ブロモデオキシウリジン（BrdU）標識と溶存有機の文化に依存しない識別に対する後続の蛍光活性化細胞選別カーボン分解Bacterioplankton

微生物は、水圏環境におけるラシンなどの多くの溶存有機炭素基質またはDOC化合物の分解を媒介します。DOC変換における微生物の役割を完全に理解するためには、その分類学的同定と機能の同定を同時に行う必要があります。本ビデオでは、水圏環境において特定のDOCプールを変換する遊離細菌または細菌プランクトンの分類学的同定の手順を解説します。

試験環境から採取した水サンプルを処理し、目的化合物およびブロモデオキシウリジン（BRDU）と共にインキュベートします。BRDUは、新たに合成されたDNAおよび活発に増殖している細胞に取り込まれます。次に、BRDU標識された細菌プランクトンを、ZI接合抗BRDU抗体で標識します。BRDU標識レベルの高い細菌プランクトンを、蛍光活性化細胞選別法によって分離します。

その後、分取した細胞からDNAを抽出し、PCR法に基づく16sリボソームRNA遺伝子解析の結果に基づいて分類学的同定を行います。こんにちは、ケント州立大学生物科学科のChen Mao博士の研究室に所属するSteven Robbinsです。本日は、水圏環境におけるDOC分解細菌プランクトンを同定するための、培養に依存しない手法をご紹介します。

この手法の既存の方法（栄養塩添加後の細菌コミュニティDNA解析など）に対する主な利点は、非常に活性の高い細菌に解析を集中させ、休眠状態や増殖速度の遅い細胞を除外できる点にあります。ここでは、特定のDOC化合物を利用するプランクトン細菌の同定方法を示します。ただし、この方法は、他の単一のDOC化合物や、藻類浸出物などのDOCグループを利用するプランクトン細菌の研究にも適用可能です。

それでは、水サンプルを用意して始めましょう。DOC分解細菌プランクトンの分析を行う前に、水サンプルを適切に処理する必要があります。ここに示されているサンプルはジョージア州の沿岸で採取されたもので、水サンプルから大きな粒子やER VREsを除去します。

ペリスタルティックポンプを使用して、回収カーボーイから孔径 1 µm のフィルターを備えたろ過ユニットに水を移します。次に、ろ液を 36 mL ずつ 3 本の滅菌済み 50 mL ポリプロピレンチューブに分注します。各チューブには、調製直後の 10% パラホルムアルデヒド溶液を 4 mL ずつ含ませます。培養後の細胞を保存するため、室温で 2 時間インキュベートします。

0.22 µmの孔径を持つ白色メンブレンフィルターを備えたガラス製真空ろ過ユニットのろ過タワーに水を注ぎ、真空をかけて溶液をろ過します。真空フィルターを用いて10 mLのPBSを流し、フィルターを洗浄します。これらのフィルターにネガティブコントロールとしてラベルを貼り、-20 °Cで保存します。

実験的な生態系またはマイクロコスムを構築するために、まず、あらかじめすすぎを行った1リットルのガラスフラスコ6本に、あらかじめろ過した水試料を800 millilitersずつ満たします。各マイクロコスムに、最終濃度が10 micromolarになるようにBRDUを添加します。フラスコを手で素早く回転させ、混合してください。

各サンプルは3連で分析します。そのため、3つのマイクロコスムにモデルDOC化合物を添加します。ここでは、最終濃度が100 nanomolarになるようにラインをマイクロコスムに添加します。

次に、残りの3つのマイクロコスモスに滅菌PBSを加えます。これらは非DOCコントロールとして機能します。すべてのマイクロコスモスを、in situ温度である25 °Cに設定し、暗所にある100 RPMの振盪インキュベーターに入れます。ここで、0、8、16、および24時間の時点でサンプリングを行います。

各マイクロコスモスから36 mLを、4 mLの新鮮な10%パラホルムアルデヒドを含む50 mLの滅菌ポリプロピレンチューブに回収し、室温で2時間インキュベートして細胞を固定します。次に、保存された細胞を孔径0.22 µmの白色メンブレンフィルターでろ過します。真空フィルターを通して10 mLのPBSを加え、PFAの残留物を洗浄します。

直ちにINS in situ免疫検出に進むか、細菌プランクトンのBRDU取り込みを測定する場合は、フィルターを-20 °Cで保存します。まず、細菌の細胞壁を破壊するため、サンプルフィルターを室温に戻します。フィルターをろ過ユニットに設置し、1 mLのリゾチーム溶液をフィルター上にピペットで滴下して細胞を覆い、室温で30分間インキュベートします。

インキュベーション後、真空吸引して溶液を除去します。溶液がフィルターを通過したら、10 millilitersのPBSを加えて細胞を洗浄し、再び真空吸引を行います。次に、細胞壁をさらに分解させるため、フィルター上の細胞を覆うように1 milliliterのproteinase K溶液を加えます。

室温で30分間インキュベートします。PBSで洗浄し、単層のDNAを作成します。フィルター上の細胞を覆うように、エキソヌクレアーゼ溶液を1 mL加えます。

37 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、10 mLのPBSを真空フィルターに通してフィルターを洗浄します。次に、細胞が存在しない部分を取り除くため、フィルターの端を切り取ります。

次に、アルコールで洗浄し乾燥させた表面上で、滅菌ブレードを使用してフィルターを8等分に切り分けます。サンプルごとに8つのフレームシール培養チャンバーが必要となります。フィルターの8分の1を、組み立て済みのフレームシール培養チャンバーにサンプル面を上にして配置します。チャンバーの組み立てが完了したら、Roche Intu cell proliferation kit Plusを使用して、BrdU標識細胞をin situで検出します。

定置手順が完了したら、インキュベーションチャンバーからフィルターセクションを取り出し、滅菌した表面に置きます。滅菌したブレードを用いて、フィルターセクションを小さく切り分けます。切り分けたフィルター片を、1 mLのPBSが入った2 mLマイクロ遠心チューブに移し、チューブの蓋をしっかりと閉め、パラフィルムで封印します。その後、このチューブを振盪インキュベーターに入れ、37 °C、200 RPMで10分間インキュベートします。

インキュベーション後、チューブを固定し、最大速度でボルテックスします。5分間かけて、上清を滅菌済みの15 mLポリプロピレンチューブにピペットで移します。その後、フィルターをPBSで再懸濁し、ボルテックスとインキュベーションの工程をさらに2回繰り返し、その都度、各サンプルの上清を同じ15 mLチューブに回収します。

再懸濁した細胞を4°Cで保存します。サンプルは2日以内に分析する必要があります。最後に、細胞をソートして、BRDU取り込みレベルの高い集団を回収します。

ここでは、BD FACSAria フローサイトメーターおよび対応するソフトウェアを使用します。細胞のソート後、BRDU濃縮集団をアッセイしてその分類学的同一性を決定できます。ソートされた細菌の 16 s リボソームRNA遺伝子を増幅するためのフィルターPCRを行うには、ソートされた細胞を孔径 0.22 µm の白色ポリカーボネートメンブレンフィルターにピペットで滴下し、真空ポンプを作動させます。その後、滅菌済みのブレードを使用して、フィルターの細胞が含まれていない端の部分を切り取ります。

フィルターを各条件用に4等分に切り分け、3本のPCR反応チューブにフィルター片を1枚ずつ、細胞面がチューブの内側に向くように入れます。PCRグレードの水45 µLを加えます。フィルター部分が完全に水に浸かるようにしてください。

次に、Roche illustra pure T ready to go PCRビーズを2個加え、短時間ボルテックスしてビーズを溶解させます。その後、フォワードおよびリバースの16 s ribosomal RNA遺伝子プライマーをそれぞれ2 µLずつ加えます。

増幅阻害剤を吸収させるためにBSAを1 µL添加するか、または水を1 µL添加します。サーマルサイクラーを用いてPCR増幅を行います。推奨されるタッチダウンPCRプログラムは、アニーリング温度を62°Cから52°Cまで1サイクルにつき1°Cずつ段階的に下げ、その後52°Cで15サイクル行う設定です。

臭化物で染色した1%アガロースゲルによる電気泳動でPCR増幅を確認し、ゲルからPCR増幅産物を切り出し、KaiGen cayo quick gel extraction kitを用いて精製します。PCRゲル精製後、同一サンプルの増幅産物を回収します。これにより、精製された16 sリボソームDNA増幅産物が、さまざまな分子解析に使用可能な状態になります。

ジョージア州の沿岸地域からサンプルを採取し、本ビデオで説明する手順に従って、ラシン分解菌を研究するための処理を行いました。ラシンは海洋環境に遍在するポリアミン化合物であり、ここで示すように、海洋細菌にとっての栄養源およびエネルギー源となり得ます。

サンプルのデータ解析により、24時間の培養後、Racine添加マイクロコスムにおいて、FXI蛍光強度がより高く、それがBRDU取り込み量と正の相関を示す細菌群が出現したことが明らかになりました。これらの細胞は、高BRDU取り込み細胞（HI）と定義され、主にRacine分解菌を含んでいると考えられました。HIは認められませんでした。

添加物なしのコントロールにおいても細胞が検出されましたが、これらはBRDUの取り込みレベルが低い細胞（lii細胞と称される）のみを含んでいました。これらには、利用可能な資源を利用できなかった細菌プランクトンが主に含まれていると考えられました。回収したRacine HI細胞を個別のチューブに分取し、メンブレンフィルターでろ過・回収しました。フィルターPCR後に16SリボソームRNA遺伝子の部分増幅産物を取得し、ゲル電気泳動により確認しました。

分取フィルターの後、分取された細胞間の機能的多様性を調べるために、機能性遺伝子のPCR増幅を行うことも可能です。ここでは、蛍光活性化細胞分取（FACS）とBrdU取り込みを組み合わせた手法を用いて、水圏環境における機能的な細菌細胞を物理的に分離し、同定する方法を説明しました。BrdUは有害であるため、この手順を行う際は常にラボコートと手袋を着用してください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。