Name: ポリオウイルスの同定のための粒子凝集法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学ぶポリオウイルス同定の粒子凝集法。キメラ分子被覆ゼラチン粒子を用い、単一ステップで迅速にウイルスを検出する。従来法より簡便で解釈が容易なウイルス学診断技術である。

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私たちは、彼女の優秀な技術支援のための純子和田に感謝しています。私たちは親切PVR - IgG2aのためのバキュロウイルス発現ベクターを提供するための教授昭夫野本に感謝しています。この研究は、補助金ポリオ撲滅の推進と、厚生労働省からの新興再興感染症に関する研究によって部分的にサポートされていました。

1。維持培地（MM）と増殖培地（GM）の調製 MMとGMの調製のために、1のポリオ実験室のマニュアルを参照してください。ウシ胎児血清（FCS）および10％FCS 2％添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）はそれぞれ、MMとGMの代替として使用することができる。 2。抗PVの抗体の調製<ol><li>抗PVの抗体（タイプ1、2、または3）の各バイアルに水（バイアルあたり0.5 mL）を追加することによって再構成する抗PVの抗体（RIVM PVタイピング抗血清）。別のラベルの付いたチューブでMMの4.5 mLにこの再構成された抗体溶液（0.5 mLをそれぞれ）を追加します。 注：抗PVの抗体の一部ロットが再構成されたフォーム（バイアルあたり0.5mLの）として提供されています。抗PVの抗体のような多くの場合は、再構成のための水の添加は必要ありません。 </li><li>再構成された抗- PVの抗体の等量を混ぜる。抗PV1 +2、2 +3、または3 +1の場合：各再構成された抗体のミックス1.8mlの（それぞれの混合物1.8 mLを+ 1.8 mLの= 3.6 mL）を。各再構成された抗体のミックス1.2 mlの（1.2 mLを+ 1.2 mLの+ 1.2 mLの= 3.6 mL）中：抗- PV1 +2 +3のため。 注：PVサンプルPVの異なる血清型の混合物を含む可能性。 PVの混合物と試料中のPVの、単一の血清型を識別するには、抗PVの抗体（すなわち1 +2、2 +3、3 +1、1 +2 +3）のプールが必要です。 </li><li>各抗PV（1 +2、2 +3、3 +1、または1 +2 +3）抗体（3.6 mLを各）（最後の18.2パーセントFCS）にFCS（0.72 mL）を1 / 5ボリュームを追加します。 注：FCSの添加は、抗体によって引き起こされるゼラチン粒子の非特異的凝集の減少のためです。 </li><li> -20℃でPAのアッセイで使用するまで抗体のプールを保持します。 </li></ol> 3。感作ゼラチン粒子の再構成<ol><li>感作ゼラチン粒子1バイアル（凍結乾燥粉末として提供される）にキットに含まれている再構成バッファーを1.5 mLを加え。 </li><li>穏やかなタッピングでよく混ぜる</li><li> 4で再構成された感作粒子℃を保つ再構成されたゼラチン粒子は、少なくとも2週間は4℃に保ち、しかしちょうどアッセイ前に準備する必要がアクティブである可能性があります。 </li></ol>重要な注意： 感作ゼラチン粒子の非凝集のイメージは粒子の多くによって異なる可能性があるため、感作ゼラチン粒子の異なるロットを混ぜて使用しないでください。各実験では、感作ゼラチン粒子の単一の多くを使用する必要があります。 4。 PV識別のためのPAアッセイ<ol><li>マイクロ滴定プレートを準備します。 1つのウイルスのサンプルを識別するために、我々は5ウェルを必要とする+少なくとも一つのネガティブコントロール（下のウイルスと抗体なし感作粒子、よく＃6。例ではウイルスと抗体のコントロールを参照しない）。井戸の総数は、アッセイで5 ×サンプル+少なくとも1つのコントロールです。 重要な注意： アッセイ内の少なくとも1つはウイルスと抗体の制御を取らないしてください。感作粒子の1バイアルは10ウイルスサンプルの識別のために約です。 </li><li>マイクロ滴定プレートに抗PV抗体またはGMの12μL/ウェルを追加。プレートの配置は、（また、下記の実施例を参照）、次のとおりです。抗体なしのサンプル（よく＃1と6）で、GMの代わりに抗PVの抗体12μLを加える。 重要な注意： 多くのPVのサンプルはこのアッセイで試験する必要がある場合は、マルチチャンネルピペットまたはディスペンサーには、このステップの参考になる。 <table border="1"><tbody><tr><td>よく第1位</td><td>よく第2位</td><td>よく第3位</td><td>よく、第1位</td><td>よく＃5 </td><td>よく＃6 </td></tr><tr><td> GM </td><td>抗P1 +2 +3 </td><td>抗P1 2 </td><td>抗P2 3 </td><td> ANI - P1 +3 </td><td> GM </td></tr></tbody></table></li><li> 12μL/ウェルのウイルスのサンプルを追加。ウイルスのない一つのサンプル（よく＃6）で、12 GMのμLの代わりにウイルスのソリューションを追加します。 注：ウイルスのサンプルは通常、感染した細胞、L20B細胞またはRD細胞の培養上清である。 重要な注意： 多くのPVのサンプルはこのアッセイで試験する必要がある場合は、マルチチャンネルピペットは、このステップの参考になる。 <table border="1"><tbody><tr><td>よく第1位</td><td>よく第2位</td><td>よく第3位</td><td>よく、第1位</td><td>よく＃5 </td><td>よく＃6 </td></tr><tr><td>ウイルスのサンプル</td><td>ウイルスのサンプル</td><td>ウイルスのサンプル</td><td>ウイルスのサンプル</td><td>ウイルスのサンプル</td><td> GM </td></tr></tbody></table></li><li>室温に4℃から再構成された感作粒子溶液を取り、優しく完全に粒子を一時停止する]をタップします。 重要な注意： 穏やかなタッピングによる粒子の完全な停止の後、粒子は懸濁粒子析出する前にプレートに直ちに追加する必要があります。TEとフォームの非均質な溶液。 </li><li>すべてのウェルに感作された粒子の25μL/ウェルを追加。 重要な注意： 感作粒子の添加後、プレートはすぐにサンプルの均一な反応を開始するために混合プレートに供されてください。従って、感作粒子の添加は、プレート内のサンプルの間でタイムラグを最小限に抑えるためにディスペンサーを使用して実行する必要があります。 </li><li>プレートミキサーの上にマイクロ滴定プレートを入れ、30秒間プレートを混ぜる。 </li><li> 2時間室温でテーブルの上に白い紙の上にマイクロ滴定プレート（目視観察の便宜のために）（15〜30 ° C）を入れて 重要な注意： 結果の観察と撮影の写真のための反応の間と後の板を移動しないでください。形成された凝集が安定していないと簡単にプレートを移動することによって乱さ。 </li><li>プレートの写真を撮る。 重要な注意： 写真の部分的なビューは、後で調べると解釈の結果のレビューのための十分なデータを与えることができなかった。いくつかの写真は、井戸の凝集像を中心にプレートの全ウェルをカバーするために注意が必要です。 </li></ol> 5。結果の解釈<ol><li>正と負の井戸の識別。ウイルスと抗体のコントロールなしのそれ（ゼラチン粒子の析出、非凝集）（図1および2）で試料中の凝集反応を比較する。はっきりしないウイルスと、抗体のコントロール（非凝集、ネガティブコントロール）と区別されている凝集のイメージはポジティブとして判断されるべきである、とネガティブコントロールに似ている凝集のイメージがネガティブと判断されるべきである。明確なだけ部分的な凝集反応を示すサンプルは、"正（部分凝集）"として肯定的な、しかしレコードとして判断することができます。 </li><li> PVの同定。 PVの血清型を識別するために、抗PV抗体を用いた正と負の井戸に基づいて結果を解釈する。結果の解釈の原理は、細胞培養系における中和試験（例えば、正の抗P1 2抗体のサンプルは、タイプ3のPVが含まれていることを示す）のそれと似ています。 </li></ol> 6。代表的な結果 PAアッセイPV識別の代表的な結果を図1に示されています。全てのPVの株は感作ゼラチン粒子（なし抗体サンプル）の凝集を形成する。対応する抗PVの抗体の存在下では、ウイルスおよびno抗体の制御なしに似てゼラチン粒子（非凝集）（ネガティブコントロール）の沈殿が観察された（例えば、PV1（セービン）抗P1 +2の存在下でまたは抗P3 1抗体）。 <img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 PV1（セービン）のPAアッセイによるPVの識別。ウイルスソリューション、PV2（セービン）、及びPV3（セービン）（1.2 × 10 8 CCID 12分の50μL、8.2 × 10 7 CCID 12分の50μLのウイルス力価、およびそれぞれ3.5 × 10 7 CCID 12分の50μLは、）PAのアッセイにより同定のために使用されていました。いいえウイルスとしない抗体のコントロールは、ゼラチン粒子（非凝集、ネガティブコントロール）の析出は認められなかった。 <img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。正と負の井戸の解釈。PV1（セービン）のウイルスソリューション、PV2（セービン）、及びPV3（セービン）（2.4 × 10 8 CCID 25分の50μLのウイルス力価、1.7 × 10 8 CCID 25分の50μL、および7.3 × 10 7 CCID 25分の50μL、それぞれ）320分の1〜1 / 20希釈し、そしてその後、希釈した試料25μLを抗PV抗体なしでPAアッセイにより調べた。

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Polio+Laboratory+Manual+%284th+edition%29+WHO%2FIVB%2F04.10%22">Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10</a>. , 4th Edition, World Health Organization. (2004).</li>
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<li>Kilpatrick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+group-%2C+serotype-%2C+and+vaccine+strain-specific+identification+of+poliovirus+isolates+by+real-time+reverse+transcription-PCR+using+degenerate+primers+and+probes+containing+deoxyinosine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).</li>
</ol>

総司増島は、新製品設計部、富士レビオ株式会社の従業員です。

このPAアッセイのユニークな点はPV 2の検出のための抗PVの抗体の代わりに、PVRの分子の使用率です。これはPV 3-6のすべての3つの血清型に均一な親和性でPV感作ゼラチン粒子の特異的相互作用が可能になります。 PVRの単量体の形態は、ビリオン上の単一の結合部位（〜-8 M、10 -7の解離定数）7、にのみ中等度の親和性を有するので、私たちは、ゼラチン粒子の感作のためにPVRのイムノアドヘシンフォーム（PVR - IgG2aを）使用8、そして成功したPVの分離株で感作ゼラチン粒子の特異的な凝集を観察した。高い特異性と感作粒子の均一な親和性で、PAのアッセイにおけるPVの同定の重要な要因は、ウイルス力価（PA抗体法による太陽光発電の有効な検出のため）と2）の凝集の解釈は（PVの正しい識別用）、1） 。 一般的に、PVの力価は、細胞培養系での分離ウイルスは、10 6〜8 CCID 50分の50μLの範囲である。タイプ1、2、3 P...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>感、ゼラチン粒子</td><td>富士レビオ株式会社</td><td></td><td>テストキット</td></tr><tr><td>再構成バッファ</td><td>富士レビオ株式会社</td><td></td><td>テストキット</td></tr><tr><td>マイクロタイタープレート</td><td>富士レビオ株式会社</td><td></td><td>テストキット</td></tr><tr><td>抗PV抗体</td><td> RIVM </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ポリオウイルスの同定のための粒子凝集法

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

世界ポリオ撲滅イニシアティブでは、実験室診断は、急性弛緩性麻痺（AFP）症例の便検体からPVを分離し、識別することによって、重要な役割を果たしている。世界保健機関（WHO）に、世界ポリオ研究所ネットワーク、PV分離と同定は、現在、それぞれ細胞培養系およびリアルタイムRT - PCRを使用して実行されている。 PVのポスト撲滅の時代には、簡単かつ迅速な識別手順は、国立研究所でポリオ症例の迅速な確認のために有用であろう。本研究では、我々は、PVの識別のために開発した斬新なPAアッセイの手順が表示されます。このPAのアッセイは、PV受容体（PVR）分子とPVのすべての血清型に特異的かつ均一な親和性であるビリオンの相互作用を利用しています。手順は簡単です（反応プレート内の1つのステップの手順）と急速に（結果は反応の2時間以内に得ることができます）、および結果が視覚的に（ゼラチン粒子凝集反応の観察）観察される。

ウイルスの受容体分子を利用して、最近開発された新たな粒子の凝集反応（PA）アッセイは、ポリオウイルス（PV）の迅速かつ容易に識別することができました。この記事では、PVの識別のためのPAのアッセイのための手順が表示されます。

世界ポリオ撲滅計画において，臨床検査診断は，急性弛緩性麻痺（AFP）患者の便検体からポリオウイルス（PV）を分離し，同定することで極めて重要な役割を担っています。

本手順の全体的な目的は、簡便なプロトコルを用いてポリオウイルス分離株を迅速に特定することです。このアッセイでは、ヒトポリオウイルス受容体の細胞外ドメインとIgG 2 fcを結合させたキメラ分子でコーティングした感作ゼラチン粒子を使用します。これらの粒子は、ポリオウイルス分離株のすべての血清型に対して均一な親和性を持つため、ヒトポリオウイルスを含むサンプルとインキュベートすると粒子の凝集が起こります。しかしながら、サンプルから分離された特定のウイルスを認識できる抗体が存在する場合、中和が起こり凝集が妨げられます。この実験系を用いることで、ポリオウイルスの分離株を一段階の反応で迅速に同定することが可能です。従来の中和試験などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、手順と判定が非常に簡便であることであり、労力の削減と迅速化を図り、結果を得るまでの時間を短縮することを目的としています。anti PV one、PV two、およびPV three抗体を復元するには、各バイアルに0.5 millilitersの水を加えます。次に、各抗体溶液を、4.5 millilitersの維持培地を含む別々のチューブに分注します。抗PV抗体の中には、あらかじめ復元された状態で提供されるロットがあります。そのような抗PV抗体ロットについては、復元のための水の添加は不要です。次に、新しいラベル付きチューブに、最終容量が3.6 millilitersとなるように抗体溶液を1対1で混合して調製します。例えば、anti PV oneを1.8 millilitersとanti PV twoを1.8 milliliters混ぜ合わせます。anti PV oneとPV twoの組み合わせを調製するため、考えられるすべてのペアの組み合わせについてこれを繰り返し、さらに各抗血清を1.2 millilitersずつ混ぜ合わせることで、3種類すべての抗体を含む溶液を調製します。4つの混合物の調製が完了したら、各抗体溶液に720 µLのFCSを添加します。これにより、アッセイ中の抗体によるゼラチン粒子の非特異的凝集を抑制できます。抗体プールは、凝集アッセイで使用するまで-20 °Cで保存可能です。本アッセイでは、ヒトポリオウイルス受容体の細胞外ドメインおよびマウスFCドメインに対するIgG2でコーティングされた凍結乾燥ゼラチン粒子を使用します。凝集像の一貫性を確保するため、1回の実験で異なるロットの粒子を混ぜず、必ず単一ロットの粒子を使用してください。各バイアルに1.5 mLの再構成バッファーを加えて粒子を再構成します。軽く叩いてよく混ぜ合わせてください。再構成した粒子は、4 °Cで最大2週間保存できます。まず、96ウェルマイクロタイタープレートを用いて実験を設計してください。各サンプルについて、ウェル1にはウイルスのみを分注します。ウェル2から5には、ウイルスと4種類の混合抗体溶液のいずれかを添加します。ウイルスおよび抗体を含まず、培地のみを添加した陰性対照用にウェルを1つ確保してください。プレートの準備が完了したら、2行目から5行目の各ウェルに、適切な抗体溶液を12 µLと、増殖培地を12 µLずつ添加します。1行目のウェルにはウイルスのみを含む培地を、6行目の陰性対照ウェルには培地を添加します。次に、1〜5行目のウェルにウイルスサンプルを12 µLずつ、6行目の陰性対照ウェルに増殖培地を12 µL添加します。抗体とウイルスをプレートに分注した後、軽く叩いて再構成されたゼラチン粒子を懸濁させ、直ちにすべてのウェルに粒子を25 µLずつ添加します。各ウェルに等量の粒子を分注するためには、プレートに移す前に粒子を沈殿させないことが重要です。アッセイプレートをプレートミキサーにセットし、30秒間混合します。その後、プレートを白い紙の上に置き、室温で2時間インキュベートして凝集反応を進行させます。凝集形成物は不安定であるため、インキュベーション中およびインキュベーション後はいかなる時もプレートを動かさないことが重要です。反応が起こった後、各ウェルの凝集の質を確認できるよう、プレートの写真を数枚撮影します。凝集が起こらなかったウェルでは、こちら左側に示されているように、着色ゼラチン粒子がウェルの底に沈殿します。凝集が起こったウェルでは（凝集が見られます）。ウイルスとpvr、およびIgG two Aコートゼラチン粒子の相互作用により、中央に示されているように拡散した色パターンが観察されます。本実験では、抗体存在下でウイルス溶液（PV one、two、three）が凝集を誘導する能力を検証しました。ここに示す組み合わせにおいて、ウイルスまたは抗体が存在しない場合は凝集が起こらず、ゼラチン粒子が沈殿します。これに対し、ウイルスは含まれているが抗体が含まれていないウェルでは、対照的な結果となります。ウイルスの相互作用により凝集が起こっています。実験ウェル内のPVR IgG 2A被覆ゼラチン粒子において、そのウイルスを特異的に中和する抗体が含まれているウェルでは、ウイルスの凝集が阻止されます。例えば、ポリオウイルス1型の凝集は、抗PV1抗体を含むウェルでは阻止されますが、抗PV2抗体および抗PV3抗体のみを含むウェルでは阻止されません。ポリオウイルス2型および3型についても同様です。この手法に習熟すれば、適切に実施することで最短3時間で完了させることができます。

particle-agglutination-method-for-poliovirus-identification

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JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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インフルエンザウイルスリボ核タンパク質複合体の精製と可視化

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タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために磁気ビーズを用いて液相アフィニティキャプチャーアッセイ：ポリオ-nanobodyの例

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このビデオでは、インフルエンザA型ウイルスとB型ウイルスの抗原関係を解析するためのイメージングベースのマイクロ中和アッセイを実演しています。これは、ウイルス感染の予防における抗体やその他の治療法の有効性を評価するための定量的かつ視覚的な方法を提供します。...

画像ベースのマイクロニュートラル化アッセイを用いたウイルス間の抗原関係の解析

原子間力顕微鏡とバイオパニング技術を組み合わせて、低濃度であってもあらゆる生物学的材料に存在する疾患特異的タンパク質変異体に対する抗体を取得するためのネガティブおよびポジティブバイオパニングシステムを作成しました。...

筋萎縮性側索硬化症におけるTDP-43の変異体に対する形態学的試薬の分離のための新規原子間力顕微鏡ベースのバイオパニング

私たちは、アデノウイルス(Ad)に感染したヒト細胞からウイルス複製コンパートメント（RC）を単離する新しい戦略を提供します。このアプローチは、ウイルスゲノムの複製と発現を調節する分子メカニズム、およびRCで確立されたウイルスと宿主の相互作用の制御を解明するのに役立つ無細胞システムを表しています。...

アデノウイルスに感染したヒト正常細胞からのウイルス複製コンパートメントに富むサブ核画分の単離

印刷された糖鎖マイクロアレイ戦略を使用して、従来の96ウェルプレートアッセイを小型化し、インフルエンザAウイルスのヘマグルチニンの結合性とシアル酸含有受容体の特異性を分析しました。...

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ここでは、抗原表示ウイルス様粒子(VLPs)上の中和エピトープを検出するプロトコルを提示する。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来VLPの免疫沈降は、G結合型磁気ビーズのタンパク質に結合したエンベロープ糖タンパク質特異的モノクローナル抗体を用いて行う。捕獲されたVLPは、その後、SDS-PAGEおよびウイルスコアタンパク質Gag特異的抗体を採用したウェスタンブロット分析を行う。...

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シングルステップおよび半自動ヘパリンアフィニティークロマトグラフィープロトコルによるアデノ随伴ウイルスベクターの単離

学ぶポリオウイルス同定の粒子凝集法。キメラ分子被覆ゼラチン粒子を用い、単一ステップで迅速にウイルスを検出する。従来法より簡便で解釈が容易なウイルス学診断技術である。

ポリオウイルスの同定のための粒子凝集法

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