腎上皮再生を研究するためにゼブラフィッシュの前腎のレーザーアブレーション
August 29th, 2011
ヒトの急性腎臓損傷（AKI）は腎臓のネフロンを構成する上皮細胞の損傷によって引き起こされる一般的な臨床上の問題であり、AKIは50から70パーセント1の高い死亡率に関連付けられています。この現象を導くメカニズムと限界がよくわかっていないままにかかわらず、上皮細胞の破壊に続いて、ネフロンは、再生する機能が制限されています。このビデオの記事では、我々はターゲットレーザーのゼブラフィッシュ胚の腎臓で腎臓のネフロン細胞の切除、または前腎のための私たちのテクニックを説明します。私たちの新しいメソッドは、AKIの腎毒性誘発性のモデルを補完し、腎臓のネフロンにおける上皮再生に関連付けられている細胞と分子の変化の高解像度の理解を得るために使用することができます。
この手順の全体的な目標は、急性腎障害後の腎上皮再生を研究する目的で、ゼブラフィッシュの胚性腎臓、プロネフロスの腎臓細胞の標的を絞ったお祝いを行うことです。これは、最初にゼブラフィッシュの胚にデキストラン蛍光コンジュゲートをマイクロインジェクションすることで達成されます。一晩のインキュベーション中に、コンジュゲートはネフロン近位尿細管細胞によって選択的に吸収されます。
翌日、細胞をエピ蛍光下で検査し、選択した細胞をパルスレーザーシステムを使用してアブレーションします。その後、組織学、全マウントC 2ハイブリダイゼーション、および免疫組織化学を用いて、形態学的および分子的変化が評価されます。この手法の主な利点は、腎毒性抗生物質ゲンタマイシンを使用した急性腎障害などの既存の方法と比較して、そのような治療が壊滅的な損傷を引き起こし、時間の経過とともに腎再生イベントの分析を妨げる致命的であることです。
この方法は、上皮再生中に発生する分子シグナル伝達イベントの特定など、腎臓分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法のアイデアを最初に思いついたのは、ペトリ皿の腎上皮再生の詳細な分析を開発したいと思ったときでした。受精したゼブラフィッシュの胚を、メチレンブルーを含まない改変E3溶液で採取します。
受精した胚を摂氏28.5度で48〜55時間になるまで育てます 受精後、胚の腎臓系が機能し始めたとき 注射を開始する前に、胚を保持するための三角形のくぼみのある型を使用してアロス注射木を準備します。次に、標準的なマイクロインジェクション針と、近位尿細管を標識するための注射液を準備します。胚を準備することから実験を始めます。
まず、細い鉗子を使用して、孵化していない卵からコーリアンを取り除きます。次に、コーリアンの破片、ペトリ皿からの破片をすすぎ、30ミリリットルの改質E3溶液を皿に補充します。次に、5ミリリットルのトリカで幼虫に麻酔をかけます。
触覚反応を確認して、幼虫が完全に麻酔されていることを確認してください。彼らが完全に麻酔されていない場合、彼らは注射中にけいれんします。第三に、プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、幼虫を型に入れます。
動物をくぼみの最深部に頭を向け、鼻を井戸の側面に沿って配置します。次に、準備した針に2〜3マイクロリットルの蛍光デキストランを投入し、各動物のダニである幹に約1ナノリットルの溶液を注入することにより、筋肉内マイクロ注射を進めます。デキストランコンジュゲートは、ネフロン近位尿細管によって容易にエンドサイトーシスされるため、この上皮細胞集団の優先的な標識が可能になります。
ダニの上部を目指し、卵黄嚢の伸長を避けてください、さもなければ、この不適切に注入された動物のように、ネフロン尿細管が破壊されてしまいます。幼虫が注入されたら、それらを清潔なペトリ皿に移し、新鮮なE 3培地で3回すすぎ、トリカの痕跡をすべて取り除きます。次に、蓋をホイルで覆い、動物を摂氏28度で一晩孵化させます。
この手順を開始する前に、Im動員培地を準備し、一部のアリコートを室温ですぐに使用できるように保管し、残りのアリコートを長期保存のために摂氏4度に保ちます。ゼブラフィッシュの幼虫に、30ミリリットルのEスリーに5ミリリットルのトリカを麻酔することから始めます。以前と同じように、魚が触覚に反応しないように注意してください。
次に、注射した動物を蛍光下で調べて、近位尿細管が容易に視覚化できる幼虫を選択します。最大12匹の幼虫を、同じ濃度のトリカを含む新しい皿に移し、フィットフィルター、明視野照明、レーザーを備えた複合蛍光顕微鏡で行います。アブレーションは、溶岩を固定化媒体を含む皿に移して麻酔することから始まります。
そして、2分待ってから、溶岩を固定化媒体の滴を含むガラスのくぼみスライドに移します。細いプローブで動物の背側を上にしてそっと置き、背側に焦点を合わせます。現在、校正されたパルスマイクロポイントレーザーシステムを使用して、ネフロンの1つをアブルし、もう1つをコントロールとして無傷のままにします。
腎上皮細胞がアブレーションされると、蛍光の分散が見られます。次に、動物を12ワールドディッシュの井戸にそっと移し、E 3培地で3回すすぎ、メチルセルロースを洗い流します。最初の12ワールドディッシュが満たされるまで、ネフロンのアブレーションを続けます。
次に、さらに12匹の動物に麻酔をかけ、このプロセスを繰り返します。Dextra Fitzy は、近位尿細管を優先的に標識するために注射されました。受精の3日後、各動物のネフロンをレーザーアブレーションしました。
アブレーションの1日後。アブレーションの4日後には再生は明らかになりませんが、in situの2回の細胞アブレーション後に再生が起こっています。ハイブリダイゼーションを使用して、単一の時点での固定サンプルの変化を分析しました。
この胚はアブレーションを受けませんでした。対照的に、この胚は大きな伸びる尿細管上皮が切除され、この胚は短い間隔の尿細管上皮が切除されました。この手順に続いて、ネフロン再生の過程での遺伝子発現変化の同一性などの追加の質問に答えるために、hol mount situハイブリダイゼーションなどの他の方法を実行できます。
化学物質の取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。この手順では、白衣や手袋などの個人用保護具を着用するなどの予防措置が推奨されます。
概要
この記事では、ゼブラフィッシュ胚における標的レーザーアブレーションを用いた急性腎障害（AKI）後の腎上皮再生を研究する新しい技術を紹介しています。この方法により、ネフロン再生中の細胞および分子レベルの変化を高解像度で分析することができます。
主要な研究内容
科学分野
- 腎臓学
- 再生医療
- 発生生物学
背景
- 急性腎障害（AKI）は、高い死亡率を伴う重要な臨床問題です。
- 上皮細胞の損傷後のネフロンは再生能力が限られています。
- 再生のメカニズムを理解することは治療戦略を開発する上で重要です。
- 既存のモデルはしばしば破壊的な損傷を引き起こし、再生分析を妨げています。
研究目的
- ゼブラフィッシュ胚におけるネフロン細胞の標的アブレーション方法を開発すること。
- AKI後の腎上皮細胞の再生プロセスを研究すること。
- 上皮再生に関与する分子シグナル伝達イベントを特定すること。
使用方法
- 蛍光デキストラン共役物質をゼブラフィッシュ胚にマイクロインジェクションすること。
- パルスレーザーシステムを用いた選択されたネフロン細胞のレーザーアブレーション。
- 組織学および免疫組織化学による形態学的および分子的変化の評価。
- ネフロン再生中の遺伝子発現変化の分析。
主な結果
- 標的アブレーションのための近位尿細管細胞の成功的な標識。
- レーザーアブレーション後にネフロン細胞の再生が観察された。
- 組織学的分析により、アブレーション後の遺伝子発現の著しい変化が明らかになった。
- この方法により再生プロセスのリアルタイム観察が可能になった。
結論
- 標的レーザーアブレーション技術は腎再生を研究するための貴重なツールです。
- この方法は従来の腎毒性モデルの制限を克服します。
- 得られた洞察はAKIの将来の治療アプローチに情報を提供する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Targeted laser ablation in zebrafish pronephros enables precise interrogation of renal epithelial regeneration mechanisms, addressing a critical gap in acute kidney injury (AKI) research. This approach enhances predictive confidence in early discovery by allowing controlled injury and real-time analysis of regenerative responses. The method supports mechanistic de-risking and informs portfolio decisions for renal therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise testing of regenerative hypotheses in a conserved vertebrate model.
- Facilitates functional validation of renal epithelial targets post-injury.
- Supports mechanistic de-risking by isolating specific cell populations for ablation.
- Improves predictive confidence for downstream renal drug discovery programs.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible injury model for quantitative assessment of regenerative capacity.
- Allows standardization of injury extent and localization for assay consistency.
- Generates robust, quantifiable outputs for evaluating candidate interventions.
- Enables platform reuse for screening genetic or pharmacological modifiers of regeneration.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms observed in human AKI.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation of regenerative pathways.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying regenerative potential in vivo.
- Offers a tractable system for biomarker discovery linked to epithelial repair.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the early discovery and target validation stages, bridging to preclinical research by enabling controlled injury and regeneration studies in a vertebrate model.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of renal regeneration mechanisms and pathway elucidation.
- Screening: Provides a standardized, reproducible injury model for quantitative assay development.
- Analytics: Delivers measurable outputs such as morphological and molecular changes post-ablation.
- Translational Research: Facilitates alignment with human AKI pathophysiology and regenerative responses.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible platform adaptable to other organ systems and regenerative contexts in zebrafish.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in renal regeneration studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of injury/regeneration assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by clarifying regenerative mechanisms early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of renal targets and therapeutic strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microinjection, and laser ablation techniques.
- Needs access to fluorescence microscopy and pulsed laser instrumentation.
- Demands cross-team standardization for injury induction and outcome measurement.
- Adaptable to other organ systems in zebrafish with protocol modifications.
- Limited to transparent larval stages for optimal imaging and ablation precision.
