高齢者とパーキンソンラットにおける超音波発声の対象とトレーニング

本手順の全体的な目的は、ラットを訓練して、超音波発声（USV）の回数と複雑さを増加させることです。これは、まずベースラインの発声を記録し、次に正の強化を用いて標的とする発声を訓練することによって達成されます。

トレーニング後、発声録音を行います。手順の最終ステップは、ベースラインとトレーニング後の発声のアコースティック解析および比較です。これにより、最終的に結果を得ることができます。

これにより、帯域幅、ピーク周波数、持続時間などの音響パラメータの上昇を通じて、訓練が超音波発声の数と複雑さを増大させることが示されます。この手法は、発声エクササイズが潜在的な神経メカニズムをどのように調節するかなど、コミュニケーション障害の分野における重要な疑問への解答に役立ちます。また、本手法は、パーキンソン病や加齢に伴う頭蓋感覚運動機能の欠損に関する知見を提供することが可能です。

本手法は、超音波発声Behavioral index（行動指標）として用いる他の疾患モデルや条件下でも適用可能です。発声トレーニングのデモンストレーションは、私の研究室のメンバーであるEmerald DahlとJamie Shireが行います。超音波モニタリングを開始するには、Avis Soft Recorderソフトウェアを起動し、録音を手動で開始および停止できるよう、トリガーに「permanent unlimited」を選択してください。次に、キャプチャしたオーディオファイルの保存先をベースディレクトリで指定します。

最高発声周波数を捉えるため、サンプリングレートは少なくとも 200,000 hertz である必要があります。これらのパラメータを設定した後、雄のホームケージの上部を取り外し、マイクの直下に配置します。次に、ロードシス、耳のぴくつき、および急速なダッシュが見られることで、性的に受容的な状態にある雌ラットを確認します。

受容的な雌ラットを、被験体である雄ラットのホームケージに入れます。雄が雌を嗅ぐ、追いかける、あるいはマウンティングするなどの関心を示した際、雌をケージから取り出し、雄の発声を1〜2分間記録します。リアルタイムスペクトログラムを確認し、超音波発声を視覚的にモニターします。

オスが発声しない場合は、直ちにメスのラットを短時間だけオスのホームケージに戻し、発声を促してください。まず、1匹のオスのラットをトレーニング室に連れてきます。他のすべてのオスは、それぞれのトレーニングセッションまで隣室に保持しておく必要があります。

水をご褒美として利用しやすくするため、あらかじめラットの飲水量を制限しておきます。トレーニング中は、先に示した通りにAvisソフトレコーダーを設置してください。次に、ホームケージをマイクの下に配置します。

オスを定位置に配置したら、受容的な雌のラットをケージ内に導入します。オスが雌に興味を示した時点で雌を出し、標的となる発声を確認します。初期段階では、いかなる50 kilohertz周波数変調コールに対しても報酬を与えます。

ペンをクリックすると同時に、水ボトルまたは餌を短時間提示して報酬を与えます。トレーニングが進むにつれて、5回や10回の鳴き声を短時間に連続して出すといった、より複雑な一連の鳴き声のみを強化するように扱います。30回の強化が行われるまでトレーニングを継続してください。

ベースラインおよびトレーニング後の録音データの解析には、通常5〜10分かかります。まず、元の音声ファイルのアーカイブを作成し、作業用コピーを用いて超音波発声よりも低いノイズ周波数を除去する編集を行います。AVI Soft SaaS Lab Proのバッチモードを使用して、音声ファイルに25 kilohertzのハイパスフィルタを適用してください。

SaaS Lab Proの自動要素検出機能に使用するために必要なノイズしきい値を決定するには、サウンドファイルを開き、スペクトログラムを作成します。FFT長を512に設定し、フレームサイズを75%、時間的オーバーラップを93.75%に設定します。スペクトログラムから消去したノイズを波形からも削除できるよう、波形編集を有効にします。自動パラメータ測定をここに示すように設定してください。

測定する3つのパラメータは、要素の持続時間、ピーク周波数、およびピーク振幅です。「測定場所」において、「最大振幅」および「要素全体の最小・最大パラメータ」を有効にします。「要素分離」では、「自動シングルしきい値」を選択し、「しきい値を表示」を有効にします。

スペクトログラムの中で、コールやノイズが存在しない領域を探します。これが背景ノイズとなります。閾値を、この背景ノイズのわずかに上のレベルに設定してください。

スペクトログラムの上にあるパワースペクトルウィンドウ内の黒い線を調整することで、前のステップで設定した閾値のデシベルレベルを確認できます。「rejective amplitude is less than value」を、閾値より1デシベル低い値に設定してください。これらの2つの値を、今後解析するすべてのサウンドファイルに使用します。

すべての録音設定が同一であると想定し、発声をラベル付けするために、先に設定した自動しきい値および既述の設定を用いてスペクトログラムを作成します。以下の基準に該当するノイズを手動で消去してください：1. 誤って発声として識別されたもの。2. 発声の開始点または終了点の判別に影響を与えているもの。3. 発声における最高周波数または最低周波数として誤って識別されたもの（これらはそれぞれ上端および下端の赤線で示されています）。

場合によっては、移動中の床材の音などの周囲のノイズから発声音を分離できないことがあります。このようなコールは正確な分析が不可能なため、すべての発声音を特定した後に削除する必要があります。サウンドファイルからスペクトログラムの削除セクションを完全に消去してください。「ツール」ドロップダウンメニューから「Remove Spectrogram Sections from Waveform（スペクトログラムセクションを波形から削除）」を選択することで、サウンドファイルに恒久的なラベルを作成できます。

自動パラメータ測定設定ウィンドウを開き、「要素分離（element separation）」セクションにある編集ボタンを視覚的および聴覚的にクリックします。各ラベル付きの発声をレビューしてそのカテゴリーを判断し、事前定義されたテキストモジュールを使用して適切なラベルを割り当てます。解析に使用するカテゴリーは、単純周波数（simple frequency）、変調（Modulated）、および倍音（harmonic）です。

スペクトログラムを閉じ、音声ファイルを保存し、分析する次の音声ファイルに進みます。すべての音声ファイルで発声が特定された後、バッチ処理ツールを使用して、すべてのファイルの音響パラメータを自動的に測定します。バッチ処理のダイアログボックスのドロップダウンメニューから、パラメータの自動測定を選択してください。

「選択したフォルダ内の全ファイルを処理する」チェックボックスを選択します。次に、フォルダボタンをクリックし、音声ファイルが保存されているフォルダを選択します。[開始]をクリックすると、最後に使用した設定に従って各ファイルが自動的に解析されます。

自動パラメータ測定セットアップのダイアログボックスにおいて、測定値はDDEパラメータの「slash log file」設定コマンドを使用して定義できるテキストファイルに保存されます。このテキストファイルは、その後、統計解析プログラムにインポートすることが可能です。これらのグラフは、1セッションあたりの発声回数および1分あたりの発声率の両方が、6週間のトレーニング期間を通じて増加することを示しています。

使用した50 kHz発声の3つのカテゴリーそれぞれの代表的な発声を、左から順に示します。これらは単純周波数、変調、および倍音発声です。この例では、同一のラットによる周波数変調発声を、パーキンソン症候群誘発前、誘発後、および発声トレーニング後に分けて示しています。

パネルAのベースラインの発声と比較して、パネルBのパーキンソン症候群条件での発声では、帯域幅、持続時間、および強度の減少が見られます。パネルCに示されているトレーニング後の発声は、発声トレーニング後に持続時間、強度、帯域幅、および周波数変調がベースラインレベルに戻ることを示しています。このビデオを視聴することで、ラットの超音波発声をトレーニングし、記録し、分析する方法について十分に理解できるはずです。