腎上皮再生を研究するためにゼブラフィッシュの前腎のレーザーアブレーション

この手順の全体的な目的は、急性腎不全後の腎上皮再生を研究するため、ゼブラフィッシュ胚の腎臓である前腎の腎細胞を標的にしたラベル化を行うことです。まず、ゼブラフィッシュ胚にデキストラン蛍光共役体をマイクロインジェクションすることでこれを達成します。一晩のインキュベーション中に、共役体がネフロン近位尿細管細胞に選択的に吸収されます。

翌日、細胞をエピ蛍光顕微鏡で観察し、選択した細胞をパルスレーザーシステムを用いて除去します。その後、組織学的検査、ホールマウントC2ハイブリダイゼーション、および免疫組織化学を用いて、形態学的および分子的な変化を評価します。腎毒性抗生物質のgentamicinを用いた急性腎不全などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、そのような処置では壊滅的な損傷が引き起こされ致死的となるため、腎再生イベントの経時的な解析が不可能である点にあります。

この手法は、上皮再生中に起こる分子シグナル伝達イベントの特定など、腎臓研究分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。私たちはもともと、ペトリ皿内での腎上皮再生の詳細な解析方法を開発したいと考え、この技術を考案しました。メチレンブルーを含まない改良E3溶液を用いて、受精したゼブラフィッシュの胚を回収します。

受精卵を28.5 °Cで、受精後48時間から55時間の間、胚の腎系が機能し始めるまで育成します。注入を開始する前に、胚を保持するための三角形のくぼみがある型を用いて、アロス注入ツリーを準備します。次に、標準的なマイクロインジェクションニードルと、近位尿細管を標識するための注入溶液を準備します。胚を準備して実験を開始します。

まず、細いピンセットを使用して、未孵化卵からCorianを除去します。次に、Corianの破片およびペトリ皿内のゴミを洗浄し、皿に30 millilitersの修飾E three溶液を補充します。次に、5 millilitersのtricaで幼魚を麻酔させます。

タッチレスポンスを確認し、幼虫が完全に麻酔されていることを確認してください。十分に麻酔されていない場合、注入中に幼虫が痙攣することがあります。次に、プラスチック製転送ピペットを使用して、幼虫をモールドに入れます。

動物の頭部を窪みの最も深い部分に、体幹をウェルの側面に沿わせるように配置します。次に、準備した針に2〜3 µLのdextran fluoresceを充填し、針を配置して、各動物の体幹にあるsomiteに約1 nLの溶液を筋肉内微量注入します。デキストラン共役体はネフロンの近位尿細管に容易にエンドサイトーシスされるため、この上皮細胞集団を選択的に標識することが可能です。

体節（somite）の上部を狙い、卵黄嚢の延長部分を避けてください。そうしないと、この不適切に注入された個体のように、ネフロン尿細管が破壊されてしまいます。幼魚への注入が完了したら、清潔なペトリ皿に移し、新鮮なE3培地で3回すすいで、トリカエナロール（trica）の痕跡をすべて取り除きます。次に、蓋をアルミホイルで覆い、28 °Cで一晩インキュベートします。

本手順を開始する前に、固定化用培地を調製し、一部を室温で即時使用できるように分注し、残りを長期保存用に4 °Cで保存しておきます。まず、30 mLのE3溶液にトリカイン5 mLを加え、ゼブラフィッシュ幼魚を麻酔します。前回と同様に、魚が触覚刺激に反応しないことを確認してください。

次に、注入した動物を蛍光下で観察し、近位尿細管が容易に視認できる幼虫を選択します。fitzyフィルター、明視野照明、およびレーザー装置を備えた複合蛍光顕微鏡を用いて、最大12匹の幼虫を、同濃度のtricaを含む新しいディッシュに移します。切除は、幼虫を固定用培地を含むディッシュに移して麻酔をかけることから開始します。

2分間待機した後、個体を固定液を1滴滴下したガラス凹面スライドに転送します。細いプローブを用いて、動物の背面が上になるように慎重に配置し、背面に焦点を合わせます。次に、校正済みのパルスマイクロポイントレーザーシステムを用いて、一方のネフロンをアブレーションし、もう一方はコントロールとしてそのままに残します。

腎上皮細胞がアブレーションされるにつれて、蛍光が拡散していくのが分かります。その後、動物を緩やかに12ウェルプレートのウェルに移し、E3培地で3回洗浄してメチルセルロースを除去します。最初の12ウェルプレートがいっぱいになるまで、ネフロンのアブレーションを継続します。

次に、別の12匹の動物を麻酔し、同様の工程を繰り返します。近位尿細管を選択的に標識するため、Dextra Fitzyを注入しました。受精から3日後、各個体のネフロンをレーザーアブレーションにより除去しました。

アブレーションの1日後。アブレーションの4日後には再生は見られないが、in situ twoにおける細胞アブレーション後には再生が起こっている。単一時点での固定サンプルの変化を解析するために、ハイブリダイゼーションを用いた。

この胚は切除を行っていません。対照的に、この胚は管状上皮の広い範囲を切除し、こちらの胚は管状上皮の短い区間を切除しています。この処置の後、ネフロン再生過程における遺伝子発現の変化などのさらなる疑問を明らかにするために、ホールマウントin situハイブリダイゼーションなどの他の手法を実施することが可能です。

化学薬品の取り扱いは非常に危険であることに留意してください。本手順の実施中は、白衣や手袋などの個人用保護具を着用するなどの予防策を推奨します。