軸索損傷後の脊髄後根神経節の組織からのクロマチン免疫沈降

この手順の全体的な目標は、神経損傷後の後根神経節組織からの複合体である架橋タンパク質DNAを免疫沈殿させることです。これは、最初に坐骨神経痛または背柱の損傷を誘発することによって達成されます。2番目のステップは、サンプルを架橋し、タンパク質DNA複合体を可溶化することです。

手順の3番目のステップは、特定のタンパク質DNA複合体を免疫沈殿させることです。最後に、DNAを精製して回収します。最終的には、タンパク質またはDNAヒストン修飾に関連するDNA断片の濃縮を示す結果を得ることができます。

この方法は、軸索再生の促進に重要な遺伝子の制御にどのDNA結合部位、転写因子、ヒストン修飾が必要かなど、ロナルリジェネレーション分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。まず、麻酔をかけた動物を手術台に置きます。進行する前に、ノーズコーンを介した連続的なイソフルラン酸素投与を通じて、手術中ずっと麻酔を維持します。

坐骨神経損傷のつま先つまみ反射で正しい麻酔の深さを確認します。後肢を丁寧に剃り、脱毛剤で残った毛を取り除きます。髪の毛を取り除いたら、アルコールを繰り返し塗布し、続いてベタジンを塗布して皮膚をきれいにします。

大腿骨の後部と平行に皮膚を4ミリメートル切開します。太ももの真ん中で、細い鉗子を使用して筋肉を広げ、その下の白い坐骨神経を露出させます。分離された神経は、偽の外科的制御として機能するために切断せずに残すか、損傷を誘発するために切断することができます。

最後に、皮膚を引っ張って、背柱損傷用の2つの縫合糸クリップで閉じます。後ろから髪の毛を取り除き、前に示したように切開部位をきれいにします。脊髄の約T 7からT 13まで、脊髄の上で2.5センチメートルの切開を行います。

細い鉗子を使用して、脂肪を分離しながら皮膚を保持します。次に、表面の脂肪を2つのフックで固定します。脂肪が引き戻されたら、6番目と7番目の椎骨の間のスペースに血管を配置して、基準点として使用します。

筋肉を8番目と10番目の椎骨で両側に切り、2つのフックを挿入して開いたままにします。小さなハサミを使用して、棘突起を保持しているT8からT10のラミネート上の筋肉を取り除きます。T 10 で両側の接続骨を切断して椎弓切除術を行います。

椎骨の上半分を慎重に持ち上げて離し、その下の脊髄を露出させます。2%キシロカインを数滴塗布して脊髄を麻酔し、硬膜を切除します。脊髄に触れないように注意してください。

この時点で停止すると、背柱を損傷するための偽の外科的制御が提供されます。脊髄を横切って0.3〜0.4ミリメートルの深さの切り込みを入れます。最後に、筋肉を縫合して閉じ、表在脂肪を放出します。

皮膚を引っ張り、縫合糸クリップで閉じます。動物をホームケージに戻し、完全に回復するまで監視します。損傷の48時間後、動物を安楽死させ、L 4およびL 5の後根神経節またはDRGを採取します。

最初のステップは、腹側脊柱を露出させることです。次に、椎骨の腹側半分をT12からL6まで取り除きます。脊髄を露出させるには、脊椎と脊髄の側面の間の空間にあるDRGを特定します。

細い鉗子を使用して、L4とL5DRGをわずかに持ち上げてつかみます。DRG本体にできるだけ近づけてカットします。4匹の動物から合計16個のDRGを集め、氷のように冷たいHBSSに入れます。

DRGを短時間遠心分離し、500マイクロリットルの1%ホルムアルデヒドを加え、サンプルを30分間インキュベートします。摂氏37度で、125ミリモルのグリシンを加えて固定を停止し、室温で5分間インキュベートします。短時間の遠心分離後、バッファーを吸引し、500マイクロリットルの氷冷PBSとプロテアーゼ阻害剤カクテルで組織を2回洗浄します。

次に、PBSを吸引し、400マイクロリットルのSDS溶解を加え、緩衝し、マイクロ乳棒の約30ストロークで組織を破壊します。次に、クロマチンを70%出力で8つの10秒パルスで超音波処理します。サンプルを分析して、DNAが約200〜1000塩基対の長さに断片化することを確認することをお勧めします。

せん断したクロマチンサンプルを新しいチューブに均等に分割します。実施する免疫沈降反応ごとに、チップバッファーとプロテアーゼ阻害剤カクテルを使用して、各チューブの容量を最大500マイクロリットルにします。次に、希釈したサンプルを5マイクロリットル取り出し、新しいチューブに移します。

これは1%の入力サンプルであり、必要になるまで摂氏マイナス20度で保存されます。あとで。各チューブに抗体または正常なIgGコントロールを添加し、摂氏4度で一晩回転させてインキュベートします。翌日。

30マイクロリットルのプロテインG磁気ビーズを添加し、回転しながら摂氏4度で2時間インキュベートすることにより、複合体を免疫沈殿させます。次に、チューブを磁気ラックに置き、結合したクロマチンビーズ複合体を引き下げます。溶液が透明な場合は、上清を慎重に取り除き、ビーズを1ミリリットルの低塩緩衝液で3回洗浄し、洗浄ごとに摂氏4度で3〜5分間インキュベートします。

次に、1ミリリットルの高塩緩衝液で1回洗浄します。この時点で、マイナス20°Cから1%インプットサンプルを取り出し、150マイクロリットルのチップ溶出バッファーを追加します。チューブを室温で脇に置いて、後で使用します。

IPサンプルに戻り、各チューブに150マイクロリットルの1xチップ溶出バッファーを追加します。サンプルを摂氏65度で30分間インキュベートし、穏やかなボルテックスでビーズからクロマチンを溶出します。マグネティックラック上のビーズを引き下げ、溶出クロマチンを新しいチューブに慎重に移し、インプットサンプルを含むすべてのチューブに移します。

プロテアーゼKの反応ごとに200ミリモルの塩化ナトリウムと40マイクログラムを加え、インキュベーション後2時間摂氏65度でインキュベートし、ここでさらに分析するための標準的な手順を使用してDNAを回収します。坐骨神経病変後のDRG組織からの半定量的PCR結果が示されています。レーン 1 と 2 は、インプットサンプルからの PCR シグナルを示しています。

レーン4のPCRシグナルは、アセチル化P 53が坐骨神経の損傷後にのみギャップ43近位プロモーター領域に結合することを示しています。レーン3で見られるように動物が偽の損傷を受けた場合、およびレーン5および6で示される正常なIgG血清を使用した場合、PCRシグナルは存在しません。同じDRG組織からのコントロールPCRは、アセチル化P53がギャップ43遺伝子の3プライム非翻訳領域に位置するDNAのコントロール領域に結合しないことを示している。

この手順を試行する際には、成功のための3つの重要なステップを覚えておくことが重要です。十分な量の組織から始めて、DNAタンパク質複合体の効率的な断片化と可溶化を確保し、目的のタンパク質に適した免疫沈降抗体を選択してください。