ReAsH /フラッシュラベルと細胞におけるテトラセンサータンパク質の画像解析

この手順の全体的な目標は、テトラシステインと蛍光タグ付きタンパク質を発現する細胞を色素フラッシュまたは灰分で標識し、結果を定量的に分析することです。これは、まず、蛍光タンパク質とテトラシステインタグを含む標的タンパク質を運ぶプラスミドを目的の細胞株にトランセクトすることによって達成されます。次に、発現したタンパク質をRまたはフラッシュで標識し、BALで洗浄して非特異的に結合した食餌を除去し、顕微鏡イメージングの準備をします。

次に、共焦点顕微鏡を使用して、灰またはフラッシュおよび蛍光タンパク質チャネルを持つ細胞の蛍光画像を収集します。最後に、画像Jを使用して画像を解析し、アッシュまたはフラッシュの標的タンパク質への結合を定量化します。最終的には、灰分蛍光と蛍光タンパク質蛍光の相関関係を通じて、細胞内の標的タンパク質への灰分またはフラッシュ結合の程度を示す結果を得ることができます。

この手法は、単にGFPで標的タンパク質を採取するなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、タンパク質の局在化に加えて、立体配座の変化など、タンパク質の2番目の特性を追跡できることです。この方法は、TACがアッシュやフラッシュを阻害する能力を変化させる化イベント、コンフォメーション変化、LI結合イベントなど、タンパク質の部分構造および機能分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、ハンチントンの小さな超微視的一夫多妻制が細胞内でどのように形成されたかを評価したいと思ったときでした。

この手法の視覚的なデモンストレーションは、技術的に複雑なため、データ分析ステップを学ぶのが難しいため、実験手順を実証することが重要です。ステップ1から3は、当研究室の研究助手であるYasmin Ransonがデータ分析のデモンストレーションを行います。ステップ4は、私たちの研究室の大学院生であるSevki GaNで、目的の細胞株に標準的な細胞培養方法を使用し、トランスフェクションの準備ができているライブセルイメージングスライドを使用します。

目的のTCタグ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションする接着細胞の培養物を調製します。選択したトランスフェクション法によれば、TCタグへの特異的結合の程度を評価するため、また共焦点顕微鏡写真を収集する際にチャネル間のフルエンスの漂白性の流れを評価するために、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを持つことが重要です。したがって、2色の場合、サンプルが単一の色、つまり蛍光タンパク質自体と、可能であれば肉に結合したT ctechタンパク質、または

蛍光タンパク質を含まないもののいずれかであることを確認してください。トランスフェクションの1〜2日後、戦前のハンクバランス塩溶液またはHBSSの300マイクロリットルで細胞を穏やかにすすぎ、10マイクロモル、1、2、et EthanジオールチオールまたはEDT、および1マイクロモルのフラッシュまたは灰で新鮮な予温HBSSを調製します。そして、細胞からHBSSを取り除いた後、300マイクロリットルの灰培地と穏やかに交換し、組織培養インキュベーター内で摂氏37度で正確に30分間インキュベー

私たちの経験では、インキュベーション時間が長くなると、バックグラウンド蛍光が大幅に増加します。細胞から標識溶液を穏やかに吸引し、250マイクロモル、2つの3ダイマー、キャッププロパノール、またはBALを含む300マイクロリットルのプレウォームHBSSと摂氏37度で15分間交換します。穏やかに吸引して洗浄液を取り除き、300マイクロリットルの予熱HBSSと交換します。

この洗浄後、細胞はパラフォームの高さで固定することができますが、これにより非特異的なシニカル蛍光が増加することがわかりました。したがって、通常、細胞は室温で生きている画像をイメージします。さらに、標識前に細胞を固定すると、バイアル色素の結合が防止されます。

共焦点顕微鏡で細胞のイメージングを開始するには、個々の蛍光色素をイメージングするためのパラメーターを設定し、チャネル間のブリードが無視できる程度であることを確認します。次に、サンプル中の最大蛍光が検出器を飽和させないように、光増倍率の設定を調整します。最適なイメージング設定が決定されたら、サンプル間でそれらを変更しないでください。

200ヘルツのスキャンレートを使用し、4つのライン平均を収集し、ピンホールの直径を1つの面積単位に設定します。ピンホールの直径は、信号対雑音比が問題となる場合に拡張できます。ただし、これにより画像の解像度がいくらか失われる可能性があります。

可能であれば、共焦点画像を12ビット以上の形式で収集します。定量データ解析の品質を最大限に高めます。蛍光タンパク質チャンネルと、すべてのサンプルのBIアーセナルダイチャンネルの画像を収集します。

データの解析には、Image Jソフトウェアと以下のプラグインを使用してください。バージョン1.32 Cより前のバージョンのImage Jを使用している場合は、次のオプションをクリックしてください。一度に複数の画像を開くには、編集オプションの入力スラッシュ出力、ボックスをクリックしてjファイル選択ダイアログを使用してスラッシュ共有を開きます。

[OK]をクリックします。目的の画像を開きます。画像Jは、画像ごとにピクセル強度が異なるため、画面に表示される最大ピクセル強度と最小ピクセル強度を個別に自動的に定義します。

これは、表示される画像が表示画像と比較できないことを意味します。開いた画像がすべて同じスケールになるようにするには、表示するピクセルの強度の上限と下限を物理的に定義します。これらの値を設定するには、画像を選択し、明るさ、スラッシュ、コントラストを調整します。

[セット]をクリックし、表示される最小値と最大値を定義します。次に、[開いているすべての画像に反映する]を選択し、[OK]をクリックします。または、特定のチャネルのすべての画像を 1 つのファイルまたはスタックにまとめて配置します。

その後、画像Jはすべての画像を同じスケールに自動的に調整します。これを行うには、[スタックする画像] を選択し、各ファイルに共通する名前を入力し、ラベルとして使用したタイトルを選択します。[OK]をクリックします。

開いているすべての画像を分析のために8ビットに変換します。画像タイプ 8 ビットを選択すると、表示範囲が 0 から 255 の間隔に再スケーリングされます。元の12ビット以上の形式に上書きして保存すると、情報コンテンツが失われますので、保存しないことが重要です。

[名前を付けて保存]オプションを使用して変換された8ビットという新しいフォルダにコピーを保存します。画像全体でバイアルサルダイの結合範囲を調べる方法の1つは、ピクセル強度相関プロットを実行することです。このプロットは、1 つのチャネルのすべてのピクセル値を、2 番目のチャネルの対応するピクセル値に対して相対的に表示します。

したがって、GFP蛍光が高いピクセル位置は、結合性が高い場合、灰分蛍光も高くなります。ピクセル共相関を分析するには、8ビットREAおよびGFP画像が画像J.次に、プラグイン画像相関器を選択して画像相関器プラグインを開きます。画像ファイルを画像 1 と画像 2 に割り当てます。

次に、[OK]をクリックします。結果のスタックには、詳細な情報が表示されない場合があります。これは正常です。

スタックを散布図という新しいフォルダに保存し、参照するサンプルと同じファイル名を付けます。たとえば、灰分GFP相関プロットです。データを表示するには、2 つのオプションのいずれかを選択します。

まず、process math log auto を選択して、データをログ形式に変換します。次に、データを視覚的に再スケールするには、画像をクリックし、明るさを調整し、スラッシュコントラストを選択して、自動を選択します。次に、データを視覚的に再スケーリングして低い値のみを表示し、特別なルックアップテーブルまたはLUTを使用してデータを表示し、カスタムLUTを作成します。

非常にシンプルなLUTの画像カラー編集LUTをクリックします。左上のピクセルをクリックして、黒を選択します。次に、右側の次のピクセルを選択し、赤を選択します。

次に、3番目のピクセルをクリックし、マウスボタンを押したまま、選択範囲を右下のピクセルにドラッグします。赤を選択して[OK]をクリックし、次に白を選択して[OK]をクリックします。前述のように、明るさのスラッシュ コントラスト範囲を 0 から 255 まで選択して、画像を画面に表示されているものに固定します。

RGB形式に変換して、画像をコピーして他のプログラムに貼り付けます。まず、前述のように 8 ビットまたは 16 ビットのイメージを開きます。GFP の画像に LUT カラースキームを割り当てます。

画像をクリックして、緑色のLUTを割り当てます。テーブルを緑色で調べます。最後に、コピーする画像を選択してクリップボードにコピーする この図は、システムへのコピーを編集を選択することで、キナーゼソックス融合、GFP、および30分間染色されたTCタグの典型的な結果を示しています。

HEC 2 9 3細胞に灰分が存在すると、ASHはTCタグを持つ標的タンパク質に高い親和性で効率的に結合するようです。これに対し、この図は、GFPに融合したSARKの対応する対照サンプルを示していますが、TCタグの特異性とバックグラウンド染色レベルの両方を確認するために不可欠なTCタグがありません。この結果から、RHは標的タンパク質との反応性がなく、TCタグが欠如していることが示されており、これはTCタグのSSH結合に対する特異性を示しています。

この手順を試みる際には、細胞内のV結合に影響を与えるため、細胞がコンフルエントで落ち着かないように注意することが重要です。このビデオを見れば、データを定量的に単純に分析する方法を十分に理解し、これらの方法を改良して、データ視覚化のための独自のIUTSを開発できるはずです。