ポリオウイルスの同定のための粒子凝集法

次の手順の全体的な目標は、簡単なプロトコルを使用してポリオウイルス分離株を迅速に特定することです。このアッセイでは、IgG 2 fcに結合したヒトポリオウイルス受容体の細胞外ドメインを含むキメラ分子でコーティングされた増感ゼラチン粒子を使用します。これらの粒子は、ポリオウイルス分離株のすべての血清型に対して均一な親和性を有するため、ヒトポリオウイルスを含むサンプルとのインキュベーション時に粒子の凝集が起こります。

しかし、この実験システムを用いて、試料を分離する特異的なウイルスを認識する抗体が存在すると、中和が起こり、凝集が防止されるため、ポリオウイルス分離株の迅速な同定をワンステップ反応で行うことができます。既存の容器のこの技術の主な利点は、従来の中和テストのように、手順と解釈のSIMの単純さであり、必要な労力を削減し、迅速化し、結果の時間を短縮することを目的としています。抗PV One抗体、PV 2抗体、PV 3抗体を再構成するには、各バイアルに0.5ミリリットルの水を加えます。

次に、各抗体溶液を4.5ミリリットルのメンテナンス培地を含む別々のチューブに移します。一部の抗PV抗体は、そのような多くの抗PV抗体に対して再構成された形で提供されています。再構成のための水の追加は必要ありません。

次に、最終容量3.6ミリリットルの抗体溶液を新たに標識したチューブに1対1で調製します。たとえば、1.8ミリリットルのアンチPVワンと1.8ミリリットルのアンチPVツーを混合します。抗PV1プラスPV2の組み合わせを調製するには、考えられるすべてのペアワイズの組み合わせでこれを繰り返し、各抗血清を1.2ミリリットルずつ混合して、3種類の抗体すべてを含む溶液を調製します。

4つの混合物を各抗体溶液に対して720マイクロリットルのFCSで作製しました。これにより、アッセイ中の抗体によるゼラチン粒子の非特異的凝集を抑えることができます。抗体プールは、凝集アッセイで使用するまで、摂氏マイナス20度で保存できます。

このアッセイでは、ヒトポリオウイルス受容体の細胞外ドメインとIgG 2つのマウスFCドメインでコーティングされた凍結乾燥ゼラチン粒子を使用します。1回の実験で異なるロットではなく、1ロットの粒子を使用し、凝集画像の一貫性を確保して、各バイアルに1.5ミリリットルの再構成バッファーで粒子を再構成するようにしてください。軽くたたいてよく混ぜます。

再構成された粒子は、摂氏4度で最大2週間保存できます。まず、96ウェルマイクロタイタープレートで実験を設計します。各サンプルについて、1番の井戸にはウイルスのみが含まれています。

2番から5番のウェルには、ウイルスに加えて、4つの混合抗体溶液のうち1つが含まれます。ウイルスや抗体を含まない培地のみを含むネガティブコントロール用に1つを必ず保存してください。プレートをセットしたら、2列目から5列目までの各ウェルに12マイクロリットルの正しい抗体溶液と12マイクロリットル

ウイルスのみのミディアムは、1行目に井戸、6行目にネガティブコントロール井戸があります。次に、最初の5行に12マイクロリットルのウイルスサンプルを追加し、6行目のネガティブコントロールウェルに12マイクロリットルの増殖培地を追加します。抗体とウイルスが播種されたら、再構成されたゼラチン粒子を軽くたたいて懸濁し、すぐにウェルごとに25マイクロリットルの粒子をすべてのウェルに加えます。

粒子をプレートに移す前に粒子を沈降させないようにすることが、それぞれに等量の粒子を得るために重要です。アッセイプレートをプレートミキサーにしっかりと置き、30秒間混合します。次に、プレートを白い紙の上に置き、プレートを室温で2時間インキュベートして凝集を起こさせます。

インキュベーション中またはインキュベーション後には、形成される凝集が不安定であるため、プレートを動かさないことが重要です。反応が起こったら、各ウェルの凝集の品質を評価できるプレートの写真を数枚撮ります。凝集が起こっていない井戸では、左に示すように、凝集が起こった井戸では、色のゼラチン粒子が井戸の底に沈

ウイルスとpvr、IgG 2 Aコーティングゼラチン粒子との間の相互作用により、中央に示すように拡散した色のパターンが見えます。この実験では、ウイルス溶液、PV 1、PV 2、および3が抗体の存在下でgluを誘導する能力をテストしました。ここに示されている組み合わせは、ウイルスまたは抗体がない場合、凝集は起こらず、ゼラチン粒子は対照的によく含まれているウイルスで沈殿しますが、抗体はありません。

ウイルスの相互作用により凝集が起こっています。実験用ウェルにPVR IgG 2 Aで覆われたゼラチン粒子を使用すると、そのウイルスを特異的に中和する抗体を含むウェルでウイルスの過剰状態が防止されます。例えば、ポリオウイルス1型の過剰国家は、抗PV1抗体を含む井戸では予防されますが、抗PV2抗体と抗PV3抗体のみを含む井戸では予防されません。

ポリオウイルス2型と3型についても同じことが言えます。マスターしている間、このテクニックは適切に実行されれば、わずか3時間で行うことができます。