 </td><td></td></tr><tr><td> ULtrapureホルムアミド</td><td>試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td>塩酸レバミゾール</td><td>試薬</td><td> ICNバイオメディカル。株式会社</td><td> 155228 </td><td></td></tr><tr><td>トルラ酵母からリボ核酸、タイプVI </td><td>試薬</td><td>シグマ</td><td> R6625 </td><td>フェノール/クロロホルムを数回抽出し、沈殿させ、DEPC-dH2Oに再懸濁し、-20℃で保存</td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン-AP Fab断片</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 11093274910 </td><td></td></tr><tr><td> BMパープルAP基質、沈殿させる。すぐに使用できるソリューションを提供します。 </td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 11 44​​2 074 001 </td><td></td></tr><tr><td> 4mLの、クリア、クローズドトップ、ストレージバイアルコンビニエンスキット</td><td>供給</td><td>国立科学</td><td> B7800-2 </td><td></td></tr><tr&gt; <td>シェイクN焼くハイブリダイゼーションオーブン</td><td>機器</td><td> Boekel科学</td><td> 136400 </td><td></td></tr><tr><td>検確かテック</td><td>供給</td><td> Fisherbrand </td><td> 15から200-402C </td><td></td></tr><tr><td> Paraplastプラス組織包埋媒質</td><td>試薬</td><td> Fisherbrand </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td>ピールウェイ使い捨てプラスチック組織埋め込み型</td><td>供給</td><td>ポリサイエンス</td><td> 18646A </td><td></td></tr><tr><td> Colorfrostプラス顕微鏡スライド</td><td>供給</td><td> Fisherbrand </td><td> 12-550-17 </td><td></td></tr><tr><td>核ファーストレッド</td><td>試薬</td><td>シグマ</td><td> N8002 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td>試薬</td><td>リチャード·アラン·サイエンティフィック</td><td> 8310から16 </td><td></td></tr></tbody></table>

全体のマウント<em&gt;上皮内</eme11.5マウス胚へのe8.5&gt;ハイブリダイゼーション

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

in situハイブリダイゼーションホールマウントは、胚における遺伝子発現パターンを定義するための非常に有益なアプローチである。 in situハイブリダイゼーションの手順で 、長く技術的に一括して最終結果の質の向上に寄与する複数の重要なステップで求められています。 このプロトコルを詳細にプローブのラベリングとパフォーマンスを最適化するためのいくつかの重要な品質管理手順を説明します。全体的に、我々のプロトコルは、詳細な説明を提供しています再現性よく高品質な結果を得るために必要な重要なステップの。まず、PCRによって生成されたDNA鋳型のインビトロ転写を介して、ジゴキシゲニン（DIG）標識RNAプローブの生成を説明します。我々は、量、整合性とDIG標識プローブの比活性を決定するために、3つの重要な品質管理検定法を説明します。これらの手順では、全体のマウス胚における内因性mRNAを検出するために十分な感度のプローブを生成するために重要である。加えて、我々はin situハイブリダイゼーションのためのE8.5-E11.5日齢のマウス胚の固定とストレージのための方法について説明します。そこで我々は、非特異的なプローブハイブリダイゼーションを削除するには、ハイブリダイゼーション条件、ハイブリダイゼーション後の洗浄とRNase処理の詳細は、続いて再水和された胚の限られたプロテイナーゼK消化のための詳細な方法について説明します。 AP標識抗体が標識されたプローブを可視化し、内因性の転写産物の発現パターンを明らかにするために使用されます。代表的な結果は、成功した実験と典型的な次善の実験から示されています。

この全体のマウント<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションプロトコルは、E8.5、E11.5日齢のマウス胚において遺伝子発現研究のための再現性の高品質な結果を確保するための重要なステップを説明します。

全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

ホールマウントin situハイブリダイゼーションは、胚における遺伝子発現パターンを定義するための非常に有用な手法です。in situハイブリダイゼーションの手順は……

本手順の全体的な目的は、マウス胚全体における遺伝子発現パターンを定義することです。まず、目的遺伝子に対する特異的なリボプローブを設計および作製します。次に、胚を回収し、ハイブリダイゼーション処理を行います。次に、標識したプローブを胚にハイブリダイゼーションさせます。最終ステップとして、免疫組織化学的検出によりハイブリダイズしたプローブを可視化します。これにより、最終的に、胚全体または胚切片における遺伝子発現パターンを示す結果を得ることができます。ステレオ解剖顕微鏡または通常の明視野顕微鏡で観察した後、一般的に、この手法に不慣れな方は、in situ ハイブリダイゼーションの手順が長く技術的に要求されるため、苦労することがあります。最終的な結果の品質を決定づける重要なステップが複数存在します。まず、5'末端にファージ転写プロモーター配列を設計した遺伝子特異的PCRプライマーを用いて、目的の配列を増幅し、テンプレートDNAを作成します。次に、PCR産物を精製し、記載されたプロトコルに従ってプロテアーゼKによる消化ステップを行います。次に、in vitro 転写反応をセットアップし、インキュベーターで最適温度にて2時間反応させます。DNAテンプレートが消化された後、カラム精製を用いてリボプローブを精製し、NanoDropまたはマイクロプレート吸収読取装置を用いてプローブの収量を推定します。その後、推定収量に基づき、プローブ濃度を100 nanograms per microliterに調整します。次に、記載のプロトコルに従って変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、またRIBAプローブの比活性を測定して、プローブの品質を確認します。良好なプローブであれば、ゲル上でスマアリングが最小限に抑えられた単一の明瞭なバンドが検出されます。比活性を測定するには、リボプローブを連続希釈し、10⁻²から10⁻⁵までの希釈系列を用意します。その後、各希釈液1 µLを、コントロールとしてラベルなしDNAサンプル1 µLと共に、直径82 mmのHigh Bond nylon+膜にピペットで分注します。分注後、直ちにUVクロスリンカーを用いて125 mJでフィルターを架橋します。1%ブロッキング試薬を含む1×TNバッファーを10 milliliters加え、室温で30分間インキュベートします。ブロッキング完了後、ブロッキング溶液を除去し、1×TNバッファー10 millilitersを用いて室温で15分間、メンブレンを洗浄します。洗浄後、1×TNバッファー10 millilitersを用いて、FAB断片化抗doxygenを1:5,000に希釈して調製します。メンブレンをこの溶液中で30分間インキュベートします。インキュベート後、1×TNバッファー10 mLで、15分間の洗浄を2回行いま

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このビデオでは、in situハイブリダイゼーション2色全体のマウント、2つの異なる遺伝子の空間的および時間的発現パターンは、若いニワトリ胚で可視化することができる方法を示しています。このメソッドは当​​初、Davidウィルキンソン、ドミンゴスエンリケ、フィルインガムとデビッドイシュ-...

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

我々はマウス胚組織における組織特異的遺伝子発現の開始中または後に組織特異的遺伝子に要因の相互作用を識別するために、クロマチン免疫沈降（ChIP）法を示しています。それは正常な胚発生時に発生するとして、このプロトコルは、組織特異的遺伝子の活性化の研究に広く適用可能であるべきである。...

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古典的には、マウス胚性弁原基の心内膜は、横切片、冠状切片、または矢状切片を用いて分析されてきた。弁形成領域の心内膜の...

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変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

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