原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化

原子間力顕微鏡（AFM）は、表面を機械的にプローブすることで、試料を化学的に処理することなく高解像度画像を生成します。このビデオでは、細菌をゼラチンコーティングしたマイカ上に固定し、AFMを用いて液体環境下で撮像します。まず、AFM顕微鏡のプラットフォームに適合するようにマイカの正方形を切り出します。次に、マイカの最上層を取り除き、マイカの正方形にゼラチンをコーティングします。

次に、細菌懸濁液を1滴、ゼラチンコーティングしたマイカ上に滴下し、広げます。ピペットチップを用いて、サンプルを10分間インキュベートします。その後、表面から未結合の細菌を洗浄して除きます。

サンプルをAFMウェットセルに配置し、イメージングを行うことで、生きた細菌の高解像度画像を取得します。ISO多孔質フィルターによる固定などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、桿菌と球菌の両方を確実に固定できることです。また、細胞表面のより広い範囲にAFMプローブを到達させることができます。

他の顕微鏡法に対する原子間力顕微鏡の主な利点は、単一細胞の研究が可能であり、細胞形態、隔壁形成、および細胞質分裂の調査を追求できる点にあります。この手法に不慣れな方は、細菌の固定化が証明されていないゼラチンを使用したり、細菌のゼラチン表面への接着を阻害する成分を含む複合培地で培養した細菌を使用したりするため、困難に直面することがあります。私たちはまず、1970年代に行われた細菌固定化の実験から、この手法のアイデアを得ました。

光学顕微鏡およびオートラジオグラフィーを用いた実験用のゼラチンコートガラススライドです。このデモンストレーションでは、生きたグラム陰性菌をAFMイメージングのために固定しますが、この手法はグラム陽性菌にも適用可能です。MICAを準備するには、まず、AFM顕微鏡のステージに適合し、AFMウェットセルを設置できるサイズにハサミで切断することから始めてください。

次に、MICA表面にセロハンテープを貼り、それを剥がして、切り出したMICA片から外層を剥離させます。滑らかで途切れのない層だけが残るまで、両面から外層の除去を繰り返します。ゼラチン溶液を調製するには、laboratory bottleに蒸留水を100 milliliters加え、電子レンジで加熱します。

水が沸騰し始めたら電子レンジから取り出し、0.5 gのゼラチンを加え、ゼラチンが溶解するまでボトルを静かに揺らして膨潤させます。なお、本手順において牛由来のゼラチンは十分な効果が得られないため、豚由来のゼラチンの使用を推奨します。

ボトルをベンチトップに置き、60〜70 °Cまで冷却させます。次に、ピンセットを用いてMICAを完全に浸せる十分な量のゼラチン溶液を小型ビーカーに注ぎます。MICA正方形を温めたゼラチン溶液に浸し、直ちに素早く取り出します。

MICAをペーパータオルの上に立てかけ、マイクロ遠心機ラックに寄りかからせる形で配置し、室温で一晩乾燥させます。ゼラチンコーティングを施したMICAは、少なくとも2週間使用可能です。ゼラチンコーティングを施したMICAを数週間使用しない場合は、

蓋付きのペトリ皿の中のフィルターペーパー上に配置し、室温で保存します。余剰のゼラチン溶液は冷蔵保存が可能であり、ストック溶液を60から70 °Cの間で再加熱することで、約1ヶ月間使用できます。再加熱時にゼラチンを沸騰させないよう注意してください。

細菌をゼラチンコーティングされたMICA上に固定する前に、細菌濃度が適切であることを確認してください。分光光度計を用いて、600ナノメートルにおける細菌サンプルの吸光度を測定します。OD値が0.5から1の間であることが最適です。

次に、培養液を1 mL採取してマイクロ遠心チューブに移し、遠心分離してペレットを形成させます。ピペットを用いて上清を除去し、1 mLのろ過脱イオン水または緩衝液でペレットを洗浄します。その後、ピペッティングで穏やかに再懸濁します。

ペレットを遠心分離し、速やかに再懸濁します。500 µLのNanopure脱イオン水を用いて、FMイメージングに十分な細胞濃度を確保するため、細菌懸濁液が視覚的に濁るまで調整してください。

浸透圧ショックが懸念される場合は、イメージング溶液に0.25 molar sucroseを添加してください。今回はこの細菌を水で再懸濁しましたが、他の液体を試すことをためらわないでください。例えば、0.25%sucroseを用いて実施した例もありますので、他の液体でも同様に機能するかどうかを試してみてください。

各サンプルにつき2枚のスライドを用意します。マイクロピペッターを使用して、細胞懸濁液 10 〜 20 µL をゼラチンコーティングされた表面に滴下します。次に、FMイメージングに十分なカバー領域を確保するため、マイクロピペッティングチップを用いて液滴をX方向およびY方向に広げます。

ピペットチップでゼラチン表面に直接触れないように注意しながら、サンプルを室温で10分間インキュベートします。次に、流水で洗浄し、サンプルの端をペーパータオルまたはろ紙に接触させて過剰な液体を取り除きます。窒素ガスジェットを用いて、スライドの一方を速やかに乾燥させます。

次に、スライドを視覚的に確認します。不透明な斑点がある場合は、洗浄ステップで細菌が除去されていなかったことを示しています。もう一方のスライドは、これからイメージングに使用するため、乾燥させないようにしてください。

それをAFMウェットステージに設置し、クリップで固定します。マイクロピペットを使用して、ウェットステージに水を加えます。液体中でのイメージングの前に、原子間力顕微鏡を準備しておくことが推奨されます。液体中イメージング用のカンチレバーがAFMに装着され、レーザーと整合していることを確認してください。

100 µmのスキャニングヘッドと、公称ばね定数が0.01から0.1 N/nmの範囲であるvico窒化シリコンプローブを備えたpico plus原子間力顕微鏡を用いて、原子間力顕微鏡によるイメージングを行います。顕微鏡の準備が整ったら、FMスキャナーとステージを顕微鏡に挿入します。通常、イメージング速度は0.5 lines/secから1 line/secで開始し、解像度は1ラインあたり128から512データポイントに設定します。

装置を、1ラインあたり128から512ピクセルの解像度で画像を収集するように設定します。走査速度を1秒あたり0.5から1ラインに設定してスキャンします。その後、必要に応じてA FMのセットポイントとゲインを調整し、最適な画像を得られるようにします。

最後に、画像を収集します。E coli細菌を、本ビデオで説明した通りゼラチンコーティングしたMICA上に固定し、0.005 molar PVS中でイメージングしました。この方法を用いて行います。

収集された画像では、Scepterがはっきりと確認でき、細胞表面は滑らかで、脱水症状の兆候は見られません。対照的に、ここに示すように同一のe coliを空気中で撮影した画像では、液体中では見られない構造がしばしば観察されます。この場合、細胞は脱水によりリング状の外観を呈しており、FIAなどの細菌付属器官が確認できます。

このビデオを視聴することで、液体環境におけるFMイメージング用の細菌サンプルの調製方法について十分に理解できるはずです。ゼラチンコーティングされたマイクロ表面があらかじめ準備されていれば、この手法を習得すれば約1時間で完了できます。本手順を行う際は、適切なゼラチンを選択し、それに続く手順において細菌を適切な濃度に調整することが重要です。

FNカンチレバーを力センシングツールとして使用し、細菌表面の力を測定し続けるなど、その他の測定も可能です。また、特定のプローブ分子をAFMチップに結合させることで、細菌表面の特定の標的と相互作用させ、相互作用力を同定および測定することもできます。一般的に、病原性細菌を扱う場合は、本手法を用いる際に常に十分な注意を払う必要があることを忘れないでください。