Name: ReAsH /フラッシュラベルと細胞におけるテトラセンサータンパク質の画像解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 学ぶReAsH/FlAsHフラッシュラベル法でテトラシステインタグ付きタンパク質を標識し、共焦点顕微鏡とImageJを用いて生細胞内での結合を定量的に解析する方法。この技術はタンパク質の立体構造変化やオリゴマー状態を追跡するセンサー開発に応用可能です。

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この作品は、DMHとTDM（NHMRCプロジェクトの助成金）への補助金によって賄われていた。 DMHはMiegunyahトラストが資金提供グリムフェロー、です。

1。 ReAsH / Flashで標識化するための細胞の調製<ol><li>興味のある細胞株の標準的な細胞培養法を用いて、直接トランスフェクションのための準備ができて、ライブセルイメージングのスライドでの付着細胞の培養物を準備。 </li><li>好みのトランスフェクション法にしたがって目的のプラスミドを含むTC -タグ付き遺伝子をトランスフェクション。 </li></ol>それは、TCのタグに特異的結合の程度を評価すると共焦点顕微鏡写真を収集し、チャネル間の蛍光のbleedthroughのために評価するために、ポジティブとネガティブコントロールを使用することが重要です。したがって、2つの色（例：Flash /チェリーまたはReAsH / CFPまたはReAsH / GFPの組み合わせ）のために、サンプルは、単一の色（例えば蛍光タンパク質単独で、または、可能であれば無蛍光灯とフラッシュ/ ReAsHだけにバインドされているTC -タグ融合タンパク質のために用意されていることを確認蛋白質） <ol start="3"><li> 1〜2日間トランスフェクション後、静かに300μL予め温めておいた（37℃）HBSSで細胞をリンス。 </li><li>優しく温めておいたHBSSと10μMの1,2 - エタンジチオール（EDT）300μlで1μMのフラッシュ（またはReAsH）で細胞を浸す。 </li></ol>細胞にそれを追加するには、Flash / ReAsHを追加する前に、EDTを追加し、直前にバッファを作成することが重要です。 37℃で正確に30分間インキュベート組織培養インキュベーターでCを。我々の経験より長いインキュベーション時間が大幅にバックグラウンド蛍光を増加させる。新しい構文はまた時間およびFlash / ReAsH濃度（0.5-2μM）標識に最適化する必要があります。 <ol start="5"><li>静かに細胞から標識溶液を吸引し、300μL温めておいたHBSS + 37℃で15分間では250μM2,3 - dimercaptopropanol（BAL）と交換してください</li><li>穏やかな吸引により溶液を洗浄し、300μL温めておいたHBSSで置き換える取り外します。 </li></ol>我々は、これは非特異的biarsenical色素の蛍光を増大させることを発見したが、この洗浄後、細胞は、（3.2％溶液で15分間）パラホルムアルデヒドで固定してもよい。したがって、私たちは通常、画像の細胞は、室温で生活しています。 （ラベリングの前に細胞を固定がbiarsenical色素の結合を妨げることに注意してください。） 2。イメージング共焦点顕微鏡で細胞<ol><li>共焦点顕微鏡では、画像の個々の蛍光物質（表1参照）のパラメータを設定し、チャネル間の無視bleedthroughがあることを確認してください。これは、蛍光用のそれぞれ異なる蛍光取得の設定に対して、個々の蛍光物質を（コントロールサンプルで）チェックすることによって達成することができます。発光波長範囲を調整することで（これはまた、信号/ノイズを低減することができます）bleedthroughを最小限に抑えることができます。 </li><li>また、サンプル中の最大蛍光は検出器を飽和させないように光電子増倍管の設定を調整します。 （これは、SP2ライカ共焦点でQ - LUTの設定値を用いて検出することができる）。かつて最高のイメージング設定が決定されている、サンプル間のそれらのいずれかを変更しないでください。 </li><li>我々は一般的に使用するその他の設定は、（これらを最適化することができますが）200Hzのスキャン率であり、4行の平均値と1エアリーユニットのピンホール径を収集する。ピンホールの直径は、信号/雑音が問題となる場合、しかし、これは画像の一部失われる可能性が拡大することができます。 </li><li>可能であれば12ビット（またはそれ以上）の形式で共焦点画像を収集する。 12ビットのフォーマットは8ビット（0〜255）より各ピクセルの輝度値（0〜4095）の広いダイナミックレンジをキャプチャします。これは定量的なデータ分析の質を最大にする、最も豊富なデータセットが記録されることを保証するために重要です。 </li><li>蛍光タンパク質のチャンネル（チェリー、GFPまたはCFP）のため、また、全てのサンプルに対してbiarsenical色素のチャンネル（FlashまたはReAsH）の画像を収集する。 </li></ol> 3。データの分析<ol><li>お使いのコンピュータ8日にソフトImageJをインストールします。 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </li><li> ImageJのバージョンが以下のプラグインを持っていることを確認してください： <ul><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html</a> </li></ul></li><li>オープンImageJの、そしてv1.32cよりも古いバージョンを使用している場合は、複数の画像を一度に（別のファイルをクリックしながらコントロールのボタンを押しながら行うことができる）で開くことができるようにするには、次のオプションをクリックしてください： <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"></li><li> ImageJの関心の画像を開きます。 ImageJは自動的に別々にそれぞれの画像の画面上に表示される最大値と最小値の画素の強度を定義します。別の画像は、dがあることを考えるとifferentピクセルの強度、これは見たときに表示される画像は比較できないことを意味します。 </li><li>開かれたイメージが同じスケールですべてであることを保証するためには、物理​​的に（いくつかの他のソフトウェアの場合のように、これは画像の実際のデータの内容は変更されません）見られるように、上下のピクセルの強度を定義することができます。これらの値は、以下のメニューで設定することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"></li><li>別のアプローチは、一つのファイルにまとめ、すべての画像を置くと自動的に同じスケールに（表示用）スタック内のすべての画像を拡大縮小されるスタックで動作するようです。データを操作する最も簡単な方法は、スタックの各チャンネルに変換することです。このように、蛍光タンパク質のチャネルに示すようにスタックにすべて変換します。あなたは簡単にタイトルに共通の名前（例えば"CH00"）を含むすべての画像を積み重ねることによって片方のチャンネルを選択することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"></li><li>今分析のために8ビットに開いているすべての画像を変換する。これは実際には0〜255の範囲（8ビットを定義します）に表示範囲を再スケーリングされます。 重要 ：オリジナルの12ビット（またはそれ以上）の形式上の保存するか、またはあなたが情報の内容を失うことにしないでください。このフォーマットは、数字などを作るのに便利ですので、一部のソフトウェアパッケージが唯一の8ビット画像を表示できることに注意してください <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"></li><li> "8ビットの変換""名前を付けて保存..."オプションを使用して、という名前の新しいフォルダにコピーを保存します。 </li><li>画像全体にbiarsenical色素の結合の程度を調べるために一つの方法は、ピクセル輝度の相関プロットを実行することです。これはプロット番目のチャネルの対応するピクセル値に対する相対的な一つのチャネル内のすべてのピクセル値を。結合高がある場合したがって、CFPの蛍光の高画素の位置はまたReAsH蛍光に高くなります。 </li><li>共同相関ピクセルを解析するために、8ビットのReAsHとセルリアン/ GFP画像はImageJので開いていることを確認してください。 </li><li>以下に示すように、"画像相関器"プラグインを開きます。 ReAsHまたはFlashスタックと蛍光タンパク質のスタックとして"画像2"として"画像1"を選択します。 <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"></li><li>結果としてスタックは詳細情報が表示されないことがあります - これは正常です。 "散布図"と呼ばれる新しいフォルダにスタックを保存し、それが参照するサンプルと同じファイル名を（例えば、"FLASH -桜の相関プロット"）与える</li><li>意味のあるデータを表示するには、2つのオプションのいずれかを行うことができます。最初にログの形式になるようにデータを変換する。その後、視覚的に次のようにデータを再スケーリング： <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step6.jpg" alt="図6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図6"></li><li>また、あなただけの低い値（例えば1〜255）を表示し、特別なLUTを使用してデータを表示するために視覚的にデータを再スケーリングすることができます。LUT（ルックアップテーブル）イメージの各ピクセル値に割り当てられている色のテーブルを表します。これは、画像の擬似カラースキームを定義するために使用し、画像内の特定の機能を定義する場合に便利ですできます。 "LUTエディタ"上のカスタムLUTをクリックして作成すると示されているもの（これを保存して後で使うことができます）などの新しいものを作る。 <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step7.jpg" alt="図7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図7"></li><li> 0から255までの明るさ/コントラストの範囲を（上記の手順13で説明）を設定します。画面上に示されているのようにイメージ"でロックする"ために、画像は各ピクセルの赤、緑、青の各8ビットの値を保存RGBフォーマットに変換することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step8.jpg" alt="図8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図8"> 他のプログラムへ画像をコピー＆ペーストするには、最初の8ビットまたは16ビットの画像を開きます。上記の手順14で説明したように、画像のLUTのカラースキームを割り当てます。 CFPについては、下記のように"シアン"LUTを割り当てる... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step9.jpg" alt="図9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図9"></li><li>イメージを選択し、クリップボードにコピーする、を選択... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step10.jpg"></li></ol> 4。代表的な結果： biarsenical色素で標識する細胞の成功は、いくつかの重要なパラメータに依存しています。最初に、染料でラベルのタイミングが重要です。我々は発見したそのラベルの長時間（30分以上）非特異的バックグラウンド染色の高レベルの結果。図1は、以前に7を説明するようにTCのタグを含むCFP派生セルリアンに融合したハンチンチン断片（25Q）の野生型形態の典型的な結果を示しています。このサンプルはReAsHで30分間染色し、最小限の背景には、TCタグを欠く試料に存在した。我々は、メタノールで固定しながらパラホルムアルデヒドの増加の背景を持つ細胞を固定する蛍光タンパク質タグの蛍光をabrogatesことを発見した。したがって、可能であれば、細胞が生きる我々がイメージ。また、その前固定に注意することが重要ですbiarsenical色素で標識することはおそらくTCモチーフの変更にともなってそれらの結合を防ぎます。 一貫性のある結果を得るためのもう一つの重要な要素は、細胞の密度です。我々は、大まかに大規模な塊が別々のセルにbiarsenical染料の不均一な染色につながることも、分散している画像の細胞にそれが重大な発見した。 <img src="/files/ftp_upload/2857/2857fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。テトラタグとハンチンチン（exon1 - 25Q） -セルリアン融合でトランスフェクトした生細胞におけるReAsH染色。 TCタグは、ハンチンチン-セルリアン融合（7に記載のように）の合流点に位置しています。ピクセル強度の相関プロットは、セル全体結合ReAsHの違いにアセスメントを可能にし、コンホメーション変化またはリガンドの相互作用による結合ReAsHの変化をマッピングするために使用することができます。

<ol><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li>
<li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li>
<li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li>
<li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li>
<li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li>
<li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li>
<li>Abramoff, M. agelhaes, PJ, S. J. R. am <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fluor%22%5BJournal%5D)">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li>
<li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo%3A+Synthesis+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

第二の色素と蛍光タンパク質とコンホメーション特性を持つラベルのタンパク質局在化へのアプローチは、タンパク質の異なるコンフォメーションは、細胞やタンパク質の立体構造のダイナミクスを変更するイベントに積算どこにマッピングするための多くの潜在的な提供しています。 ReAsH /フラッシュは、最初の哺乳類細胞内レチノイン酸結合タンパク質I 4のタンパク質の折り畳みのために、セルセンサーとして使用されていました。この例では、細胞内レチノイン酸結合タンパク質に設計TCのタグにバインドされているFlashは、私が展開したフォームからの相対折り畳まれた形の蛍光収率を減少していた、と折りたたみはE.で追跡することができます大腸菌細胞。さらに最近ではタンパク質の折りたたみと自己会合は、二部テトラのディスプレイ6で、モデル蛋白質で実証された。この例では、モデルペプチド上遠位dicysteine​​ペアはdicysteine​​のペアを含む2つのペプチドの、または結合biarsenical染料のために機能的なテトラのモチーフを再構成するペプチドの折り畳みによって結合時に近接に持ち込...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> μ-スライド8ウェル</td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td>我々は、これらのチャンバは、イメージングのための細胞を培養するために特に有用であるとスライド見つける。 </td></tr><tr><td>キット*緑色蛍光* *生細胞イメージングのためのTC - FLASH IIセル内のテトラタグ検出</td><td>インビトロジェン</td><td> T34561（フラッシュ）またはT34562（ReAsH） </td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩類溶液</td><td>インビトロジェン</td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3 - ジメルカプト-1 - プロパノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D1129 - 5mlの</td><td></td></tr><tr><td> 1,2 - エタンジチオール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 02390 - 25ML </td><td></td></tr></tbody></table>

reash /フラッシュラベルと細胞におけるテトラセンサータンパク質の画像解析

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

蛍光タンパク質と色素が細胞内のタンパク質輸送、局在化と機能の研究に欠かせないツールです。このような緑色蛍光タンパク質（GFP）等の蛍光タンパク質は広く関心1のタンパク質の特性を追跡するために蛋白質に融合パートナーとして使用されているが、小さなタグと最近の進展は、このようなコンフォメーションの変化などの細胞で検査されるタンパク質の新しい機能を有効にすると蛋白質-関連2、3。一つの小さなタグでも、システムは生細胞に高い特異性と2を遺伝的にbiarsenical染料に結合する標的蛋白質、挿入テトラのモチーフ（CCXXCC）、ReAsH（赤色蛍光）とFLASH（緑色蛍光）を伴います。 TC / biarsenical染料のシステムは、コンフォメーション変化とタンパク質間相互作用4-7測定するためにいくつかの新しいアプローチを有効にしている蛍光タンパク質よりもホストのタンパク質へのはるかに少ない立体制約を提供しています。我々は最近、ハンチントン病7の神経細胞に凝集体を変異変異ハンチンチンを発現する細胞のオリゴマー化のセンサーとして、TCタグの新規な用途を開発した。ハンチンチンは、2つの蛍光色素、一つのタンパク質の場所を追跡するために蛍光タンパク質、及びだけモノマーのbiarsenical色素を結合する第二TCタグでタグ付けされた。したがって、タンパク質とbiarsenical染料の反応性との間の共局在の変化は、空間的に細胞内にマッピングする顕微鏡的オリゴマーのコンテンツを有効にする。ここでは、FlashやReAsH生哺乳動物細胞での方法、および2つの色の蛍光（チェリー/フラッシュ、CFP / / FlashやGFPを定量化すると蛍光タンパク質（チェリー、GFPまたはCFP）に融合されたTC -タグタンパク質を標識する方法について説明します。 ReAsHの組み合わせ）。

biarsenical染料FlashとReAsHは、タンパク質のテトラモチーフに特異的に結合し、選択的に生細胞内のタンパク質にラベルを付けることができます。最近このラベリング戦略は、異なるタンパク質のコンフォメーションまたはオリゴマー状態のセンサーを開発するために使用されています。我々は、定量的に結合分析するためにラベルをつける方法とメソッドを説明します。

ReAsH /フラッシュラベルと細胞におけるテトラセンサータンパク質の画像解析

蛍光タンパク質と蛍光色素は、細胞内におけるタンパク質の輸送、局在、および機能の研究に不可欠なツールである。蛍光タンパク質は……

この手順の全体的な目的は、テトラシステインおよび蛍光タグ付きタンパク質を発現している細胞を、色素 flash または ash で標識し、その結果を定量的に分析することです。これは、まず蛍光タンパク質とテトラシステインタグを含む標的タンパク質を搭載したプラスミドを、目的の細胞株に導入することで達成されます。次に、発現したタンパク質を R または flash で標識し、BAL で洗浄して非特異的に結合した色素を除去し、顕微鏡イメージングの準備を整えます。次に、共焦点顕微鏡を用いて、ashまたはflashおよび蛍光タンパク質のチャネルで細胞の蛍光画像を収集します。最後に、Image Jを使用して画像を解析し、標的タンパク質へのashまたはflashの結合量を定量化します。最終的に、ashの蛍光と蛍光タンパク質の蛍光の相関関係を通じて、細胞内における標的タンパク質へのashまたはflashの結合度を示す結果を得ることができます。単に標的タンパク質をGFPで標識するなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、局在に加えて、タンパク質の構造変化などの第二の特性を追跡できる点にあります。この手法は、タンパク質の微細構造および機能の分野における重要な問い、例えば、TACの結合または解離能を変化させる構造変化やリガンド結合イベントなどの解明に役立ちます。我々がこの手法を考案したのは、細胞内で形成されるハンチントンタンパク質の微小な多量体がどのように形成されるかを評価したいと考えた時でした。データ解析の手順は技術的に複雑であり習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。実験手順のデモンストレーションを行います。ステップ1から3までは、当研究室のリサーチアシスタントであるYasmin Ransonがデータ解析を実演します。ステップ4は、当研究室の大学院生であるSevki GaNが担当します。対象となる細胞株に標準的な細胞培養法を用い、トランスフェクション準備済みの生細胞イメージングスライドを用意してください。目的のTCタグ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションした、接着細胞の培養液を準備します。選択したトランスフェクション法に従い、TCタグへの特異的結合の程度を評価し、また共焦点顕微鏡像を撮影する際のチャンネル間の蛍光漏れ（ブリードスルー）を確認するために、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを設けることが重要です。したがって、2色で観察する場合は、蛍光タンパク質のみ、および可能であればTCタグタンパク質のみなど、単色用のサンプルを必ず準備してください。ただし、蛍光タンパク質は含めません。トランスフェクションの1〜2日後、細胞を300 µLの予温したHank's平衡塩溶液（HBSS）で穏やかに洗浄します。10 µMの1,2-エタンジチオール（EDT）と1 µMのASHを含む、新鮮な予温HBSSを準備します。細胞からHBSSを除去した後、300 µLのASH培地を穏やかに加え、組織培養インキュベーター内で37 °Cで正確に30分間インキュベートします。我々の経験では、インキュベーション時間を長くすると背景蛍光が著しく増加します。細胞から標識溶液を緩やかに吸引して除去し、250 micromolarのtwo three dimer、cap propanol、またはBALを含む予熱したHBSS 300 microlitersに置換し、37 degrees Celsiusで15分間インキュベートします。洗浄液を緩やかに吸引して除去し、予熱したHBSS 300 microlitersに置換します。この洗浄の後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定することも可能ですが、これにより非特異的な背景蛍光が増加することが分かりました。そのため、通常は室温で生細胞をイメージングします。さらに、ラベル化前の細胞固定は、Bial染料の結合を妨げます。共焦点顕微鏡で細胞のイメージングを開始するには、個々の蛍光色素のイメージングパラメータを設定し、チャンネル間のブリードスルーが無視できる程度であることを確認してください。次に、サンプルの最大蛍光強度が検出器を飽和させないように、光電子増倍管の設定を調整します。最適なイメージング設定が決定したら、サンプル間でそれらの設定を変更しないでください。スキャン速度を200 hertzに設定し、4回のライン平均を収集し、ピンホール径を1 area unitに設定します。S/N比に問題がある場合は、ピンホール径を広げることができます。ただし、これによりイメージング解像度が低下する可能性があります。可能であれば、12ビット以上のフォーマットで共焦点画像を取得してください。これにより、定量データ解析の質を最大限に高めることができます。すべてのサンプルについて、蛍光タンパク質チャネルおよびBI arsenalダイチャネルの画像を取得してください。データの解析には、以下のプラグインを導入したImage Jソフトウェアを使用します。Image Jのバージョンが1.32 Cより古い場合は、以下のオプションをクリックしてください。複数の画像を同時に開けるようにするには、[Edit] ＞ [Options] ＞ [Input/Output] で [Use JFileChooser to open/save] のボックスにチェックを入れます。OKをクリックします。目的の画像を開いてください。画像ごとにピクセル強度が異なるため、Image Jは各画像について画面に表示されるピクセル強度の最大値と最小値を自動的に定義します。これは、表示された画像がそのままの状態では比較できないことを意味します。開いた画像がすべて同じスケールで表示されるように、表示するピクセル強度の上下限を物理的に定義してください。これらの値を設定するには、[画像]を選択し、[明るさ/コントラスト]を調整します。「set」をクリックし、表示する最小値と最大値を定義します。次に、「propagate to all open images」を選択して「okay」をクリックします。あるいは、特定のチャンネルのすべての画像を1つのファイルまたはスタックにまとめて配置してください。次に、Image Jがすべての画像を自動的に同じスケールに調整します。この操作を行うには、[Image]から[Stacks]、[Images to stack]を選択し、各ファイルに共通する名前を入力して、[Use titles as labels]を選択します。[OK]をクリックしてください。解析のために、開いているすべての画像を8ビットに変換します。「Image Type」で「8-bit」を選択すると、表示範囲が0から255の範囲に再スケールされます。情報量も失われるため、元の12ビット以上のフォーマットに上書き保存しないことが重要です。「名前を付けて保存」オプションを使用して、「eight bit converted」という名前の新しいフォルダにコピーを保存します。画像全体におけるbiarzal dye結合の程度を調べる一つの方法は、画素強度相関プロットを作成することです。このプロットでは、一方のチャンネルのすべての画素値を、もう一方のチャンネルの対応する画素値と比較して表示します。したがって、結合度が高い場合、GFP蛍光強度が高いピクセル位置ではash蛍光強度も高くなります。ピクセルの相関を分析するために、8ビットのREA画像とGFP画像がImageJで開かれていることを確認してください。次に、[Plugins]から[Image Correlator]を選択して、画像相関プラグインを開きます。画像ファイルを「Image 1」と「Image 2」にそれぞれ割り当てます。次に「OK」をクリックします。結果として表示されるスタックに詳細情報が表示されない場合がありますが、これは正常な動作です。スタックを scatterplots という名前の新しいフォルダーに保存し、参照しているサンプルと同じファイル名を付けてください。例：Ash GFP Correlation plot。データを表示するには、次の2つのオプションから1つを選択してください。まず、[process]から[math]、[log]、[auto]を選択し、データを対数形式に変換します。次に、データを視覚的にリスケールするため、[image]から[adjust brightness/contrast]をクリックし、[auto]を選択します。次に、低値のみが表示されるようにデータを視覚的にリスケールし、特殊なルックアップテーブル（LUT）を使用してデータを表示し、カスタムLUTを作成します。非常にシンプルなLUTを作成するために、画像のカラー編集LUTをクリックします。左上のピクセルをクリックし、黒を選択してください。次に、その右隣のピクセルを選択し、赤を選択します。次に、3番目のピクセルをクリックし、マウスボタンを押しながら選択範囲を右下のピクセルまでドラッグします。赤色を選択してOKをクリックし、次に白色を選択してOKをクリックします。前述のように、明るさ/コントラストの範囲を0から255に設定し、画像を画面に表示されている状態で固定します。他のプログラムに画像をコピー＆ペーストするために、RGB形式に変換します。まず、前述の手順に従って、8ビットまたは16ビットの画像を開きます。GFP用のLUTカラースキームを画像に割り当ててください。画像をクリックして、グリーンLUT（ルックアップテーブル）を割り当てます。ルックアップテーブルのグリーンを選択してください。最後に、コピーする画像を選択し、クリップボードにコピーします。「編集」から「システムにコピー」を選択します。この図は、GFPおよびTCタグを融合させたキナーゼsockを30分間染色した際の典型的な結果を示しています。HEC 2 9 3細胞を用いたASHの解析において、ASHはTCタグを持つ標的タンパク質に高い親和性で効率的に結合することが示されました。対照的に、本図はGFP融合SARKでありながらTCタグを欠損した対応するコントロールサンプルを示しており、これはTCタグの特異性とバックグラウンド染色のレベルを検証するために不可欠です。この結果は、TCタグを欠く標的タンパク質に対してRHに反応性がないことを示しており、SSH結合におけるTCタグの特異性が裏付けられました。この手順を行う際は、細胞がコンフルエントになり静止状態になるのを避けることが重要です。そうしないと、細胞内でのV結合に影響が及ぶためです。このビデオを視聴することで、データを定量的に分析するための簡便な方法を十分に理解でき、これらの手法を洗練させることで、データ可視化のための独自のIUTSを構築できるでしょう。

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