August 29th, 2011
ゼブラフィッシュの腎臓は、腎臓および造血両方成人の幹細胞/前駆細胞の本拠地であり、これらの細胞型と脊椎動物のモデル生物でそれらの子孫を研究する優秀な機会を表しています。ここでは、このような細胞の単離、移植、および腎臓および/または血液細胞集団の発現の研究などのアプリケーションに使用することができる大人のゼブラフィッシュの腎臓を、特定し、外科的に除去する研究者を可能にする詳細な解剖の手順を示しています。
この手順の全体的な目標は、成体のゼブラフィッシュ腎臓を特定し、外科的に切除することであり、これは細胞の単離、移植、発現、腎臓や血液細胞集団の研究などの用途に使用できます。これは、最初に生後3〜6か月の成魚のゼブラフィッシュを解剖用に選択することによって達成されます。その後、動物は0.2%トリカで犠牲にされ、鰓の動きが止まり、心臓の鼓動が止まったときに安楽死が確認されます。
手順の3番目のステップは、解剖ハサミを使用して腹腔を開き、その中にある臓器を切除することです。手順の最後のステップは、細かい解剖鉗子を使用して、下にある結合組織から腎臓を取り除くことです。最終的には、造血細胞または腎臓細胞サブセットの遺伝子発現プロファイル、ホールマウントによる特定の細胞集団の単離。
in situの2つのハイブリダイゼーション、免疫組織化学分析、および/または蛍光活性化細胞選別を、単離された臓器組織および/または細胞に対して行うことができる。この方法は、解剖手順を学ぶのが難しいため、視覚的なデモンストレーションが重要です。ゼブラフィッシュの腎臓はデリケートな臓器であるため、密集した結合組織を介して体壁に固定されています。
この技術の意味は、ゼブラフィッシュと高等哺乳類の間で生物学的プロセスが高度に保存されているため、ヒトの腎臓病や血液疾患の治療や診断に使用することができます。近年、ゼブラフィッシュでは数多くの分子遺伝学的ツールが開発され、有用な動物モデルとなっています。十分に貧弱で、生後3〜6か月の成魚のゼブラフィッシュを皿に覆うのに0.2%のトリカ。
次に、解剖するゼブラフィッシュを選択し、約5分間皿に入れ、鰓の動きが止まり、心臓の鼓動が止まるのを注意深く観察します。次に、スプーンを使用して、少量の溶液で魚をトリカバスから持ち上げます。溶液をデカントし、鋭利な解剖ハサミを使用して動物をペーパータオルの上にそっと置きます。
えらのすぐ後ろに切り込みを入れ、動物の頭を取り除くためにパーマをかけ、頭をバイオハザード廃棄物容器に捨てます。次に、頭から始めて、解剖ハサミを使用して、動物の体を開くために尾で終わる長い腹側切開を行います。次に、解剖ピンセットを使用して動物の内臓を取り出し、バイオハザード廃棄物に入れます。
背側の体壁は腎臓の位置であるため、ブラシをかけないように注意してください。雌魚を選択した場合は、角度のついた鉗子またはピンセットで体腔から発育中のXをすくい取ります。解剖針を使用して、体壁を解剖トレイに固定します。
腎臓が見えるようにピンを傾けます。腎臓は、頭、胴体または鞍、尾、および特徴的な色に黒い色合いの色素が散在する特徴的な形をしています。2対の細い鉗子を使用して、腎臓を背側体壁から取り外します。
1組で腎臓を持ち上げ、1組でその下にある結合組織を保持します。ゼブラフィッシュの体腔から臓器を取り出したら、腎臓を目的のビヒクルにそっと入れます PBSの1倍を含むマイクロセントリユースチューブなど、さらなる生細胞研究のために。ファックスの準備のために、解剖トレイに準備したばかりの十分な固定液を入れて、解剖中に生後3〜6か月のゼブラフィッシュを沈めます。
次に、0.02%トリカpH7を皿に注ぎます。ゼブラフィッシュを覆うには、解剖用のゼブラフィッシュを選択し、安楽死のためにトリカの皿に入れます。前に示すように動物の頭部を移動させて廃棄しますが、今回はすぐに動物をPFA入り解剖トレイに入れます。
除去後、処置中に体を部分的に固定剤に浸したまま、解剖ハサミを使用して、以前と同様に腹側切開で動物の体を開きます。繰り返しになりますが、背側の体壁を磨かないように注意しながら、解剖ピンセットを使用して動物の内臓を取り除きます。臓器をバイオハザード廃棄物容器に入れます。
以前と同様に、解剖針を使用して体壁をピンで開き、ピンを傾けて腎臓を視覚化できるようにします。その後、サンプルを一晩固定します。翌日、トレイを摂氏4度に置き、トレイから固定液を取り出し、PBSTの1倍と交換します。
次に、前と同じように、1対の鉗子を使用して腎臓を背側体壁から慎重に取り外し、腎臓器官全体を1つに持ち上げて、その下にある結合組織から腎臓を分離します。次に、ワイドボアトランスファーピペットを使用して、腎臓をマイクロ遠心チューブに入れ、さらに処理します。ここに示すように、体腔内の臓器に続いて、腎臓は結合組織を介して背側体壁に付着している単一の平らな臓器として現れます。
この図では、腎臓はその特徴的な解剖学的形状を示すために概略サイズになっています。ここでは、全山Cによって検出されたkadin 17転写産物、腎臓の2つのハイブリダイゼーションが成体の腎臓ネフロンの尿細管で見られ、右のパネルに示されている尿細管染色の拡大図が示されています。この図では、左側のパネルで、M-A-F-B-Aが成体腎臓の近位ネフロン細胞型に局在する転写産物であることが分かります。
右側に視覚化されたM-A-F-B-A発現の拡大図は、転写産物がpと矢印で示されているように神経膠腫の足細胞に特異的に局在し、PCTと括弧で示されている近位回旋尿細管に局在していることを示しています。この手順を試みている間、この手順に続いて外科的隔離の前に腎臓を傷つけないように、成魚のゼブラフィッシュの内臓を慎重に取り除くことを覚えておくことが重要です。組織学や蛍光活性化細胞ソーティングなどの他の方法を使用して、血液細胞や腎臓細胞集団の超構造特性を評価したり、細胞移植や初代細胞培養のために特定の集団を単離したりできます。
ゼブラフィッシュの腎臓は、腎臓および造血成人の幹細胞/前駆細胞を研究するための貴重なモデルです。この記事では、成人ゼブラフィッシュの腎臓の詳細な解剖手順を概説し、細胞分離および移植への応用を促進します。
Dissection of the adult zebrafish kidney enables direct access to renal and hematopoietic stem/progenitor cells, supporting mechanistic studies in regenerative biology and disease modeling. This capability strengthens early discovery and target validation for renal and hematopoietic pathways, providing predictive confidence for translational research. The method positions zebrafish as a scalable vertebrate model for pipeline-relevant stem cell and organ regeneration studies.
This dissection protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling direct access to primary stem/progenitor cells for hypothesis testing, target validation, and translational modeling.