の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

次の実験の全体的な目標は、初期胚形成中の細胞内イベントを記録することです。これは、DNAおよび小胞のサブセットの可視化を可能にする複数の蛍光標識タンパク質を有するトランスジェニック株を使用することによって達成される 初期胚では、特定のオルガネラは、Lyo trackerまたはMIT trackerなどの蛍光色素の成虫の生殖腺へのマイクロインジェクションによって標識されます。次に、成虫から胚を切り取り、共焦点顕微鏡で観察して、細胞小器官内の標識タンパク質の動きをタイムラプスで記録します。

最終的に、このプロトコールは、CLアレルギーの初期発生におけるリソソームとGFPタグ付き小胞の興味深い動きを明らかにします。私の名前はコニー・ヘジャーで、今日はハンツビルにあるアラバマ大学のボイド研究室でタイムラプス顕微鏡検査をどのように行っているかをお見せします。この実験では、実験の前日に摂氏25度のOP50細菌芝壇に座ったNGMアグリプレート上のグロ線虫を、少なくとも40Lの幼虫を着たプレートに選び、摂氏25度で一晩インキュベートします。

これらのワームは若年成人になります。実験用。過去のピペットから水に2%アロスを2滴挟み、2つのカバーガラススリップの間に挟み、圧力を加えてアグロスを直径1.5センチメートルの円に成形して、インジェクションパッドを作成します。

トップカバースリップを取り外し、パッドを摂氏80度のオーブンに1時間置いて脱水するか、ベンチトップに一晩置いておきます。注射当日は、希釈したMITトラッカーまたはlyoトラッカー色素溶液を調製し、1.2 odガラスキャピラリーから注射針を引き出します。希釈した染料溶液で針を埋め戻し、マイクロマニピュレーターに注射針を取り付け、内径1.2mmのチューブで針を圧力調整器に接続すると、暗所加湿チャンバーに保管します。

次に、2滴の重鉱物油を注入パッドに置きます。インジェクションパッドを顕微鏡に置き、針をオイルに下げます。注入圧力をかけ、流体が針から流れ出るかどうかを確認します。

そうでない場合は、注射パッドに置かれた小さな壊れたカバーガラスに先端をそっと打ち込んで、針の端をそっと折る必要があります。針が流れた後、胚を見る1時間前に注射を進めます。写真を使用して、若い成虫を注入パッドのオイルドロップに移します。

3〜10匹のワームを平行に配置し、ワームの長さを1つ未満離して配置します。現在、ワームが乾燥する前にワームを迅速に注入することが重要です。ワームの入ったパッドを顕微鏡ステージに移動します。

遠位生殖腺の中央部分に焦点を合わせます。次に、マイクロマニピュレーターを使用して、針の先端を同じ焦点面に移動します。ステージを水平に動かしてワームに穴を開けます。

針先がカスの内側にあるとき、圧力を加えて生殖腺を染料混合物で満たします。生殖腺は注射の量とともに拡張します。注入を進めます。

どちらも注射後に各ワームの腕を網でつなぎます。0.5ミリリットルの卵緩衝液を塗布してワームを覆います。引っ張った牧草地ピペットを使用して、光のない加湿チャンバーで室温で1〜2時間ワームを回復させます。

過去のピペットで注入された胚を見るための新しいアグロスパッドを準備することから始めます。清潔な顕微鏡スライドに溶融アグロスを3滴垂らし、そのスライドを1枚のラベリング層で包んだ他の2つのスライドの間に置きます。テープテープはパッドの厚さを制御します。

次に、きれいな顕微鏡スライドをアグロスドロップに押し下げて、テープスライドの上に置きます。胚がマウントする準備ができるまで、トップスライドを取り外さないでください。次に、20マイクロリットルの卵バッファーをカバーグラスの中央に落とし、注入されたワームをバッファーに移します解剖顕微鏡の下で、外陰部の近くでワームを切り開きます。

26ゲージの皮下注射針を使用して、胚はワームからこぼれ落ちます。次に、イメージングスライドの上部スライドを取り外し、arosパッドを逆さまにして、胚の入ったカバーガラスに下ろします。胚を長期間にわたって画像化する場合は、カバーガラスの端をワセリンで密封して乾燥を防ぎます。

次に、初期段階の胚を見つけるために10倍対物レンズの下の胚を見つけることからイメージングを開始し、母体の減数分裂を完了する過程にある胚を検索します。筋腫胚は、短縮されていないため、後の胚と区別できます。減数分裂が完了した後、細胞膜と胚の前端の卵殻との間に大きな隙間ができます。

適切に病期分類された胚が特定されたら、胚形成を記録するために高倍率レンズに移動します。この胚は、Mチェリーヒストン、2つのBおよびGFPユビキチンタグ付きタンパク質の両方を発現します。母方と父方のDNAは、MチェリーH2Bを介して見えるため、初期発達の段階を示しています。

この胚にOC Tracker blueを注入し、GFPユビキチンを発現しています。画像は、63 x 1.4 NAレンズを使用して収集され、4 つのレーザーと 88 および 5 つの 55 レーザーが最小出力と最大ゲインに設定されました。通常、ザックは、光退色が発生する前に、最大60の時点で10〜15秒ごとに収集されます。

このTimeLapseビデオでは、タイムラプスを実行しながら、Zスタックを最大投影画像に折りたたまれました。顕微鏡胚は、筋症2を完了してから数分以内、および20分以内に前核遊走を開始する必要があります。最初の細胞質分裂が始まるはずです。

胚の発育が止まっていることが観察された場合は、レーザー強度を下げてみるか、厚手のオーグラスパッドパッドを使用してください。