Name: 原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学ぶ 原子間力顕微鏡による細菌イメージング法。ゼラチン被覆マイカを用いてグラム陰性菌・陽性菌を液体環境で固定し、生細胞の高解像度観察を実現します。

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この研究は、生物環境研究局、米国エネルギー省のとバージニア州の連邦保健研究委員会からの助成金によって後援される。オークリッジ国立研究所は、契約番号DE - AC05 - 00OR22725下で米国エネルギー省のためにUT - Battelle氏、LLCによって管理されます。

1。マイカの準備： <ol><li> AFM顕微鏡（約22 × 30 mm）を合わせて必要なサイズにハサミでマイカを（電子顕微鏡の科学）カット。 </li><li>唯一の滑らかな連続した層が残るまで、外側の層を除去するためにテープを使用して、一般的に開裂し、両側のマイカ、。 </li></ol> 2。ゼラチン溶液の調製： <ol><li>実験室の瓶に100mlの蒸留水を追加。 </li><li>水が沸騰し始めるまで電子レンジでボトルを加熱する。 （電子レンジが使用できない場合は、水をホットプレート上でビーカーで加熱することができます。） </li><li>ゼラチン0.5グラム（シグマG - 6144、G - 2625またはG - 2500）を秤量し、熱い蒸留水に加える。 </li><li>ゆっくりとゼラチンになるまで渦巻き瓶が完全に溶解されています。 </li><li> 60から70℃にゼラチン溶液を冷却</li><li>カット切断されたマイカを浸漬することが可能な小型のビーカー（20ml）に約15 mLを注ぐ。 </li></ol> 3。マイカ塗装： <ol><li>温めたゼラチン溶液に浸すマイカの正方形をしてマイカが（図1a）コーティングであることがすぐにそのような撤回。 </li><li>コー​​ティング後は、（図1b）周囲の空気中で乾燥するためにペーパータオルで、エッジで、すぐにマイカをサポートしています。ゼラチン被覆マイカは、少なくとも2週間に使用することができます。過剰ゼラチン溶液は冷蔵保管し、単純に60から70℃の間にストック溶液を加熱によって約ヶ月間使用できます。ケアは、ゼラチンが再加熱時に沸騰されないように注意する必要があります。 </li></ol> 4。ゼラチンコートされたマイカの取り付け細菌： <ol><li> 800〜4500 rcfで - 細菌培養物のペレットを1 mLの（600nmで1.0 OD 0.5）。細菌によっては、最小のRCFを使用しているペレットは〜5分で細胞なります。 </li><li>フィルタ処理された脱イオン水または緩衝液の同量でペレットを洗浄します。 </li><li>遠心分離によって再び細胞を回収。 </li><li> nanopure脱イオン水または緩衝液の500μLで速やかにペレットを再懸濁する。 （細菌懸濁液が目に見えてAFMイメージングのための細胞の適切な濃度を得るために濁ってしてください。） </li><li>ピペットチップ（図1c）を使用して表面にゼラチン被覆マイカと拡散して細胞懸濁液（10〜20μL）を適用します。ケアは、菌液を適用したり、拡散しながら物理的にピペットの先端をゼラチン表面に触れないように注意してください。 </li><li>表面は10分間休ませ、水または緩衝液（図1 CD）のストリームでリンスすることができます。手順では、サンプルが乾燥して許可されていないことを保証するように注意してください。 </li></ol> 5。代表的な結果： 図2は、ゼラチン被覆マイカ上でマウントされており、AFMによって画像化された細菌細胞の例の画像を示す。我々の研究室では、サンプルは一般的に100μmの走査ヘッドを装備したPicoPlus原子間力顕微鏡を（アジレントテクノロジー、寺院、アリゾナ州）を用いて撮像される。楽器は、0.5から1.0行/秒の走査速度でラインスキャン当たり128から512ピクセルで運営されています一般的に使用されるカンチレバーは、0.01〜0.1 NN / nmの範囲の公称ばね定数とVeeco社の窒化シリコンプローブ（MLCT - AUHW、Veeco社、サンタバーバラ、カリフォルニア州）です。 <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。60〜70 ° C、20 mlのビーカーに入れているの温度でゼラチン。ピンセットを使用すると、新鮮な劈開マイカの正方形は、完全にマイクロ遠心ラック（B）にもたれてペーパータオルの上に直立撤回し、配置された（）ゼラチン中に浸漬されています。細菌サンプルの液滴は、XとY方向（c）の両方のピペットチップマイカと拡散に配置されます。サンプルは、少なくとも10分間雲母表面にインキュベートさせた後、蒸留水の流れでサンプルをすすいでください。固定化がうまくいったら（d）の右パネルに示すように雲母に不透明な点を見ることができます。固定化が成功しなかった場合には、左側のパネルのように雲母の明確な部分を取得します。ゼラチン扱わマイカ上に置かれた液滴の細菌の濃度にマイカスケール上の不透明なスポット。 <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> E.の図2。AFM像大腸菌 。パネル（）で、細胞をゼラチンコートしたマイカ上にマウントされ、0.005 M PBSで画像化。比較のために、ゼラチンコートされたマイカ上に実装し、空中で結像される細菌細胞の画像は、パネル（b）に示されています。セプタムは、液体中に収集された画像ではっきりと表示されますが、のような毛の存在（挿入図（b））で示される以上の解像度は、、空気中で得ることができます。

<ol><li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li>
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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

様々な要因がAFMによる微生物取付けセルおよびイメージングに影響を与える可能性があります。コー​​ティングのために使用されるゼラチンは、雲母が重要です。商業用ゼラチンは、魚、牛、そして豚を含む脊椎動物の数から絶縁されています。起源と処理方法はどちらも細菌の固定化のためのゼラチンの適合性を決定する。多数の情報源とゼラチンのタイプは固定細菌で、その有効性を評価した[1]。二つの最も効果的なゼラチンは、Sigma G - 6144とG - 2625であることがわかった。豚（ブタ）に由来する、これらのゼラチンは、それぞれ、低ブルームと培地のブルームとみなされます。ゼラチン処理基板と研究する細菌の特定の菌株との互換性をテストすることが重要です。重要なのは、牛（ウシ）に由来するゼラチンは、テストされた細菌のいずれかを固定化するのに有効ではなかった。細胞の固定化のための簡単​​なテストでは、試料が水または緩衝液（ステップ4.6の後）で洗浄した後、雲母に乾燥させることが含まれます。細菌が固定化されている場合、曇りの領域が（図1D）が観察されます。表面が曇っていない場合は、すすぎ水の流れは、細菌を除去しています。このテストを実行するとき、ユーザーはまた、...

<table border="1"><tbody><tr><td> の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>シグマ、セントルイス、MO </td><td> G6144、G2625やG2500 </td></tr><tr><td> PicoPlus原子間力顕微鏡</td><td>アジレントテクノロジー、テンペ、アリゾナ州</td><td></td></tr><tr><td> AFMのカンチレバー</td><td> Veeco社、サンタバーバラ、カリフォルニア州</td><td> MLCT - AUHW </td></tr></tbody></table>

原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFMは、イメージングツールを機械的プローブ表面の高分解能（ナノスケール）です。それは化学的にサンプルを治療することなく、液体環境では、画像セルと生体分子への能力を持っています。この目標を達成するために、サンプルが十分にスキャンAFMのカンチレバーの先端によって加えられる力によって除去を防ぐために、取り付け面に付着する必要があります。多くの例では、成功した画像は、取付面へのサンプルの固定化に依存します。最適に、固定化は、代謝プロセスと機能的な属性が損なわれないように、サンプルへの低侵襲である必要があります。ブタ（豚）、ゼラチンでコーティングしたばかりの劈開マイカの表面によって、負に帯電した細菌が表面に固定化することができるとAFMによる液中に撮像。ゼラチン被覆マイカ上の細菌の細胞の固定化は、負に帯電した細菌と正に帯電したゼラチンの間の静電相互作用に起因する可能性が最も高いです。いくつかの要因は、細菌が中断されている液体の化学成分、ゼラチンコートされたマイカ上の細菌の培養時間、菌株や菌がイメージングされる媒体の表面特性を含む細菌の固定化、妨げになることがあります。全体的に、ゼラチンコートされたマイカの使用は、イメージングの微生物細胞のための一般的に適用可能であることが判明した。

住んでいるグラム陰性およびグラム陽性細菌は、ゼラチンコートしたマイカ上に固定し、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて液体中に撮像することができます。

AFM（原子間力顕微鏡）は、表面を機械的に走査することで高解像度（nmスケール）の画像を obtain するイメージングツールです。液体中で細胞やバイオ分子をイメージングする能力を備えており...

原子間力顕微鏡（AFM）は、表面を機械的にプローブすることで、試料を化学的に処理することなく高解像度画像を生成します。このビデオでは、細菌をゼラチンコーティングしたマイカ上に固定し、AFMを用いて液体環境下で撮像します。まず、AFM顕微鏡のプラットフォームに適合するようにマイカの正方形を切り出します。次に、マイカの最上層を取り除き、マイカの正方形にゼラチンをコーティングします。次に、細菌懸濁液を1滴、ゼラチンコーティングしたマイカ上に滴下し、広げます。ピペットチップを用いて、サンプルを10分間インキュベートします。その後、表面から未結合の細菌を洗浄して除きます。サンプルをAFMウェットセルに配置し、イメージングを行うことで、生きた細菌の高解像度画像を取得します。ISO多孔質フィルターによる固定などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、桿菌と球菌の両方を確実に固定できることです。また、細胞表面のより広い範囲にAFMプローブを到達させることができます。他の顕微鏡法に対する原子間力顕微鏡の主な利点は、単一細胞の研究が可能であり、細胞形態、隔壁形成、および細胞質分裂の調査を追求できる点にあります。この手法に不慣れな方は、細菌の固定化が証明されていないゼラチンを使用したり、細菌のゼラチン表面への接着を阻害する成分を含む複合培地で培養した細菌を使用したりするため、困難に直面することがあります。私たちはまず、1970年代に行われた細菌固定化の実験から、この手法のアイデアを得ました。光学顕微鏡およびオートラジオグラフィーを用いた実験用のゼラチンコートガラススライドです。このデモンストレーションでは、生きたグラム陰性菌をAFMイメージングのために固定しますが、この手法はグラム陽性菌にも適用可能です。MICAを準備するには、まず、AFM顕微鏡のステージに適合し、AFMウェットセルを設置できるサイズにハサミで切断することから始めてください。次に、MICA表面にセロハンテープを貼り、それを剥がして、切り出したMICA片から外層を剥離させます。滑らかで途切れのない層だけが残るまで、両面から外層の除去を繰り返します。ゼラチン溶液を調製するには、laboratory bottleに蒸留水を100 milliliters加え、電子レンジで加熱します。水が沸騰し始めたら電子レンジから取り出し、0.5 gのゼラチンを加え、ゼラチンが溶解するまでボトルを静かに揺らして膨潤させます。なお、本手順において牛由来のゼラチンは十分な効果が得られないため、豚由来のゼラチンの使用を推奨します。ボトルをベンチトップに置き、60〜70 °Cまで冷却させます。次に、ピンセットを用いてMICAを完全に浸せる十分な量のゼラチン溶液を小型ビーカーに注ぎます。MICA正方形を温めたゼラチン溶液に浸し、直ちに素早く取り出します。MICAをペーパータオルの上に立てかけ、マイクロ遠心機ラックに寄りかからせる形で配置し、室温で一晩乾燥させます。ゼラチンコーティングを施したMICAは、少なくとも2週間使用可能です。ゼラチンコーティングを施したMICAを数週間使用しない場合は、蓋付きのペトリ皿の中のフィルターペーパー上に配置し、室温で保存します。余剰のゼラチン溶液は冷蔵保存が可能であり、ストック溶液を60から70 °Cの間で再加熱することで、約1ヶ月間使用できます。再加熱時にゼラチンを沸騰させないよう注意してください。細菌をゼラチンコーティングされたMICA上に固定する前に、細菌濃度が適切であることを確認してください。分光光度計を用いて、600ナノメートルにおける細菌サンプルの吸光度を測定します。OD値が0.5から1の間であることが最適です。次に、培養液を1 mL採取してマイクロ遠心チューブに移し、遠心分離してペレットを形成させます。ピペットを用いて上清を除去し、1 mLのろ過脱イオン水または緩衝液でペレットを洗浄します。その後、ピペッティングで穏やかに再懸濁します。ペレットを遠心分離し、速やかに再懸濁します。500 µLのNanopure脱イオン水を用いて、FMイメージングに十分な細胞濃度を確保するため、細菌懸濁液が視覚的に濁るまで調整してください。浸透圧ショックが懸念される場合は、イメージング溶液に0.25 molar sucroseを添加してください。今回はこの細菌を水で再懸濁しましたが、他の液体を試すことをためらわないでください。例えば、0.25%sucroseを用いて実施した例もありますので、他の液体でも同様に機能するかどうかを試してみてください。各サンプルにつき2枚のスライドを用意します。マイクロピペッターを使用して、細胞懸濁液 10 〜 20 µL をゼラチンコーティングされた表面に滴下します。次に、FMイメージングに十分なカバー領域を確保するため、マイクロピペッティングチップを用いて液滴をX方向およびY方向に広げます。ピペットチップでゼラチン表面に直接触れないように注意しながら、サンプルを室温で10分間インキュベートします。次に、流水で洗浄し、サンプルの端をペーパータオルまたはろ紙に接触させて過剰な液体を取り除きます。窒素ガスジェットを用いて、スライドの一方を速やかに乾燥させます。次に、スライドを視覚的に確認します。不透明な斑点がある場合は、洗浄ステップで細菌が除去されていなかったことを示しています。もう一方のスライドは、これからイメージングに使用するため、乾燥させないようにしてください。それをAFMウェットステージに設置し、クリップで固定します。マイクロピペットを使用して、ウェットステージに水を加えます。液体中でのイメージングの前に、原子間力顕微鏡を準備しておくことが推奨されます。液体中イメージング用のカンチレバーがAFMに装着され、レーザーと整合していることを確認してください。100 µmのスキャニングヘッドと、公称ばね定数が0.01から0.1 N/nmの範囲であるvico窒化シリコンプローブを備えたpico plus原子間力顕微鏡を用いて、原子間力顕微鏡によるイメージングを行います。顕微鏡の準備が整ったら、FMスキャナーとステージを顕微鏡に挿入します。通常、イメージング速度は0.5 lines/secから1 line/secで開始し、解像度は1ラインあたり128から512データポイントに設定します。装置を、1ラインあたり128から512ピクセルの解像度で画像を収集するように設定します。走査速度を1秒あたり0.5から1ラインに設定してスキャンします。その後、必要に応じてA FMのセットポイントとゲインを調整し、最適な画像を得られるようにします。最後に、画像を収集します。E coli細菌を、本ビデオで説明した通りゼラチンコーティングしたMICA上に固定し、0.005 molar PVS中でイメージングしました。この方法を用いて行います。収集された画像では、Scepterがはっきりと確認でき、細胞表面は滑らかで、脱水症状の兆候は見られません。対照的に、ここに示すように同一のe coliを空気中で撮影した画像では、液体中では見られない構造がしばしば観察されます。この場合、細胞は脱水によりリング状の外観を呈しており、FIAなどの細菌付属器官が確認できます。このビデオを視聴することで、液体環境におけるFMイメージング用の細菌サンプルの調製方法について十分に理解できるはずです。ゼラチンコーティングされたマイクロ表面があらかじめ準備されていれば、この手法を習得すれば約1時間で完了できます。本手順を行う際は、適切なゼラチンを選択し、それに続く手順において細菌を適切な濃度に調整することが重要です。FNカンチレバーを力センシングツールとして使用し、細菌表面の力を測定し続けるなど、その他の測定も可能です。また、特定のプローブ分子をAFMチップに結合させることで、細菌表面の特定の標的と相互作用させ、相互作用力を同定および測定することもできます。一般的に、病原性細菌を扱う場合は、本手法を用いる際に常に十分な注意を払う必要があることを忘れないでください。

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バイオエンジニアリング（生体工学）

プラスミドDNA、細胞質タンパク質、およびDNA...

原子間力顕微鏡を用いて組換えDNAとタンパク質の複合体の可視化

生細胞内の動的タンパク質に関する時空間的な情報は、生物学を理解するために非常に重要です。高速3D構造化照明顕微鏡(f3D-SIM)と呼ばれる超解像顕微鏡の一種は、細菌の細胞動態Zリングに関するユニークな情報、つまりそのビーズ状の外観とリング内のFtsZの急速なダイナミクスの両方を明らかにします。...

高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング

このプロトコルを記述する、heterobifunctional シラン カップリング剤による酸化シリコン薄膜表面の原子間力顕微鏡による単一分子力分光法のために設計するで例示されている蛋白質の共有結合固定化、RrgA の相互作用 (毛 1 先端付着性S.

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面上、バイオチップの無細胞遺伝子発現実験を行うため遺伝子長 DNA...

多段鎖変位リソグラフィーを用いた遺伝子の機能的な面を固定化

我々は、免疫学的研究のための単一のT細胞およびビーズ粒子を用いて原子間力顕微鏡(AFM)片持ちを機能化するプロトコルを提示する。AFMによる単一対T細胞樹状細胞結合をプローブし、蛍光イメージングを用いてAFMによる単一固体粒子に対するマクロファージのリアルタイム細胞応答を監視する手順が示されている。...

免疫学的単一細胞力分光法のための単一T細胞または単一粒子による原子間力顕微鏡片持ちの機能化

このプロトコルは、数百個の微生物細胞のAFM測定を自動化することを目的としています。まず、微生物をPDMSスタンプ微細構造に固定化し、次に何百もの固定化された細胞に対して力分光測定を自動的に行います。...

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

原子間力顕微鏡-赤外線分光法(AFM-IR)は、細菌研究のための強力なプラットフォームを提供し、ナノスケールの分解能を達成することを可能にします。いずれも、細胞内変化(例えば、細胞分裂時)のマッピング、ならびに化学組成の比較研究(例えば、薬剤耐性から生じる)のマッピングは、細菌中の単一細胞レベルで行うことができる。...

単一細菌化学を探るツールとして赤外線分光法と組み合わせた原子間力顕微鏡

ここでは、光学トラップによる直接力測定を用いて、3次元閉じ込めで単離した胚ゼブラフィッシュ細胞の細胞内の機械的特性を調べるプロトコルを提示する。...

光ピンセットを用いた閉じ込めにおける細胞下力学の直接力測定

本研究では、細胞質内に送達される磁気マイクロビーズを介して細胞核に直接力を加え、生細胞蛍光イメージングを同時に行うための新しいプロトコルを提示します。...

3D磁力アクチュエータと多機能蛍光イメージングを組み合わせて核メカノバイオロジーを研究

ここでは、細菌の特性評価のための簡単で迅速な方法としての原子間力顕微鏡(AFM)の応用を紹介し、細菌のサイズと形状、細菌培養バイオフィルム、殺菌剤としてのナノ粒子の活性などの詳細を分析します。...

形態学的観察および細菌細胞損傷解析のための迅速技術としての接触モード原子間力顕微鏡法

我々は、XY平面における糸状シアノバクテリアの可視化のための簡単でアクセスしやすい方法を提示する。低融点のアガロースマトリックスを使用し、垂直方向で分裂に関与するタンパク質の画像を取得できるようにしました。したがって、この方法論は、任意の糸状生物および異なる種類のタンパク質に適用することができる。...

糸状シアノバクテリアのタイムラプス顕微鏡分析のための垂直固定化法

学ぶ 原子間力顕微鏡による細菌イメージング法。ゼラチン被覆マイカを用いてグラム陰性菌・陽性菌を液体環境で固定し、生細胞の高解像度観察を実現します。

原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化

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