Name: ラット脳スライスにおけるGABA活性化シングルチャネルとトニック電流 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-17T14:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 学ぶパッチクランプ法によるラット海馬脳スライスのGABA活性化シングルチャネル電流とトニック電流の記録方法。シナプス性とエキストラシナプス性GABAAチャネルの違いを解明し、神経興奮性の調節メカニズムを理解する。

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この作品は、スウェーデンの研究評議会、ウプサラ大学、フレとイングリッドThurings財団によって資金を供給された。 ZJはEXODIABと印Svenska Sällskapet用Medicinsk Forskningからポスドクを開催しました。我々は技術支援のためにフランクリーに感謝。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

細胞全体の電流は、セル内のアクティブなチャンネルによって発生する電流のアンサンブルを表します。特定の薬理学及びGABAAチャンネルの塩化物の透過性は、これらのチャネルに関連付けられている電流を識別することが可能となります。シナプスのチャネルとシナプス外チャンネルの強壮剤活性化の活性化の一時的な性質がニューロンに発現するGABAAチャネルのこれら二つの集団間の簡単な差別化が可能になります。しかし、唯一のシングルチャネルの録音では、ある者は、強壮剤電流を生成するチャネル分子の動力学的性質を調べることができます。 100μs以内にアクティブにシナプスのチャネルとは異なり、トニックGABAAチャネルは、GABAが4,7,15,16,17,18が適用される時間から数分の範囲の遅延で活性化されます。その多くのチャネルのプロパティでのチャネルの結果のこの遅延活性化は、全細胞記録を用いて研究することはできません。シングルチャネルレベルでのGABAAチャンネルの異なる亜集団は、機能的及び薬理学的性質を変化させることに基づいて同定することができます。このように、別のパッチクランプ構成が提供するものを活用することにより、それが詳細にニューロンのトニックとシナプス電流を生成するGABA活性化チャネルの分子機能と薬理学を勉強することが可能です。

いくつかのパッチクランプハードウェアとソフトウェアのシステムが利用可能であり、それらはすべて同じ基本的な原理を使って動作する。私たちのラボではAxoclampアンプと我々の実験を記録して分析PClampソフトウェア（Molecular Devices社、米国）を使用します。もう一つの人気ブランドHEKAアンプとソフトウェア（HEKA Elektronik社、ドイツ）です。 マイクロフォージ：ナリシゲMF - 830（日本）; Vibrotome：例：ライカVT1200S（ドイツ）やカムデンインスツルメンツvibrotome（英国）、顕微鏡：ニコンエクリプスE600FN、ウォーターバス、マイクロマニピュレータ：カスタムメイドとナリシゲのマイクロマニピュレーター（日本）、プラー：DMZ -ユニバーサル（ドイツ）またはナリシゲPC - 10（日本）。電極のガラス：GC150F - 15（ハーバード装置、英国）。

ラット脳スライスにおけるgaba活性化シングルチャネルとトニック電流

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

GABAのチャンネルはすべてのニューロンに存在し、両方のシナプスと彼らは相動性および強壮電流を生成するシナプスの外側に配置されて、それぞれ4,5,6,7 GABAチャネルは、五量体GABA開口型塩化物チャンネルです。チャネルのサブユニットは、8家族（α1- 6、β1- 3、γ1- 3、δ、ε、θ、π、ρ）に分類されます。二つのアルファ、二つのベータ版一第3サブユニットは、機能的なチャネル8を形成する。 GABAの全人口を含む研究とサブタイプ特異的GABA活性化、シングルチャネルの分子神経細胞におけるチャネルの研究を組み合わせることで、それが神経細胞の抑制と、それがどのように薬理学的作用物質によって変調さの基本的なメカニズムを理解することが可能となる。 我々は、海馬脳切片で生きているニューロンでGABAチャンネルの機能特性を研究し、シングルチャネルと細胞全体の電流を記録するパッチクランプ法9,10を使用してください。我々は、さらにチャネルが別のGABA濃度、他の薬剤と内と細胞外因子によってどのように影響を受けるか調べる。パッチクランプ法の詳細な理論的および実践的な説明についてはB SakmanとEネーアー10で編集したシングルチャネルの録音を参照してください。

私たちは、GABA活性化単一チャネル電流（GABAAチャネル、GABAA受容体）とそれらが神経細胞で生成シナプスとトニック電流を測定するパッチクランプ技術を使用してください。チャネルの活性化は、健康や​​病気で神経細胞の興奮性を低下させる<sup&gt; 1,2,3,4</sup&gt;。

ラット脳スライスにおけるGABA活性化シングルチャネルとトニック電流

GABAAチャネルはすべてのニューロンに存在し、シナプス内およびシナプス外の両方に位置しており、そこで位相性電流および持続性電流を生成します。

本実験の全体的な目的は、単一分子によって生成されるGABA活性化電流（単一チャネル電流）、およびシナプス内またはシナプス外に位置する特定のチャネル集団による電流を記録することです。まず、ラット脳の海馬スライスを調製し、パッチクランプに使用するピペットを作成します。次に、ピペットを神経細胞膜に装着させます。ギガシールが形成されると、細胞付着パッチクランプ構成が得られます。次に、ピペットに吸引をかけます。細胞膜が破れると、ホールセルパッチクランプ構成が確立されます。シナプス内およびシナプス外のGABAAチャネルを区別する結果が得られます。EMITなどの既存の手法に対するパッチクランプ法の主な利点は、チャネルの機能的特性を研究できる点にあります。パッチクランプ法は、ニューロンの興奮性を決定する要因は何か、またそれがどのように調節・微調整されるかなど、神経科学分野における重要な疑問への回答に寄与します。あらゆる生存細胞が、生存および特殊な細胞機能のためにイオンチャネルの適切な機能に依存しているため、この技術の意義は多くの疾患の治療や診断にまで及びます。本手順のデモンストレーションは、研究室のポストドクトラルフェローであるGiantと、大学院生のYoung Yinが行います。まず、生後16〜22日のWistarラットを斬首して屠殺し、スパチュラを用いて速やかに脳を取り出します。外科用メスを用いて、脳を正中線に沿って切断します。次に、各半球の切断面を下に向け、ワットマンろ紙の上に置きます。試料ディスクにシアノアクリレート系接着剤を1滴落とし、その上に半球の切断面を下にして配置します。その後、氷冷水で満たされたバイブレーターの切削チャンバーに試料ディスクを設置します。CSFを準備します。スライス厚を400 micrometersに設定し、脳の切断を開始します。海馬に到達するまで、脳組織を約two millimetersずつ切除します。次に、海馬スライスをCSFを満たしたガラス製ペトリ皿に入れます。海馬を容易に視認できるように、プレートは黒い背景の上に置きます。次のステップでは、鋭利な手術用メスを用いて、周囲の組織から海馬を分離します。その後、組織を押し出したり引っ張ったりしないように注意してください。切片とA CSF溶液を37 °Cで1時間インキュベートし、その後、実験が終了するまで室温で保持します。パッチピペットにはホウケイ酸ガラスキャピラリーを使用します。自動または手動のピペットプラーを用いてパッチピペットを作製し、ホールセル記録の場合は2～4 MΩ、シングルチャネル記録の場合は8～20 MΩの抵抗値にします。シングルチャネル記録を行う場合は、同じホウケイ酸ガラスを用いてピペットを研磨します。マイクロフォージを使用して白金線上のホウケイ酸ガラスを溶融させ、先端をより滑らかに仕上げます。このようにピペットを研磨することで、コーティングされていないワイヤーの熱や自動プラーの研磨工程で研磨したピペットと比較して、より安定し、抵抗値の高いシールを形成するピペットを作製できます。パッチクランプ装置は、フローティングテーブル上に設置され、ファラデーケージに囲まれた顕微鏡、アンプ、デジタイザー、およびコンピュータで構成されています。これらの装置一式は、一般にパッチクランプリグと呼ばれます。次に、ピペットをピペットホルダーに挿入し、キャップを締めてピペットを固定します。パッチクランプソフトウェアにはP clampを使用します。OC clamp amplifier 200 BをV clampに設定し、ゲインを2、フィルターを2 kHz、保持電位を0 mVに設定します。ピペット内に正圧を作るため、ピペットホルダーに接続されたチューブに取り付けられているマウスピースに空気を吹き込みます。次に、マウスピースとチューブの間のバルブを閉じます。空気が漏れていないことを確認してください。その後、ピペットをバス溶液の中に浸します。ピペット抵抗を測定しているコンピュータ画面には、5 mVのパルス列によって生成されたパルスと、ピペットの抵抗値を示す数値が表示されます。数値が小さいほど、ピペット先端の開口部が大きく、ピペットの口径が大きいことを意味します。アンプのピペットオフセットを調整してゼロにしてください。顕微鏡を10倍または60倍の倍率に設定し、目的の領域を特定します。海馬スライス内でパッチクランプを行うパラメタールニューロンを特定するために、歯状回の顆粒細胞、CA1のパラメタール細胞体領域、およびCA3のパラメタール細胞体領域を、それぞれ明るい帯状の領域として確認します。領域または細胞とピペットの両方が見えるようにピペットの焦点を合わせます。顕微鏡の接眼レンズを覗きながら、粗動マニピュレーターの設定を使用してピペットを対象領域の中央の上に配置し、組織に触れる直前までピペットを下げます。この状態で、マニピュレーターの微動設定を用いて、細胞または領域の中心に向かって非常にゆっくりとピペットを下げます。同時に、コンピューター画面を確認し、ピペットの抵抗値をモニターしてください。ピペットの抵抗が大きくなるまで、ピペットを下げ続けます。バルブを開いてピペット内の正圧を解放します。これにより緩やかな吸引が生じ、ギガシールが自動的に形成されます。ギガシールが形成されない場合は、 previously 正圧をかけたマウスピースに吸引をかけます。これにより、いわゆる細胞付着パッチクランプ構成が得られます。高速および低速の容量補正を調整し、ピペットおよびピペットホルダーからの過渡応答をキャンセルしてください。コンピュータの画面に、平坦な電流トレースが表示されます。GigEの値が高いほど、セルアタッチ型パッチクランプ構成で単一チャネル電流を記録する際の、単一チャネル記録における信号対雑音比（S/N比）が向上します。ゲインを500に設定し、データサンプリングレートを100 microseconds以上に設定してください。次に、電流を記録します。ホールセル記録におけるノイズを最小限に抑えるため、バス溶液の量はスライスがちょうど浸る程度の低く保ってください。ピペット電位を-60 mV、または静止膜電位に近い値に変更します。セル付着構成において、ピペットホルダーに接続されたチューブを介してピペットに吸引をかけます。同時に、コンピュータ画面上の抵抗および容量トランジェントの変化を確認してください。これでセルへのブレイクインが完了します。この状態になると、いわゆるホールセル構成またはホールセルモードになります。ピペット溶液を細胞内部と5〜10分間平衡化させます。その間、直列抵抗の値を追跡してください。電流は細胞膜におけるオープンチャネルの集団によって運ばれます。GABAは細胞膜を通過できないため、GABA活性化単一チャネルを実証するには、ピペット溶液にGABAを添加します。ここでは、歯状回顆粒ニューロンのセルアタッチドパッチにおいて、20 nanomolarのGABA濃度で活性化された単一チャネル電流を示しています。パッチを40 millivolts脱分極させた。チャネルの最大コンダクタンスは44 Picos semensであり、活性化潜時（latency of activation）は2.63 minutesであった。以下に、電流の相性（phasic）および緊張性（tonic）の性質によって、GABA、活性化したシナプス電流およびシナプス外電流を区別する方法の例を示す。チャネル集団を流れる電流を、ラット海馬ニューロンからホールセル電位固定法を用いて記録し、持続的電流および一過性電流を特定した。BAに示すように、歯状回ニューロンに、またBBに示すようにインスリン処理した傍海馬皮質ニューロンに、100 µMのGABAA受容体アンタゴニストSR 9 55 31を投与した。SR 9 55 31はシナプス外チャネルを遮断し、ベースライン電流にシフトを誘導したことで、持続的電流が明らかになった。習得すれば、セルアタッチドパッチ（cell attached patch）の形成から、細胞膜を破ってホールセルパッチ（whole cell patch）を確立させるまでを2分以内に行うことができます。この手順を習得することで、無傷の膵島のような他の組織や、リンパ球などの単離細胞、あるいは培養細胞に対してもパッチクランプ法を適用することが可能になります。

gaba-activated-single-channel-and-tonic-currents-in-rat-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

この報告書は、添付されたシナプス前boutonsを保持する個々の実行可能な神経細胞の機械的な分離のためのテクニックを示しています。...

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

このビデオは、マウスの前頭前野皮質脳スライスにおけるγ-アミノ酪酸(GABA)によって誘発される全細胞電流の記録を示しています。GABAの制御された送達は、シナプス後ニューロンの塩化物チャネルを開き、抑制性シナプス後電流(IPSC)を生成します。これらのIPSCは、GABA濃度が高くなると増加し、シナプス伝達に対するGABAの阻害活性を反映しています。...

マウス脳スライスにおけるGABAパフによる全細胞電流の記録

このビデオは、マウスの急性扁桃体脳スライスを使用して、内側前頭前皮質(mPFC)と扁桃体ニューロンとの間のシナプス接続を解析する手順を示しています。これらのマウスのmPFCニューロンは、蛍光タンパク質に融合したチャネルロドプシンを発現します。チャネルロドプシンは、光の活性化により、mPFCニューロンにおけるイオン流入と活動電位の生成を促進します。その結果、mPFCニューロンは、シナプス後扁桃体ニューロンに結合する神経伝達物質を放出し、シナプス後電流をトリガーして、mPFCと扁桃体の接続性を視覚化するために記録されます。...

扁桃体脳スライスにおけるニューロン経路の可視化とマッピング

このビデオは、内側前頭前野(mPFC)軸索を光遺伝学的に刺激し、LECの錐体ニューロンの応答を記録することにより、外側嗅内皮質(LEC)のシナプス効率を研究する手順を示しています。この方法は、パッチクランプ記録と光刺激によるシナプス活性化を組み合わせて、シナプスの可塑性を研究するものです。...

ラット脳切片におけるシナプスイベントの光遺伝学的刺激と電気生理学的記録

皮質ネットワークは抑制性介在ニューロンの小さいが、多様なセットで制御されます。介在ニューロンの機能的研究は、そのためターゲットを絞った記録や厳密な識別を必要とします。ここで説明するには、単一または細胞内の標識と神経細胞のシナプス結合のペア、事後形態学的および免疫細胞化学分析からホールセル記録を含む組み合わされたアプローチです。...

Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

個体発生時に抑制性GABA作動性シナプスの形成をコーディネイト分子機構はほとんど不明である。これらの過程を研究するために、我々は、機能的なGABA A受容体を発現する安定にトランスフェクトされたヒト胚腎臓293（HEK293）細胞と共に培養した胚性中型有棘GABA作動性ニューロンを組み込んだ共培養モデル系を開発した。...

共培養モデルの組み込みGABA作動性中型有棘ニューロンおよびHEK293細胞における抑制性シナプスの形成を安定的にGABAを表現 A受容体

振動は、基本的なネットワークのプロパティであり、病気や薬物によって調節されます。脳スライス振動を研究することは、制御された条件下で分離されたネットワークの特徴付けを可能にします。プロトコルはCA1のγ振動を誘発するための急性脳切片の調製のために提供されます。...

テタヌス刺激による局所CA1γ振動の発生

薬理学的試薬が全細胞パッチ ・...

脳スライスにおける GABA のパフ アプリケーションによって引き起こされる全細胞の流れ

ここでは、生理・薬理のバインドからの GABAAの受容器のアクティブな化合物を発見するためのプロトコルを提案する.

Γ-アミノ酪酸受容体をモジュレート新規化合物の探索の方法を入力、神経伝達

急性発作モデル、てんかんイベントの基になるメカニズムを研究するために重要です。さらに、てんかんイベント オンデマンドを生成する能力は彼らの開始の基になるイベントの正確なシーケンスを調査する非常に効率的な手法を提供します。ここでは、マウスやヒトの組織に設立された急性...

齧歯動物および人間のティッシュの急性発作活動の生成とオン ・ デマンド開始

本稿は、マウスの水平海馬脳スライスを得るための体系的なプロトコルを説明することを目的としている。この方法論の目的は、穿角経路や苔むした繊維路などの海馬繊維経路の完全性を維持し、デンテート回関連の神経学的プロセスを評価することである。...

マウス脳の水平海馬スライス

学ぶパッチクランプ法によるラット海馬脳スライスのGABA活性化シングルチャネル電流とトニック電流の記録方法。シナプス性とエキストラシナプス性GABAAチャネルの違いを解明し、神経興奮性の調節メカニズムを理解する。

ラット脳スライスにおけるGABA活性化シングルチャネルとトニック電流

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