手術標本の腫瘍外植片を用いて新規抗がん薬の開発のための方法

この手順の全体的な目的は、「tumor X explan法」と呼ばれる、脳腫瘍の手術検体を用いた薬剤有効性試験の新しい手法を確立することです。まず、前臨床試験のために、手術中に摘出された悪性神経膠腫の新鮮な手術検体を確保します。次に、これらのサンプルを組織調達コアファシリティに搬送し、臨床診断用と研究用とに分離します。

次に研究室にて、腫瘍外植片を複数の小さな組織に切り分け、最適化された培地に移します。最後に、候補薬剤の腫瘍内注射を行い、外植片を16時間培養します。最終的に、ヘマトキシリン・エオシン染色および細胞型特異的マーカーを用いた免疫組織化学染色により、治療の有効性を示す結果を得ることができます。

また、フローサイトメトリーや神経球形成アッセイを用いて、in vitroで薬効を評価することも可能です。現在の薬効評価アッセイの多くは、現在の前臨床実験モデルにおける薬効と、実際の患者における有効性との間に乖離があります。特に、悪性神経膠腫などの固形がんで候補薬をテストする場合、細胞内シグナル伝達だけでなく、細胞間シグナルのやり取りを軽視することはできません。

固形がんの微小環境を破壊しないために、腫瘍摘出物を用いた独自の培養法を確立しました。患者から腫瘍が摘出された後、検体は病理診断科から、あるいは病理診断科へ転送されます。腫瘍塊を2つの断片に分割し、一方の腫瘍検体は臨床診断のための凍結切片作成およびパラフィン包埋に使用し、残りの腫瘍組織は研究者が使用するために研究室へ送られます。

本手法を用いることで、腫瘍に隣接する腫瘍内皮細胞および免疫細胞、ならびに腫瘍を囲んでいるか、あるいは腫瘍腔内に遊走している正常な脳細胞を含む腫瘍の微小環境を保存できます。膠芽腫組織を処理する前に、液体、培地、およびアガロース溶液を準備します。これらを1:1の比率で混合してください。

次に、6ウェルプレートの各ウェルに1 mLずつ添加します。採取したばかりの多形性膠芽腫組織をピンセットでシャーレに移し、外科用メスとピンセットを用いて、氷冷した1倍PBS 5 mLで3回慎重に洗浄します。解剖したサンプルから、腫瘍ブロックを作成するために直径約10 mmの連続切片を切り出し、各ブロックを寒天培地を含む6ウェルプレートの各ウェルに移します。その際、組織の生存性を維持するため、十分な空気に触れるように配置してください。

次に、1 mLのインスリン用シリンジと28G 1/2インチの針を用いて、腫瘍ブロックに5% DMSO、2.5 nMのテモゾロミド、または新規抗がん剤候補物質を3回注入し、5% CO2を含む加湿空気下、37 °Cで16時間インキュベートします。インキュベーション後、ブロックを5 mLの1× PBSで3回洗浄します。その後、50 mLチューブ内で、10% (v/v) 4% ホルマリン 10 mLを用いてブロックを24時間固定します。

組織をパラフィン包埋し、4 µmの厚さに切片を作成し、脱パラフィンおよび親水化処理を行います。スライドをラックに入れ、以下の溶液でインキュベートします。キシレンで5分間ずつ3回洗浄します。

100% ethanolで5分間ずつ3回洗浄します。次に、95% ethanolで5分間1回、70% ethanolで5分間1回洗浄します。最後に、流水で3分間すすぎます。

抗原賦活化および内因性ペルオキシダーゼの阻害に関する詳細は、付属の書面プロトコルを参照してください。切片をブロッキングするため、組織を10% normal goat serumで覆い、スライドを湿潤箱に移して室温で1時間インキュベートします。スライドを1×PBSで5分間ずつ3回洗浄します。

次に、1× PBSで希釈したヒト特異的caspase 3またはKI 67などの一次抗体を加え、4°Cで一晩インキュベートします。翌日、スライドを1× PBSで3回、各10分間洗浄します。続いて、HRP標識二次抗体を組織に2〜3滴滴下します。

スライドを加湿箱に入れ、室温で1時間インキュベートします。PBSで3回、各5分間洗浄します。製造元の指示に従い、発色剤DABキットを用いてサンプルを発色させ、対比染色を行います。

スライドをヘマチンに10〜15秒間浸します。その後、流水で3分間洗浄します。スライドを以下の溶液に順次浸してサンプルを脱水し、封入剤とカバーガラスを用いて封入します。

次に、蛍光顕微鏡を用いてスライドを撮影します。この図のガドリニウム造影剤を用いたT1強調MRI画像は、手術前の患者の右前頭葉にある造影された膠芽腫（GBM）腫瘍を示しています。術後の画像では、手術後に病変が亜全摘出されたことが確認されました。

ヘマトキシリン・エオシン染色は、壊死、偽柵状配列（pseudo palisade cells）、および微小血管増殖の存在を示しています。したがって、これらの腫瘍摘出サンプルが信頼性高く利用可能であるかを確認するため、これらの腫瘍は組織病理学的にGBMと診断されました。薬効試験を目的として、テモゾロミド（TMZ）の効果を検証しました。TMZ投与済みGBM組織の免疫組織化学的染色は、対照サンプルと比較してKi67陽性腫瘍細胞が大幅に減少していることを示しています。

一方、アポトーシスマーカーであるcaspase threeを用いた免疫組織化学染色では、TMZ処理したグリオーマ検体と対照サンプルの間に有意な差は見られませんでした。テモゾロミドによる治療効果は、このex explanアッセイをin vitro培養またはフローサイトメトリーと組み合わせることで、さらに詳細に評価することが可能です。このex explan法を、新規抗がん剤のスクリーニングにおけるゼノグラフト移植やin vitroのスフィア形成アッセイと比較検討することができます。

腫瘍組織を研究室で入手した後、本実験の手順は1時間以内に完了できます。この新しいアッセイは、処理した腫瘍移植片を解離させた後、比較的容易に実施でき、再現性があります。また、in vitro試験と組み合わせることも可能です。

このアッセイの大きな利点は、腫瘍微小環境が維持されることです。Temodar処理した腫瘍外植片を用いて陽性データが得られ、これは手術後にTemodar治療を受けた同一患者の結果と一致していました。最後に、本手法は他の固形がんにも適用可能であるため、固形がん治療のための新規化学療法剤の同定を加速させる可能性があります。